PLoS ONE: Novel terapeutiske metoder for forskellige cancertyper Brug af en Modified Sleeping Beauty-Based Gene Delivery System

Abstrakt

Vellykket genterapi afhænger i høj grad selektiv påførsel af terapeutiske gener i de passende mål kræftceller. En af de mest effektive og lovende fremgangsmåder til målretning af tumorvæv under genafgivelse er anvendelsen af ​​virale vektorer, der muliggør højeffektiv genadministration. Anvendelsen af ​​virale vektorer er ikke uden risici og sikkerhedsproblemer, såsom toksicitet, en masse immunrespons over de virale antigener eller potentiel viral rekombination i værtens kromosom; disse risici begrænser den kliniske anvendelse af virale vektorer. Den Sleeping Beauty (SB) transposon-baseret system er en attraktiv, ikke-viral alternativ til virale leveringssystemer. SB kan være mindre immunogene end den virale vektor systemet på grund af sin manglende virale sekvenser. SB-baserede gentildelingssystem kan stabilt integrere i værtscellens genom til frembringelse af den terapeutiske genprodukt over levetiden for en celle. Men sammenlignet med virale vektorer, non-virale SB-baserede gentildelingssystem stadig har begrænset terapeutisk virkning på grund af mangel på langvarig genekspression potentiale og tumorcellespecifik genoverførsel evne. Disse begrænsninger kan overvindes ved at justere SB-systemet ved indførelse af hTERT-promotoren og SV40-enhanceren. I denne undersøgelse et modificeret SB leveringssystem, under kontrol af hTERT-promotoren sammen med SV40-enhanceren, var i stand til at overføre selvmordsgen (HSV-TK) i flere typer af cancerceller. Den modificerede SB transficerede cancerceller udviste en signifikant forøget cancercelle specifik dødelighed. Disse data antyder, at vores modificerede SB-baserede gentildelingssystem kan anvendes som et sikkert og effektivt værktøj til cancercelle særlige terapeutiske genoverførsel og stabil langsigtet ekspression

Henvisning:. Hong IS, Lee HY, Kim HP (2014) Novel terapeutiske metoder for forskellige cancertyper Brug af en Modified Sleeping Beauty-Based Gene Delivery System. PLoS ONE 9 (1): e86324. doi: 10,1371 /journal.pone.0086324

Redaktør: Eduard Ayuso, University of Nantes, Frankrig

Modtaget: 11. juli, 2013; Accepteret: December 6, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Hong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling (Project kode nr, Z-1541745-2012-13-09) fra Animal og Plant Karantæne Agency, Ministeriet for Landbrug, Fødevarer og landdistrikter. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gene-rettet enzym prodrug terapi (GDEPT) er en af ​​de lovende alternativer til konventionel kemoterapi; GDEPT minimerer systemiske toksiciteter ved indførelse af katalytiske enzymer, som omdanner lav-eller ikke-toksiske prodrugs til toksiske metabolitter i tumorceller [1]. Denne terapeutisk system består af inaktive lav- eller ikke-toksiske prodrugs og et gen der koder for et [2] enzym. Efter genetisk modifikation tumorcellerne til at udtrykke sådanne enzymer og den systemiske indgivelse af prodrug’et, er prodruget lokalt omdannes af enzymet til toksiske metabolitter, der fører til selektivt drab af tumorcellerne. Fordi den toksiske metabolit kun produceres og frigives i den lokale tumor site, hvor genet er leveret, hvilket resulterer i en stærkt reduceret cirkulerende koncentration af det frie toksisk lægemiddel, er denne terapeutiske system kaldet lokal kemoterapi. Der er flere gener, der koder prodrug-aktiverende enzymer. Blandt dem, den mest almindelige gen er Herpes Simplex Virus-1 thymidinkinase (HSV-TK), en velkarakteriseret selvmordsgen, som kan isoleres fra Herpes simplex virus eller

E. coli

[3], [4]. HSV-TK konverterer systemisk administreret prodrug gancyclovir (GCV) til en toksisk metabolit, der dræber cancerceller [5]. Denne kombination metode har været anvendt med succes til mange kliniske områder, såsom genterapi til behandling af cancer [6] og graft-versus-host sygdom (GVHD) [7].

