PLoS ONE: en overgangszone Viser Meget syntetiske eller Skiftende Niveauer af Stem Cell og proliferationsmarkører karakteriserer Udvikling af PTEN-Haploinsufficient Colorectal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Trinvis erhvervelse af onkogene mutationer og deletion /inaktivering af tumorsuppressorgener karakterisere udvikling af kolorektal cancer (CRC). Disse genetiske begivenheder interagere med diskrete morfologiske overgange fra hyperplastisk mucosa til adenomatøs områder, efterfulgt af in situ malign transformation og endelig invasiv carcinom. Målet med denne undersøgelse var at identificere væv markører af adenom-karcinom morfogenetiske overgange i CRC.

Metoder og Resultater

Vi analyserede mønstre af udtryk for vækst lovgivningsmæssige og stamceller markører på tværs af disse særskilte morfologisk overgangszoner i 735 primære CRC tumorer. I 202 tilfælde med konserveret adenom-adenocarcinom overgang identificerede vi, i 37,1% af tilfældene, en zone med adenomatøs epitel, ligger umiddelbart op til den invasive komponent, der viste hurtigt vekslende intraglandular strækninger af PTEN + og PTEN- epitel. Denne zone nøjagtigt overlappede med lignende vekslende ekspression af Ki-67 og omvendt med den transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β) vækstregulator Smad4. Disse zoner viser også parallelle vekslende niveauer og /eller subcellulære lokalisering af multiple cancer stamceller /progenitorcelle (CSC) markører, herunder β-catenin /CTNNB1, ALDH1 og CD44. PTEN blev altid igen udtrykt i den invasive tumor i disse tilfælde i modsætning til dem med fuldstændigt tab af PTEN ekspression. Genomisk microarray analyse af CRC med prominente CSC-lignende udvidelser viste en høj frekvens af

PTEN

genomisk sletning /haploinsufficiency i tumorer med CSC-lignende overgangszoner (62,5%), men ikke i tumorer med nedreguleret, men ikke-vekslende PTEN ekspression (14,3%). Der var ingen signifikante forskelle i niveauerne af

KRAS

mutation eller

CTNNB1

mutation i CSC-lignende tumorer i forhold til ikke-valgte CRC sager.

Konklusioner

Afslutningsvis har vi identificeret en karakteristisk CSC-lignende pre-invasiv overgangszone i

PTEN

-haploinsufficient CRC, der viser konvergent on-off regulering af PTEN /AKT, TGF-β /SMAD og Wnt /β catenin pathways. Denne flaskehals-lignende zone normalt efterfulgt af fremkomsten af ​​invasive tumorer med intakt PTEN udtryk, men dysreguleret TP53 og ensartet høj spredning satser

Henvisning:. Arvai KJ, Hsu YH, Lee LA, Jones D (2015) A Transition Zone Viser Meget syntetiske eller Skiftende Niveauer af Stem Cell og proliferationsmarkører karakteriserer Udvikling af

PTEN

-Haploinsufficient kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (6): e0131108. doi: 10,1371 /journal.pone.0131108

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Januar 16, 2015; Accepteret: 28. maj 2015; Udgivet: 22 juni 2015

Copyright: © 2015 Arvai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

finansiering:. Der er ingen aktuelle finansieringskilder til denne undersøgelse. Quest Diagnostics ydet støtte i form af reagenser /materialer og lønninger til alle forfattere, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Den Videnskabelige publikationer ansatte på Quest Diagnostics revideret manuskriptet før indsendelse, med navnene på disse korrekturlæsere anført i bekræftelsen afsnittet, med deres godkendelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Alle forfattere var ansat af Quest Diagnostics på tidspunktet for undersøgelsen, et kommercielt laboratorium, som byder på nogle af de pletter, der er beskrevet som produkter, herunder stamceller markør, Smad4 og PTEN immunhistokemi. En patentansøgning er indgivet på anvendelse af disse analyser til tumor profilering (61/932543, “fremgangsmåder og præparater til Afsløring adenom-Adenocarcinom Transition i tumorer”). Arbejdet præsenteres her blev udført helt på Quest Diagnostics. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Reguleret vækst af epitelet i den normale colon drives af krypt-lokaliseret intestinale stamceller (ISC), som skifter mellem hvilende og proliferative tilstande [1]. Forskydninger i den subcellulære lokalisering af Wnt-associerede beta (β) catenin (

CTNNB1

) kompleks og signalering gennem den transformerende vækstfaktor (TGF) -beta og PTEN /PIK3CA /AKT pathways har vist sig at påvirke ISC cykling [2,3].