Vellykket GDEPT afhænger i høj grad selektiv påførsel af selvmordsgen i de passende mål kræftceller. En af de mest effektive og lovende fremgangsmåder til levering af gener ind i målet tumorvæv er anvendelsen af ​​virale vektorer, der muliggør højeffektiv genoverførsel [8], [9]. Men disse vektorer øjeblikket risici og sikkerhedsmæssige bekymringer, såsom toksicitet, vært immunrespons mod de virale antigener eller potentiel viral rekombination i værtens kromosomer, der begrænser deres kliniske anvendelse [10]. Et andet problem med anvendelsen af ​​virale vektorer til genterapi er, at viral vektor forberedelse er besværlig og dyr [11], [12] Derfor kan et bedre alternativ være at udvikle en genafgivelse metode, ville direkte terapeutiske midler til passende steder og konstitutivt udtrykke terapeutiske gener inden for eller i nærheden af ​​tumoren websted uden disse begrænsninger.

transposon-baseret system er et attraktivt, ikke-viral alternativ til de virale leveringssystemer. Transposoner er diskrete segmenter af DNA, som har den iboende evne til at bevæge sig fra sted til sted og kan replikere sig selv i genomet ved hjælp af værtscellens organeller og andre maskiner. Men sammenlignet med virale vektorer, transposoner ikke er infektiøse, og deres aktiviteter er derfor begrænset til intracellulære rum med specifikke funktioner. I hvirvelløse dyr, har flere forskellige typer af endogene transposoner været flittigt brugt, såsom TC1 mariner-lignende element i

Caenorhabditis elegans

P element i

Drosophila

[13], [14] . Desværre ingen sådanne aktive og endogene transposoner er tilgængelige hos hvirveldyr grundet de akkumulerede mutationer i transposon-sekvens [15]. En metode til at overvinde dette problem hos hvirveldyr var den molekylære rekonstruktion af en genetisk aktiv hvirveldyr Tc1 /mariner-typen transposerbare element kaldet Sleeping Beauty (SB) fra de gamle “døde” transposon fossiler fundet i fisk genomer [16]. SB viser effektiv transpositional aktivitet i muse embryonale stamceller (ES) celler [17], mus somatisk væv [18], og mus kønsceller [19]. Desuden har SB vist enorm succes som en effektiv gentilførselsbærer i musemodeller for human sygdom [20] – [23]. I tidligere undersøgelser, Song et al. fandt, at SB transposon medierer selvmord genekspression i hepatocellulært carcinom forårsager apoptose [24] og telomerase-genoverførsel til beskyttelse mod kemikalier (t-BH, CCI4, eller d-GalN) -. induceret akut cellulær skade [25]

Men sammenlignet med virale vektorer, non-virale SB baseret gentildelingssystem stadig har begrænset terapeutisk virkning på grund af mangel på langvarig genekspression og cancer cellespecifik genoverføring evne. HTERT-genet er hyppigt reaktiveres hos ca. 90% af immortaliserede humane celler og cancerceller af forskellig oprindelse [26] – [28]. hTERT-promotor har været flittigt brugt i målrettet cancer genterapi [29] – [31]. Derudover har SV40 enhancer blevet grundigt anvendt til at forbedre aktiviteten af ​​promotorer at fremme langvarig genekspression [32]. At øge promotorstyrken samtidig bevare vævsspecificitet, brugte vi således en rekombinant SV40 enhancer indeholdende et tumorspecifikt hTERT-promotor [33]. Mens Song et al. har rapporteret en associering mellem modificeret SB og suppression af tumorvækst [24], er deres undersøgelse er begrænset til dem af enkelt hepatocellulært carcinom cellelinje (Hep3B), hvor universel antitumorvirkninger i forskellige cancer celletyper mangler. Ligeledes selvom tumor undertrykkende virkninger af modificeret SB er blevet foreslået, er disse virkninger bekræftes ved en enkelt in vitro assay (ATP celleviabilitetstest), hvori en mere omfattende profil af antitumorvirkninger af modificeret SB mangler stadig [24]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, blev det modificerede SB-baserede genlevering system, der anvendes til at overføre selvmord gen (HSV-TK) i flere typer af cancerceller, herunder H358 (lungekræft), H1299 (lungekræft), PC3 (prostata cancer), DU145 (prostatacancer), og OVCAR3 (ovariecancer) celler med forskellige eksperimentelle tilgange, herunder TUNEL assay celleviabilitetstest, FACS-analyse, og in vivo forsøg. Disse data tyder på, at modificeret SB-baserede genlevering systemet kan bruges som et sikkert og effektivt værktøj til kræftcellen særlige terapeutiske genoverførsel og stabil langsigtet udtryk.

Materialer og metoder

Cell kultur

Humant normalt fibroblast, WI-38 og IMR-90 celler blev holdt i DMEM (GIBCO BRL, Tyskland) suppleret med 10% dødelig kalveserum (FCS) (HyClone, Logan, USA), penicillin (50 enheder /ml) og streptomycin (50 ug /ml) i nærvær af 5% CO

2. H358 (lungekræft), H1299 (lungekræft), PC3 (prostatacancer), DU145 (prostatacancer), og OVCAR3 (ovariecancer) blev dyrket i RPMI1640 tilsat 10% FCS, penicillin (50 enheder /ml) og streptomycin (50 ug /ml) i 5% CO2. Alle cellelinier blev opnået fra Korea cellelinje Bank (Seoul, Korea).

Dyreforsøg

Lung kræftceller (H358), prostatakræft cellelinje (DU-145), og kræft i æggestokkene celler (OVCAR3) blev høstet ved trypsinisering, og 1 x 10

5 levedygtige celler (som bestemt ved trypanblåt-udelukkelse) i et samlet volumen på 200 pi blev injiceret subkutant i 6- til 10 uger gamle, NOD /SCID mus. To dage efter tumor podning blev dyr injiceret intravenøst ​​via halevenerne med 100 mg /kg gancyclovir (GCV) sammen med enten 25 ug tomme plasmid (pT. HTP. Con) eller modificeret SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk. con). Mus blev aflivet 28 dage efter tumor injektion og virkningen af ​​modificeret SB-system på tumorvækst blev vurderet ved måling af tumorstørrelse. For at minimere lidelse, blev alle kirurgiske procedure udføres under bedøvelse med natriumpentobarbital. Dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg i Jungwon University (Permit Nummer: 2013-0610).

RT-PCR-analyse

Total RNA blev isoleret fra hver celler ved hjælp af Absolut RNA Microprep kit (Stratagene, La Jolla, USA) ifølge producentens protokol og behandlet med DNase i til at forhindre genomisk DNA-kontaminering. cDNA-syntese blev udført med 1 ug RNA ved anvendelse af SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen, Calsbad, USA) med oligo (dT) primer (Promega, Madison, USA) til et slutvolumen på 20 ul. 1 ul alikvoter af cDNA blev anvendt til at amplificere cDNA i 20 ul af den samlede reaktion. PCR-betingelser for amplifikation var: 94 ° C i 5 minutter; 30 cykler ved 94 ° C i 1 min, ved 55 ° C i 1 min, og ved 72 ° C i 90 sek; og endelig 72 ° C i 10 min). hTR cDNA blev amplificeret med hTR specifik primer sæt (5′-tttgtctaaccctaactgagaagg-3 ‘som fremad og 5′-tgtgagccgagtcctgggtgcacg-3′ som omvendt). hTERT cDNA blev amplificeret med fremadrettede primer (5’-cggaagagtctggagcaa-3 ‘) og revers primer (5′-ggatgaagcggagtctgga-3′). Forskelle i ekspression fra hver prøve blev normaliseret til GAPDH (fremadrettet 5’-aacgagcggttccgatgccctgag-3 ‘; revers 5′-tgtcgccttcaccgttccagt t-3’). PCR-produkterne blev separeret ved 2% agarosegelelektroforese, der indeholder 0,5 ug /ml ethidiumbromid.