Et fænotypisk og funktionelt tilsvarende population af cancer stamceller (CSC) er blevet postuleret at forekomme i kolorektal cancer (CRC) og andre tumorer [4,5]. CSCS er blevet postuleret at dukke op i CRC på de tidligste stadier af forvandling [6], eventuelt korrelerer med forandring beskrives som afvigende crypt foci [7]. Men senere stadier af tumor progression i CRC er blevet hyppigere modelleret som trinvise overgange fra hyperplastiske slimhindeforandringer til adenomatøs områder (AD), derefter in situ malign transformation og endelig invasiv adenokarcinom (ACA) [8,9]. I dette skema, stigende spredning satser og genetisk ustabilitet føre til gradvist mere fejlreguleret og vækstfaktor-uafhængig vækst. Til dato, forene diskontinuerlige model for spredning og hvile, der ligger til grund for CSC model med den trinvise evolutionære model af hyperplasi-adenom-carcinom serien stadig problematisk [10].

Her viser vi, ved hjælp af en stor serie af primære CRC tilfælde, at i godt orienteret vævssnit, mange kolon tumorer viser et klart adskilt zone af hurtigt skiftende proliferativ og hypoproliferative colon epitel hvor mange ISC /CSC markører er også moduleres parallelt. Denne overgangszonen, hvilket sandsynligvis overgroet af den invasive komponent i nogle tumorer, fremhæver en kritisk zone af ændret signalering på invasive grænse i CRC.

Metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev gennemgået og godkendt af den vestlige institutionelle review board (IRB) under protokol 2014-003, fornyet 2014/12/31. Kliniske prøver anvendte var overskydende /kasserede prøver, der blev anonyme før inklusion i studiet uden at identificere patientinformation bevares og anses fritaget med afkald på informeret samtykke.

Case udvælgelse og immunhistokemi

Cases omfatter primære CRC tilfælde, der forelægges Quest Diagnostics Nichols Institute for molekylær eller immunofænotypeanalyse fra november 2011 og november 2013. sager inkluderet var et tilfældigt udvalg af primære kolon tumorer med tilstrækkelige formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) vævssnit. Funktionerne i morfologiske overgange blev optaget med hæmatoxylin og eosin (HE) farvede objektglas for hvert enkelt tilfælde:. Fra normal til hyperplastisk slimhinde, hyperplastiske til adenomatøs forandring, og adenomatøs ændring in situ og invasive adenokarcinom

Immunhistokemi blev udført den 4.-um FFPE sektioner ved hjælp af Bond Max III (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland), Ultra Benchmark (Ventana, Tucson, AZ), og Link (Dako, Carpinteria, CA) automatiserede farvning platforme, med epitopgenfinding udført på-instrument for Leica (epitop Retrieval Solution 2, pH 9,0 puffer) og Ventana (Cell Conditioner 1, pH 9,0-buffer) og offline for Dako platform (TRS, pH 9,0 puffer i 40 minutter). Antistof-kloner og arbejder fortyndinger er angivet i S1 tabel. Specificiteten af ​​PTEN (6H2) og Smad4 (B-4) antistof-kloner anvendt tidligere er blevet udførligt valideret i væv og transfektanter anvendelse af Western-blot og andre teknikker [11, 12]. PTEN antistofspecificitet blev yderligere demonstreret ved fraværende ekspression ved Western blot-analyse af cellelysater og FFPE afsnit af

PTEN

-null cellelinier CEM og Jurkat [13]. En peroxidase blok blev anvendt på alle objektglas før antistof ansøgning. Primære antistofinkubationer var ved stuetemperatur i 12-32 minutter, med detektion ved anvendelse af 3,3-diaminobenzidin (DAB) (herunder Bond Polymer Tilpas til Leica, UltraView DAB for Ventana og Envision for Dako). Slides blev modfarvet med hæmatoxylin og post-modfarvet med blånelse.