Konstruktion af plasmider Salg

Plasmider for Sleeping Beauty-transposon-system, pCMV-SB og pCMV MSB (a transposase har en missense mutation i dets C-terminale Asp-Asp-Glu-motiv) blev venligst leveret af Dr. Joonseok Song (University of Pittsburgh) [25]. Til konstruktion transposonet plasmid, pGL3-HT-Con og pGL3-HT-TK-Con plasmider blev skåret med KpnI og BamHI-restriktionsenzymer. En luciferase og HSV-TK-genet blev ligeret med pT-MCS-vektor, som gav anledning til pT.hTp.Con og pT.hTp.HSV-tk.Con vektorer (fig. 1). HTERT-promotoren og SV40 enhancer region blev amplificeret ved PCR under anvendelse af Ex Taq DNA-polymerase (Takara, Shiga, Japan) og subklonet i pGL3-HT-Con vektor. HTERT-promotoren fremad (5′-accaggtagtggattcgcgggcacaga-3 ‘) og reverse (5′-agatctagggcttcccacgtgcgcag-3′) primere, og SV40E fremad (5’-gcattcgatggagcgg-3 ‘) og revers (5′-ggatccgctgtggaatg-3’) primere blev anvendt. PCR blev udført i 35 cykler ved 94 ° C i 1 min, ved 60 ° C i 1 min, og ved 72 ° C i 1 min.

Til konstruktion transposonet plasmid, den pGL3-HT-Con og pGL3-hT-TK-Con plasmider blev skåret med KpnI og BamHI; enderne af luciferase kassetten og HSV-TK-kassetten blev udfyldt under anvendelse af DNA-polymerase I og stump ende ligeret ind i pT-MCS-vektor, hvilket resulterede i pT.hTp.Con og pT.hTp.HSV-tk.Con vektorer, henholdsvis. Den pT.hTp.nori.Con plasmid blev konstrueret fra pTnori plasmidet gennem indsættelse af den humane telomerase-promotoren (hTERTp) og SV40 enhanceren. SV40-promotoren blev erstattet med hTERTp ved fordøjelse af plasmidet med pTnori SexAl og Bglll. SV40 forstærker blev indsat mellem BSMI og BamHI-stederne i pTnori. HTERT-promotoren og SV40 enhancer region blev amplificeret ved PCR fra pGL3-HT-Con vektor under anvendelse Ex-Taq polymerase.

Luciferase assay

Luciferase-assays blev udført ved anvendelse af luciferase assay System (Promega, Madison, USA) og AutoLumat LB953 luminometer (Berthold, Wildbad, Tyskland) ifølge producentens protokoller. Kort fortalt, 3 × 10

4 celler podet i en 16-mm vævskulturskål blev transficeret med 1 ug af luciferase reporter plasmider og 0,25 ug pSV-β-galactosidase kontrol plasmidvektor. Cellelysater blev fremstillet 48 timer efter transfektion ved tilsætning af 100 ul af reporter lysepuffer og deres luciferaseaktiviteter blev målt. Den pGL3-Promoter plasmid indeholdende SV40-promotoren blev anvendt som en positiv kontrol. Luciferaseaktiviteten af ​​pGL3-Promoter plasmid i hver cellelinje blev anset for at være 1, og den relative luciferaseaktivitet blev beregnet. Alle luciferase assays blev udført tre gange.

Plasmid transfektion med GCV behandling in vitro

Kræft og normale celler (10

5 celler pr skål) blev udpladet i 35 mm dyrkningsskåle tidligere transfektion, og de blev transficeret med pCMV-SB eller pCMV-MSB plasmid med pT.hTp.HSV-TK.Con plasmid under anvendelse af lipofectamin 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, USA). Efter inkubation ved 37 ° C i 3 dage, 2 ml medium indeholdende forskellige koncentrationer af Ganciclovir (GCV; InvivoGen, San Diego, USA) blev tilsat til cellerne. Alle de viste data i denne rapport blev opnået fra mindst tre uafhængige forsøg.

TUNEL assay

DNA streng pauser i apoptotiske celler blev målt ved TUNEL-analysen ved hjælp af In-situ Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals, Tyskland). Prøver blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter og inkuberet i en 0,1% iskold Triton X-100 opløsning til permeabilisering i 10 minutter i overensstemmelse med producentens anvisninger. Celle blev derefter vasket 3 gange med PBS og omsat med 50 pi af reaktionsblandingen TUNEL ved 37 ° C i 60 minutter i et mørkt, fugtigt kammer. Celler blev vasket tre gange i PBS. Under fluorescensmikroskopi blev antallet af TUNEL-positive celler talt.

Apoptose assay

apoptotiske satser i normale celler og cancerceller blev målt med en Annexin V-FITC Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Kort fortalt blev pT.hTp.HSV-TK.Con og pCMV-SB transficerede celler behandlet med GCV (50 ug /ml, 3 timer ved 37 ° C) efter 10 dages transfektion. Celler blev høstet og skyllet med en 1 × annexin-bindingsbuffer og derefter resuspenderet med 100 ul af en 1 × annexin-bindingsbuffer. Efter tilsætning af 5 pi FITC annexin V og 1 ul af propidiumiodid (PI; 100 ug /ml) blev celler inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter i mørke. Andelen af ​​levedygtige celler blev analyseret ved FACScalibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) og kvantificeret ved Flowjo software (Tree Stjerne Inc., Ashland, USA).

Cytotoksicitetsassay

Et antal 5 × 10

3 pT.hTp.HSV-TK.Con og pCMV-SB transficerede celler blev podet i 96-brønds plade. Pladen blev derefter inkuberet ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer. GCV blev tilsat ved koncentrationsniveauet for 10, 30, 50 ug /ml in triplo for hvert koncentrationsniveau. Cellerne blev derefter inkuberet i 3 timer og blev tilsat med MTT, hvor cellerne blev dyrket i yderligere 4 timer. Supernatanten blev derefter fjernet, og DMSO blev tilsat til opløsning af MTT formazankrystaller. OD-værdi ved 570 nm blev detekteret med en mikropladelæser. Celleoverlevelse blev beregnet ved: overlevelsesrate (%) = A /B x 100 (A: OD værdien af ​​pT.hTp.HSV-TK.Con og pCMV-SB transficerede celler; B: OD værdien af ​​pT.hTp.Con og pCMV-SB). Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Overlevelse kurve blev genereret med en gennemsnitlig levedygtigheder af hver cellelinier som ordinat-aksen og koncentrationerne af GCV som abscisseaksen

Statistisk analyse

Hvert sæt af eksperimenter blev udført in duplo eller triplo. Resultater fra hvert eksperiment replikat blev præsenteret som middelværdi ± SD. Data blev vurderet ved envejs variansanalyse (ANOVA) og signifikante resultater blev yderligere vurderet af Tukeys multiple sammenligningstest. Statistisk signifikans blev defineret på en P niveau. 0,05

Resultater

hTERT er en lovende mål for SB-medieret genterapi

Vellykket genterapi afhænger i høj grad den selektive ekspression af et selvmordsgen i egnede mål-cancerceller, men ikke i de normale omgivende celler. Det humane telomerase-revers transkriptase (hTERT) genet, som koder den katalytiske subunit af telomerase, er overudtrykt i embryonale stamceller og er progressivt nedreguleres under differentiering, hvilket resulterer i fuldstændig inaktivering i fuldt differentierede somatiske celler. hTERT ofte reaktiveres hos ca. 90% af immortaliserede humane celler og cancerceller af forskellig oprindelse [26] – [28]. Derfor kan det være en lovende mål for genterapi i en række forskellige tumortyper. Først undersøgte vi udtrykket profiler af de humane telomerase RNA komponenter (hTR) og hTERT anvendelse af RT-PCR i fibroblaster og forskellige cancercellelinier. hTR blev konstitutivt udtrykt i både fibroblaster og de cancercellelinjer, som var i overensstemmelse med tidligere observationer [34]. Ekspressionen af ​​hTERT blev detekteret i alle cancerceller, herunder to lungekræft cellelinier (H358 og H1299), to prostata cancercellelinier (PC3 og DU145), og en ovariecancer cellelinje (OVCAR3), men det ikke blev påvist i de to fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90) (fig. 2). Derfor ekspression af hTERT syntes at være tæt forbundet til tumorudvikling, og hTERT kunne være et lovende mål for SB-medieret genterapi af de forskellige cancertyper.