Immunostains blev scoret semi-kvantitativt ved to af forfatterne (KA, DJ), med billeder taget med Aperio XT slide scanner for at lette billedoverlejringer og vurdere subcellulære plet lokalisering. For Ki-67, blev de mønstre og antal celler med stærke kernekraft positivitet registreret. PTEN farvning blev scoret som uniform /normal i tumor; nedreguleret i tumor i forhold til tilstødende normale colon; komplet /zonal tab af farvning i hele eller en del af tumorerne; eller som værende i en multifokal skiftende mønster med områder af tab sammenstillet siden af ​​tumorceller med et normalt mønster. For andre markører, herunder ALDH1, β-catenin, CD44, EZH2, MGMT P53, p-SMAD (1/5/8), og Smad4, blev farvningsintensitet vurderes på tværs af tumoren i forhold til ikke-neoplastisk epitel og /eller blandet lymfocytter, samt subcellulære lokalisering (nukleare, cytoplasmatisk, membran eller kombinationer).

Lysstofrør

in situ

hybridisering (FISH)

glas dias indeholdende 4-um FFPE snit blev bagt ved 56 ° C natten over, derefter afvokset og rehydreret under anvendelse xylen og ethanol. Objektglas blev behandlet under anvendelse af 0,2 N HCI, formalin, forbehandling puffervask, og protease før tilsætning af FISH-proben. Prøver blev derefter co-denatureret ved 72 ° C i 5 minutter og fik lov at hybridisere natten over (14-18 timer) i et fugtighedskammer indstillet til 37 ° C. Slides blev undersøgt ved hjælp af en CL

PTEN /* Grid1

3-farve sletning probe (MetaSystems, D-5971-100-TC).

PTEN

locus-specifik probe er mærket med orange på en 315 kb region på kromosom band 10q23.3. Yderligere sonder i cocktail inkluderet et locus-specifik probe for

* Grid1

placeret på kromosom 10q23.2 band, mærket med grønt, og en probe til centromerregionen kontrolområdet (10p11.1-q11.1) mærket blå.

Slides blev vurderet for

PTEN

sletning ved at tælle 30 tumorceller i ACA og Ad-ACA overgangszonen (hvis tilgængelig) og sammenligne antallet af

PTEN

signaler til hver af de to kontrol regioner på

PTEN /* Grid1

sonde (dvs. 2R2G2B til normal, R2G2B for enkelt tab, og 2G2B for biallel tab). En cutoff værdi for

PTEN

sletning af 10% af cellerne blev etableret ved at bestemme den gennemsnitlige falsk-positive plus 3-standardafvigelsen hjælp 10 tilfælde med normal colon epitel [14]. For at lokalisere Ad-ACA synaptiske områder blev FISK billeder overlappede med IHC og /eller HE billeder for at markere Ad-ACA overgang. Disse resultater blev sammenlignet med regionerne viser tab af PTEN udtryk.

Oligonucleotid /enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) matrix

Efter macrodissection af FFPE tumor sektioner blev genomisk DNA ekstraheret ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) og vurderet ved hjælp af CytoScan HD 2,6 millioner-probe microarray platform (Affymetrix, Santa Clara, CA) ifølge producentens instruktioner. Op til 1 pg DNA blev spaltet med restriktionsenzymet Nsp I, ligeret til adaptorer, og amplificeret med PCR. Produktet blev derefter oprenset under anvendelse af en magnetisk separation teknik, fragmenteret, og mærket før hybridisering til mikroarrayet. Prøve kvalitet blev vurderet ved PCR oprensningstrin. Fem prøver med prominente CSC-lignende Ad-ACA overgangsregioner var makro-dissekeret og analyseret uafhængigt af mere dybt invasive ACA.

Resultater blev analyseret ved hjælp af kromosomanalyse Suite (Chas) software (Affymetrix). For sammenligninger af hyppigheden af ​​IHC mønstre og unormal loci ved oligonukleotid /enkeltnukleotidpolymorfi array (OSA) i CSC-lignende tilfælde med sager med intakt PTEN, blev p-værdier genereres ved hjælp af Fishers eksakte test.