hTR og hTERT ekspressionsniveauer i forskellige cancercellelinier og normale fibroblaster blev bestemt under anvendelse af RT-PCR. Total RNA blev amplificeret ved anvendelse hTR og hTERT specifikke primere (top og mellemledere, henholdsvis). GAPDH udtryk blev anvendt som en intern kontrol til en normalisering af hTR og hTERT udtryk. hTR blev konstitutivt udtrykt i både fibroblaster og de cancercellelinjer. Ekspressionen af ​​hTERT blev detekteret i alle cancerceller, mens det ikke blev påvist i de to fibroblast cellelinjer. Lung cancer cellelinjer (H358 og H1299); prostata cancer cellelinjer (PC3 og DU145); ovariecancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast-cellelinjer (WI-38 og IMR-90).

tumorspecifikke aktivering af hTERT-promotoren af ​​SV40-enhanceren

Fordi normal eller naturlige promotor var ikke stærk nok til at inducere effektiv ekspression af de terapeutiske gener i visse tumorceller, en kraftfuld tumorspecifik promotor er vigtigt at opnå en vellykket langvarig terapeutisk genekspression. Den Simian virus 40 (SV40) enhancer er blevet grundigt anvendt til at forbedre aktiviteten af ​​promotorer [32] og 3-poly (A) hale er vigtigt for stabiliteten og translation mRNA [35]. For således at øge promotorstyrken samtidig bevare vævsspecificitet, konstruerede vi en rekombinant hTERT-promotor, der indeholdt SV40-enhanceren og SV40 polyA (Simian virus 40 PolyA, også kaldet PolyA). SV40-enhanceren sekvensen blev amplificeret og indsat i det multiple klon (MCS) nedstrøms for hTERT-promotoren. Transkriptionen aktivitet efter transfektion med PT-HTP-Con-plasmidet (med SV40-enhanceren og SV40 polyA) eller pT-HTP-Pro plasmid (uden SV40 enhancer og SV40 polyA) blev påvist og sammenlignet i de normale og cancer-cellelinjer, og virkningen af ​​SV40-enhanceren på aktiviteten af ​​den tumorspecifikke hTERT-promotoren blev evalueret. Som vist i fig. 3, PT-HTP-Con-plasmidet, som indeholder SV40-enhanceren og SV40 polyA, viste en signifikant stigning i transkript aktivitet i telomerase-positiv cancer cellelinjer, mens der ikke var nogen ændring i de to normale fibroblast cellelinjer. Disse resultater viste, at hTERT-promotoren udviste relativt høje transskriptionelle aktiviteter i de fleste af tumorcellelinjer medens de udviser lille aktivitet i de normale fibroblastcellelinier, og SV40 enhanceren og SV40 polyA signifikant forøgede aktiviteten af ​​hTERT-promotoren udelukkende i cancercellen

Efter transfektion af enten pT-HTP-Con-plasmidet (med SV40-enhanceren og SV40 polyA) eller pT-HTP-Pro plasmid (uden SV40 enhancer og SV40 polyA), luciferaseaktiviteten blev detekteret linjer. og sammenlignet i normale og cancer-cellelinjer. I telomerase-positive cancercellelinier, SV40 enhanceren og SV40 polyA aktiveret hTERT-genpromotoren med mindst 7 gange sammenlignet med det hTERT-genpromotoren aktivitet uden disse sekvenser. Relativ luciferaseaktivitet blev standardiseret til transfektion af kontrol pGL3-promotoren plasmid. Lung cancer cellelinjer (H358 og H1299); prostata cancer cellelinjer (PC3 og DU145); ovariecancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90). Resultaterne er vist som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, og *** P. 0,001

Langsigtet bæredygtighed i det modificerede SB levering systemet i forskellige typer af kræft celler