Mutation analyse

Mutation analyse af genomisk DNA ekstraheret fra macrodissected tumor i FFPE sektioner blev udført for exon 3 hotspot af

CTNNB1

og

KRAS

(codon 12, 13 og 61) ved pyrosekventering, med en omtrentlig følsomhed på 2% til 5%. I 11 tilfælde med prominente CSC-lignende overgangszoner, blev Ion sekventering udført for mutation hotspots i 34 cancer-associerede gener, som desuden omfattede

PTEN

,

Smad4

, og

TP53

ved hjælp af Ampliseq Cancer array (Life Technologies, Carlsbad, CA). Protokollen var pr producentens anvisninger, med DNA-sekventering udføres på Ion PGM platform og analyseres data ved brug SequencePilot software (JSI Medsystems, Tyskland).

Resultater

Skiftende spredning fremhæver Ad-ACA overgang i en delmængde af CRC

Vi undersøgte udtrykket mønster af en række proliferationsmarkører på tværs af de normale-hyperplastisk-Ad-ACA morfologiske overgange i godt orienteret FFPE tumor sektioner af 735 primære CRC sager. I en undergruppe af tumorer, identificerede vi en lokaliseret zone, der viste slående intraglandular ændring mellem Ki-67 + proliferative og Ki-67- hypoproliferative strækninger af adenomatøs epitel i et område støder op til invasiv karcinom. Disse zoner af diskontinuert Ki-67-ekspression forekom over en strækning på ti til flere hundrede tumorceller (Fig 1A). Trods den slående alternerende IHC mønster, Ki-67 + og Ki-67 strækninger var stort set morfologisk ikke kan skelnes fra hinanden og ikke var til stede ved normal /hyperplastiske epitelial overgang (Fig 1A) eller i den invasive carcinom (Fig 1A). I en undergruppe af 4 undersøgte sager, vi bemærkede også parallel diskontinuerlig udtryk for flere cellecyklus regulatorer, herunder cyclin D1, MYC og P53, i disse Ad-ACA overgangszoner (Fig 2)

(A) Ki 67 immunhistokemisk farvning af en primær sektion tyktarmskræft viser prolifererende celler begrænset til de krypter i normal /hyperplastiske epitel (til venstre); strecthes af skiftevis Ki-67 + prolifererende og Ki-67- hvilende celler i adenomatøs region støder op til de første områder af invasiv tumor (midten); og ensartet spredning i den invasive carcinom (højre). (B) PTEN immunfarvning fra samme tumor viser ensartet PTEN ekspression i den normale /hyperplastiske epitel (venstre), og i de fleste adenomatøs epitel og invasive tumor (til højre). Et område inden for Ad-ACA overgangszone viser on-off skiftevis PTEN udtryk overlapper med on /off Ki-67-ekspression.

Immunfarvning i Ad-ACA overgangszoner af en primær CRC tumor viser fokal tab af PTEN, Ki-67, P53, og EZH2 i den samme del af kirtlen, der viser opregulering af Smad4 og MGMT. Strækningen af ​​celler mellem de to grønne pile (A B) fremhæver en nøjagtig overlejring af PTEN tab og Smad4 opregulering

Svarende til Ki-67, vækst regulator PTEN demonstrerede lignende og overlappende brat. intragland ændringer i protein niveauer, med meget diskrete /diskontinuerte grænser (fig 1B). Denne on /off Ad-ACA overgangszone, som påvist ved PTEN IHC, var fremtrædende i 50 af de 735 (6,8%) tilfælde undersøgt, men var mindst fokalt til stede i 75 af de 202 (37,1%) tilfælde med intakt Admin ACA junctions (tabel 1). Dette blev ikke observeret i 20 konventionelle colon adenomer uden tilknyttet invasiv carcinom (ikke vist).

Denne vekslende PTEN mønster var forskellig fra både den nedreguleret (men stadig ensartet udtryk) PTEN IHC mønster ses i 275 tilfælde (37,4%) og den fuldstændige PTEN tab mønster ses i 89 (12,1%) (tabel 1). Det specifikke mønster af PTEN ekspression blev ikke signifikant korreleret med tumor stadium, fås i 108 tilfælde. I de 75 tilfælde med vekslende PTEN og en evaluerbare Ad-ACA overgang, viste den tilstødende invasive ACA re-ekspressionen af ​​PTEN i de invasive områder i alle tilfælde (figur 1B, nederste panel).

Tumorer med pludselige og ensartet tab af PTEN udtryk ved IHC havde ingen identificerbare Ad-ACA kryds i 85 af 89 tilfælde (95,5%); fraværet af tilbageværende adenomatøs komponent var stærkt associeret med tumorer, der viste fuldstændig PTEN tab (p .0001). Tumorer med komplet PTEN tab af udtryk manglede også en forudgående skiftevis on /off mønster af PTEN udtryk i tumor eller tilstødende væv i alle undtagen 2 tilfælde.

I tumorer med skiftevis PTEN, Smad4, en mediator af TGF beta signalering, viste også on-off protein graduering i disse samme områder i 15 af 21 tilfælde (71,4%), men med et mønster invers til PTEN (fig 2A og 2B). PTEN-Smad4 dobbelt-immunfarvning bekræftede dette stort set omvendt forhold mellem de Smad4 og PTEN farvning niveauer (ikke vist). Andre dele af TGF-beta vej, herunder pSMAD1 /5/8 og pSMAD2 /3 afslørede ikke ligner on /off udtryk inden for de Ad-ACA overgangszoner (S1 Fig).

Mønster af kræft stamceller markør udtryk på Ad-ACA overgang

i betragtning af den rolle PTEN /AKT signalering i mediere ISC cykling [4,15,16] undersøgte vi niveauet og subcellulære lokalisering af CSC markører i 21 CRC tilfælde med PTEN /Smad4 /Ki-67 alternerende overgangszoner. Disse samme proliferativ-hypoproliferative zoner viste også dramatiske diskontinuitet i ekspressionen af ​​ALDH1, EZH2, og MGMT, samt niveauer og lokalisering af CD44, og forskydninger i cytoplasmatisk /membran og nuklear lokalisering af β-catenin (fig 2 og 3). I de strækninger af celler med lav-til-fraværende PTEN og Ki-67 positivitet blev β-catenin flyttet til kernen (Fig 3C). Væk fra Ad-ACA overgangszoner, β-catenin blev enten helt omplantes til kernen eller til stede i membran /cytoplasmatiske steder i næsten alle celler, med kun spredte enkelte celler eller små klynger af celler med nuklear-lokaliseret protein. CD44 blev begge nedreguleres og omfordelt til den basale epitel grænsen i PTEN- områder (Fig 3D). MGMT blev opreguleret i områder, der viste nedregulering /fravær af EZH2 og ALDH1 farvning (fig 2E og 2F) (fig 3E og 3F).

(AD) Adenomatøs epitel støder op til den invasive tumor viser fremtrædende multifokale zoner af PTEN tab og nedsat Ki-67, med nuklear lokalisering af β-catenin og nedsatte niveauer og basal membran relocalization af CD44. (E, F) Ad-ACA overgang i en anden tumor viser multifokale strækninger af adenomatøs epitel med tab af EZH2 og ALDH1 udtryk. De grønne pile fremhæve områder, hvor ud-af-fase skiftende mønstre af CSC-lignende markører forekommende.

Selvom to eller flere af de stamcelle markører viste vekslende udtryk i alle 21 PTEN /Ki-67 vekslende sager testet, den nøjagtige placering af on-off markørekspression for stamcellemarkører var mere variabel, som kan være relateret til relative niveauer eller stabiliteter af de involverede proteiner (f.eks figur 3 sammenlignet med figur 2). Regnskab for denne variation, Ki-67 + proliferative zoner viste en PTEN + P53 + EZH2

lav ADLH1-MGMT

høj SMAD4- immunofænotype med den inverse immunofænotype stede i Ki-67- hvilende zoner.