vellykket genterapi afhænger af den langsigtede bæredygtighed af terapeutisk genekspression at helbrede eller forsinke udviklingen af ​​udviklingen af ​​kræft. Derfor vi næste undersøgt, om SB leveringssystemet modificeret med hTERT-promotoren og SV40-enhanceren vedvarende langvarig terapeutisk gen ekspression i forskellige typer af cancercellelinjer. Fordi transposasen-producerende hjælper-plasmidet er afgørende for indsættelsen af ​​SB i værten genomer, vi co-transficeret normale fibroblast og cancercellelinjer med en luciferase udtrykker version af pT-HTP-Con plasmid sammen med enten den aktive hjælpe-plasmid ( pCMV-SB) eller den inaktive hjælpe-plasmid (pCMV-MSB). Alle cancercellelinier vedvarende relativt højere niveauer af langsigtet luciferaseaktivitet med SB leveringssystem under kontrol af hTERT-promotoren og SV40-enhanceren i forhold til de normale fibroblaster; var der ingen ændring i de to normale fibroblastcellelinier 10 dage efter transfektion (fig. 4). Disse resultater antyder, at den modificerede SB leveringssystem er en lovende måde at øge den terapeutiske effektivitet, når langsigtet ekspression af de terapeutiske produkter er påkrævet.

Luciferase assays blev anvendt til bestemmelse af promotoraktiviteter af luciferasen udtrykkende plasmid pT-HTP-Con efter co-transfektion med enten den aktive hjælper plasmid (pCMV-SB) eller inaktive hjælper plasmid (pCMV-MSB) i H358, H1299, PC3, DU145, OVCAR3, WI-38, og IMR-90 celler . Alle cancercellelinier, der indeholdt SB-baserede gentildelingssystem, under kontrol af hTERT-promotoren og SV40-enhanceren, vedvarende relativt højere niveauer af langsigtet luciferaseaktivitet end de normale fibroblaster 10 dage efter transfektion. Relativ luciferaseaktivitet blev standardiseret til transfektion af kontrol pGL3-promotoren plasmid. Lung cancer cellelinjer (H358 og H1299); prostata cancer cellelinjer (PC3 og DU145); ovariecancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90). Resultaterne er vist som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, og *** P. 0,001

Modificeret SB leveringssystem øger tumorceller specifikke cytotoksicitet

Vellykket kræftbehandling hjælp genterapi stort set afhænger af den specifikke afgivelse af det terapeutiske produkt i de passende mål kræftceller. Gene-rettet enzym prodrug terapi (GDEPT) er et lovende alternativ til konventionel kemoterapi; GDEPT minimerer de systemiske toksiciteter af konventionelle kemoterapi narkotika ved at indføre katalytiske enzymer i tumorceller; disse enzymer derefter konvertere lav- eller ikke-toksiske prodrugs til toksiske metabolitter [1]. Efter genetisk modifikation tumorcellerne til at udtrykke de katalytiske enzymer, systemisk administration af prodruget, som er lokalt omdannes af enzymet til cytotoksiske metabolitter, fører til selektivt drab af tumorceller. For at bestemme tumorcellespecifik toksiske virkning af vores SB-baserede gentildelingssystem, cancerceller og normale fibroblaster blev co-transficeret med den modificerede SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con) sammen med den aktive hjælpe-plasmid (pCMV -SB) efter administration af 50 ug /ml gancyclovir (GCV). Vi derefter udført TUNEL assays på celler 10 dage efter transfektion for at identificere de apoptotiske celler, der er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​tæt farvede cirkulære organer, der repræsenterer det fragmenterede DNA i apoptotiske celler. Som vist i fig. 5, TUNEL assays viste, at de modificerede SB transficerede cancerceller viste en signifikant øget dødelighed sammenlignet med de normale fibroblaster i nærvær af 50 pg /mL GCV. For yderligere at bekræfte dette tumorspecifik celledød ved SB-baserede gentildelingssystem blev et celleviabilitetstest anvendes til at evaluere cancercellen specifikke cytotoksicitet hos de normale fibroblaster og cancercellelinjer behandlet med GCV på en dosis-afhængig måde. GCV alene havde ubetydelig virkning på cellelevedygtigheden (fig. 6A), hvorimod transfektion af den modificerede SB (pT.hTp.HSV-tk.Con) systemet efter administration af GCV faldt betydeligt cancer cellelevedygtighed på en dosis-afhængig måde (Fig . 6B). Endvidere blev celledød også bestemt ved flowcytometri for at identificere celler, der blev farvet med både Annexin V /FITC og propidiumiodid (PI). Dataene fra TUNEL og cellelevedygtighedsassays stemte overens med vores flowcytometri resultater (fig. 7). Disse resultater antyder, at vores SB-baserede gentildelingssystem medieret tumorcellespecifik terapeutisk genafgivelse, som igen induceret tumor-specifik apoptose. Vores in vitro-data antydede, at den modificerede SB transficerede cancerceller viste en signifikant øget dødelighed sammenlignet med de normale fibroblaster. Derfor Derefter undersøgte vi, om tumorvækst kunne undertrykkes ved modificeret SB leveringssystem in vivo. I nogle eksperimentelle grupper blev tumorvækst held undertrykt af modificeret SB leveringssystem, mens de andre grupper ikke viste en tilsyneladende antitumorvirkning (fig. 8).

Niveauerne af celle apoptose blev vurderet ved anvendelse af TUNEL-assay efter transfektion af SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con med aktiv hjælpe-plasmid) og efter administration af 50 ug /mL GCV ved 3 dag efter transfektion. TUNEL-positive celler var karakteriseret ved tæt farvede cirkulære organer, der repræsenterer det fragmenterede DNA af apoptotiske celler. SB transficerede cancerceller viste en signifikant øget antal TUNEL-positive celler sammenlignet med normale fibroblaster i nærvær af 50 pg /mL GCV. Lung cancer cellelinjer (H358 og H1299); prostata cancer cellelinjer (PC3 og DU145); ovariecancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90). Resultaterne er vist som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, og *** P. 0,001

Cell levedygtighed blev vurderet ved hjælp af MTT med eller uden transfektion af SB-systemet (pT.hTp.HSV- tk.Con med aktiv helper plasmid) efter administration af 10, 30 eller 50 ug /ml GCV ved 3 dag efter transfektion. GCV alene havde ubetydelig indvirkning på effekt på cellen levedygtighed (A), hvorimod transfektion af SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con med aktiv hjælper plasmid) efter administration af GCV faldt betydeligt kræftcellen levedygtighed på en dosis- afhængig måde (B). Lung cancer cellelinjer (H358 og H1299); prostata cancer cellelinjer (PC3 og DU145); ovariecancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90). Resultaterne er vist som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, og *** P. 0,001

Kræft cellelinjer og normale fibroblaster blev transficeret med SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con med aktiv hjælpe-plasmid). Celler blev derefter udfordret med 50 ug /ml GCV, efterfulgt af Annexin V-FITC /PI-farvning og FACS-analyse ved 3 dag efter transfektion. Lung cancer cellelinjer (H358 og H1299); prostata cancer cellelinjer (PC3 og DU145); ovariecancer cellelinje (OVCAR3); fibroblast cellelinjer (WI-38 og IMR-90).

Lung kræftceller (H358) (A), prostatakræft cellelinje (DU-145) (B), og ovariecancerceller ( OVCAR3) (C) blev høstet ved trypsinisering, og 1 x 10

5 levedygtige celler (som bestemt ved trypan blå-udelukkelse) i et totalt volumen på 200 pi blev injiceret subkutant. To dage efter tumor podning blev dyr injiceret intravenøst ​​via halevenerne med 100 mg /kg gancyclovir (GCV) sammen med enten co-transfektion af det tomme plasmid (pT. HTP. Con) med den aktive hjælpe-plasmid (pCMV-SB) eller co-transfektion af SB-systemet (pT.hTp.HSV-tk.Con) med den aktive hjælpe-plasmid (pCMV-SB). Mus blev aflivet 28 dage efter tumor injektion og virkningen af ​​modificeret SB-system på tumorvækst blev vurderet ved måling af tumorstørrelse.

Diskussion

Mange almindeligt anvendte kemoterapeutiske lægemidler mangler tumorspecificitet , og de doser, der kræves for at nå terapeutiske niveauer i tumoren ofte er toksiske for det omgivende normale væv. Derfor prodrug-aktiverende systemer, der omfatter selvmord genterapi er lovende alternativer til konventionel kemoterapi; disse systemer minimere systemiske toksicitet af konventionelle kemoterapi narkotika. For kliniske anvendelse, de selvmordsgener nødt til at opfylde følgende kriterier: a) disse gener skal enten ikke udtrykt eller til stede ved ekstremt lave niveauer i vært;