Korrelation af

PTEN

genomisk status med PTEN udtryk mønster

i CRC tilfælde med prominente CSC-lignende overgangszoner, undersøgte vi de genomiske resultater ved microarray (tabel 2) og de mutationsmønstre resultater ved sekventering paneler , herunder til exon 3 mutationen hotspot i

CTNNB1

samt

KRAS

,

PTEN

,

Smad4

, og

TP53

. Analyse blev udført i macrodissected tumor inden for de invasive områder

Hyppigheden af ​​genomisk tab på 10Q /

PTEN

som vurderet af OSA. (10/16, 62,5%) var meget højere i CRC med fremtrædende CSC-lignende ekspansion, som defineret af PTEN IHC mønster, end i sager med ensartet PTEN udtryk (1/16, 6,3%, p = 0,0007) (fig 4A). I CSC-lignende tilfælde, hyppigheden af ​​

PTEN

deletion var endnu højere (13/17; 76,4%), når analyseret ved FISH. Ved hjælp af FISH, vi vurderede også genetiske komplement i individuelle celler i CSC-lignende zone selv og i den invasive komponent. Disse undersøgelser viste langt mere variabel sletning af kromosom 10 og

PTEN

locus mens der i den invasive ACA væk fra krydset, mønstret af

PTEN

FISH var mere ensartet heterozygot sletning (Fig 4B- 4E og S2 tabel).

(A) Oligonucleotid /SNP-array resultater viser hyppige sletning (røde linjer) i

PTEN

locus på kromosom 10 (sort stiplet pil) i CRC med fremtrædende CSC -lignende overgangszoner (blå baggrund) og i tumorer med komplet PTEN tab ved IHC (lyserød baggrund) sammenlignet med dem med ensartet PTEN nedmodulering eller normal ekspression (hvid og gul baggrund). Tilfælde med sletninger af p arm af kromosom 17 omfatter

TP53

(midten) og sletninger af kromosom 18 (til højre) var almindeligt bemærket i CRC og var uafhængige af PTEN IHC mønster. (B-E) Sammenligning af PTEN IHC og FISH i en CSC-lignende tumor (Case 1 fra S2 tabel). (B) Stor forstørrelse af PTEN IHC med den typiske alternerende ekspressionsmønster ved overgangszonen. (C) Den matchede

PTEN

FISH billede viser et heterogent mønster for tab af

PTEN

og kromosom 10 kopier nummer i tumor epitelceller. (D) PTEN IHC i den invasive ACA væk fra overgangen viser ensartet udtryk. (E) FISH-analyse i den invasive ACA område væk fra overgangen viser et ensartet mønster af en kopi

PTEN

tab. (F) PTEN IHC i en CRC tilfældet med fraværende PTEN staning. (G)

PTEN

FISH i en seriel afsnit af samme tumor som (F), der viser homozygot

PTEN

sletning. De underliggende stromale celler på den grønne pil viser normale

PTEN

kopi nummer.

Den høje frekvens af

PTEN

sletning i CSC-lignende tumorer var lig dem viser fuldstændig PTEN tab ved IHC. I sidstnævnte gruppe, men niveauer af 10q tab af OSA i en delmængde af sager var i overensstemmelse med biallele sletning konstatering bekræftes af FISH på 5 tilfælde (figur 4F). Påviselig

PTEN

mutationer var ikke almindelige i alle grupper.

Hyppigheden af ​​genetiske ændringer på kromosom 18q /

Smad4

12/16 (75%) og kromosom 17p /

TP53

9/16 (56,3%) i CSC-lignende tilfælde var de samme som i tilfælde med andre PTEN ekspressionsmønstre (figur 4A).

KRAS

mutationer (83/178, 46,7%) og

CTNNB1

exon 3 mutationer (1/46, 2,2%) var til stede i CSC-lignende sager på et tilsvarende frekvens fra tumorer med andre mønstre af PTEN ekspression. I en undergruppe af 7 tilfælde med prominente CSC-lignende overgangszoner, DNA-sekventering afslørede mutation af frekvenser på 14,3% til

TP53

(1/7), 28,6% for

Smad4 Hotel (2 /7), og 57,1% for

APC

(4/7), hvilket indikerer en mulig højere

Smad4

lavere

TP53

mutation end uselekterede CRC sager [17] .

Expression ændringer mellem Ad-ACA krydset og i den invasive tumor komponent

med undtagelse af MGMT, som viser mere kompleks variabel til /fra udtryk mønster i de fleste tumorer, de studerede markører, der var skiftevis i Ad-ACA overgangszonen blev stort set ensartet udtryk i den invasive ACA væk fra overgangen. Som nævnt ovenfor, tilfælde med fremtrædende vekslende PTEN udtryk ved overgangen altid re-udtrykte protein i de invasive tumorer; et lignende mønster blev set for ALDH1 og EZH2. Men Smad4 og CD44-ekspression blev lejlighedsvis helt tabt i den invasive tumor. Mest slående var dog P53 udtryk: TP53 udtryk viste en høj grad af fuldstændigt tab (50%) eller ensartet forstærkning (41,7%) i den invasive ACA væk fra Ad-ACA overgang (figur 5). I disse tumorer, den alternerende P53 udtryk set inden for de CSC-lignende overgangszoner ikke længere overholdes.

P53 IHC viser kun enkelt celle /omdrejningspunkt udtryk i den normale epitel og mest adenomatøs områder, skiftevis til udtryk i præ- invasive /overgangszonen (indsat) og ensartet opreguleret P53 protein-ekspression i de senere faser af den invasive adenokarcinom. Denne tumor er den samme som den, der er illustreret i Fig 1. De fælles træk ved hver morfologisk overgang i CRC tilfælde med prominente CSC-lignende funktioner vises.

Diskussion

Ved undersøgelse de morfogenetisk overgangszoner i et stort antal primære CRC tumorer, vi afdækket en lokaliseret CSC-lignende overgangszone af multifokal skiftevis hvilende /proliferativ adenomatøs epitel påvirker flere stamcellelinjer og cellecyklus-markører, herunder Ki-67, ALDH1, β-catenin , CD44, EZH2, MGMT, MYC, PTEN, P53, og Smad4. Denne overgangszone, centreret i præ-invasive adenomatøs epitel støder op til invasive tumor områder, i modsætning til den mere ensartet spredning og homogene udtryk profiler af den dybere invasive ACA og adenomatøse grænser op til ikke-neoplastisk epitel.

den meget betydelige sammenslutning af

PTEN

sletning /haploinsufficiency med CRC sager, der har prominente CSC-lignende zoner implicerer lavere niveauer af PTEN protein og dermed differentieret modulation af AKT-aktivitet som en udløser for CSC-lignende fænotype. Talrige undersøgelser i cellelinje og mus genetiske modeller har støttet en rolle for haploinsufficiency eller nedsat niveau af PTEN at fremme kræft progression [18-20]. Desuden cykling af AKT-aktivitet, på grund af PTEN variationer eller andre faktorer såsom TCL1 svingning, er også et fælles konklusion i både cancer-relaterede og ikke-neoplastisk stamcelle funktion og embryogenese [21-24]. tilbagevenden PTEN til normale niveauer uden zoneinddeles ændringer i den invasive komponent i disse CSC-lignende tumorer implicerer dog koordinere dysregulering af andre veje på Ad-ACA krydset. I denne henseende, fraværet af påviselige Ad /ACA kryds og fraværet af en CSC-lignende vekslende fænotype i CRC med total PTEN IHC tab viser, at den naturlige historie af kolon tumorer med komplet PTEN tab er karakteristisk [25].

i betragtning af den brede tilgængelighed af både PTEN og Smad4 immunfarvning, kan disse to markører anvendes alene eller i kombination (herunder som dobbelt IHC) at supplere morfologisk undersøgelse identificere CSC-lignende Ad-ACA overgang i prøver begrænsede væv. Faktisk som rapporteret for andre tumorer [26], PTEN IHC synes overlegen i forhold til gen-sekventering, FISH og microarray i at fremhæve den dynamiske PTEN forordningen ligger til grund for CSC-lignende overgang. For både microarray og FISH-analyse, især kan PTEN funktionelle status være svært at dissekere givet den hyppige forekomst af aneuploidi og genetisk ustabilitet i CRC. Yderligere komplicerer sagen, er mange invasive CRC tumorer omgivet af stromale celler, der kan indeholde forskellige, mindre komplekse, genotyper end de omkringliggende tumorceller. Dette medfører reduceret teknisk følsomhed FFPE microarray-analyser. Mens FISH er en overlegen metode til at undersøge fokale genetiske begivenheder, microarray var i stand til at opdage

PTEN

sletning med tilstrækkelig nøjagtighed. Genomisk analyse afslørede dog, at ensartede nedmodulering af PTEN niveauer i invasiv CRC synes relateret til

PTEN

gendeletion og uden tilknytning til CSC fænomenet.

Selv om dette CSC-lignende zone er fremtrædende i kun en lille procentdel af CRC tilfælde (fig 3), er det fokalt til stede i en betydelig procentdel af sager, som viser morfologisk intakte Ad-ACA overgange (fig 2). Eksistensen af ​​disse diskrete CSC-lignende zoner på Ad-ACA krydset i en stor gruppe af primære CRC’er tyder på, at de kan tjene som en nyttig forløber læsion, forudser begyndende invasiv transformation. I denne henseende de ligner mønstret for PTEN regulering set i glandulær forstadielæsioner set i endometriecancer [27,28]. Hvorvidt disse endometrie læsioner viser det samme mønster af CSC-lignende spredning /hvile og repræsentere en lignende konvergens af kritiske signalveje kræver yderligere undersøgelse.

colokalisering men ikke perfekt overlapning af on /off grænser for mange CSC-markører foreslår, at modulering af proliferation /hvilende fænotype sandsynligvis ret hurtig i overgangszoner. Disse dyssynchronous grænser ses for nogle markører er sandsynligvis på grund af varierende halveringstider og forskellige nedregulering mekanismer for hvert protein, herunder proteolytisk spaltning, transkriptionel nedregulering, og proteosom clearance [29,30]. Ikke desto mindre Ki-67 + /PTEN + /MYC + /TP53 + zoner skiftevis med Ki-67- /MGMT + /β-catenin

nuc /SMAD + zoner er det karakteristisk mønster ses i mange tilfælde.

mønster skiftende markører observeret i overgangszonerne favoriserer aktiverende og inhibitoriske vekselvirkninger mellem TGF-beta /SMAD, PI3K /Akt og Wnt /β-catenin signalveje [31]. Interaktioner mellem AKT og BMP /TGF-beta signalering, som bemærket her for PTEN og Smad4, er en funktion af stamcelle-fænotype i nogle modeller [16,32,33]. Modulering af SMAD signalering (som vurderet ved phospho-SMAD antistoffer) og Smad4 ekspression i opposition til PTEN i en række af de CSC-lignende tilfælde kan afspejle hyperresponsivitet af forbindelsesområdet epitel til BMP /TGF-beta-signalering. At hjælpe med at drive de cykliske proliferative /hvilende egenskaber overgangszonen, effekter af SMAD aktivering på hæmning af Wnt signalering [34,35] kunne modsætte virkningerne af øget EZH2 på kørsel β-catenin aktivitet [36].

En anden mulig coregulator af CSC-lignende fænotype ved Ad-ACA overgang er MYC, som også veksler parallelt med PTEN, Ki-67, og Smad4. I cellelinje modeller, kan MYC overekspression drev PTEN opregulering og EZH2 nedmodulering ved at inhibere AKT [37]. Når PTEN niveauer og AKT-aktivitet begynder at svinge, virkningerne af den bredere stamcelle transkriptionel program bliver sandsynligvis [38]. AKT-aktivitet i fravær af PTEN har også vist sig at fremme genetisk ustabilitet, som observeres hos CSC-lignende overgange og ville have en tendens til at fremme genetisk progression [39].

I de fleste CRC med fremtrædende CSC-lignende zoner TP53 dysregulering, som det fremgår af ensartet P53 IHC tab eller gevinst, forekom i den invasive tumor væk fra overgangszonen. Dette antyder, at TP53-drevet udvækst af en dominerende invasiv CRC klon normalt følger og måske drevet af genetisk udvælgelse i CSC-lignende overgangszone. Det er muligt, at disse overgangszoner er et generelt fænomen af ​​præ-invasive fase af carcinogenese, hvor AKT og Wnt /β-catenin cyklisk reguleret.