PLoS ONE: P-TrCP Hæmning Reducerer prostatakræft cellevækst via opregulering af Aryl Hydrocarbon Receptor

Abstrakt

Baggrund

Prostatakræft er en almindelig og heterogen sygdom, hvor androgen receptor (AR ) signalering spiller en central rolle i udviklingen og progression. Den indledende behandling af fremskreden prostatacancer er undertrykkelse af androgen signalering. Senere væsentlige alle patienter udvikler en androgen uafhængig fase, som ikke reagerer på anti hormonbehandling. Således er alternative strategier rettet mod hidtil ukendte molekylære mekanismer nødvendige. β-TrCP er en E3 ligase, der er målrettet forskellige substrater afgørende for mange aspekter af tumorigenese.

Metode /vigtigste resultater

Her viser vi, at β-TrCP udtømning undertrykker prostatakræft og identificere en relevant vækst kontrolmekanisme. shRNA målrettet mod β-TrCP reducerede prostatakræft cellevækst og samarbejdede med androgen ablation

in vitro

in vivo

. Vi fandt, at β-TrCP inhibering fører til opregulering af aryl hydrocarbon receptor (AhR) mediere den terapeutiske virkning. Dette fænomen kunne være liganden uafhængig, da AHR ligand 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) ændrede ikke prostatakræft cellevækst. Vi har detekteret høj AhR udtryk og aktivering i basale celler og atrofiske epitelceller af humane cancer bærende prostata. AhR udtryk og aktivering er også betydeligt højere i tumorceller sammenlignet med godartet kirtelepitel.

Konklusioner /Betydning

Sammen disse observationer tyder på, at AhR aktivering kan være en kræft modvirke mekanisme i prostata. Vi fastholder, at kombinere β-TrCP hæmning med androgen ablation kunne gavne fremskreden prostatacancer patienter

Henvisning:. Gluschnaider U, Hidas G, Cojocaru G, Yutkin V, Ben-Nerijas Y, Pikarsky E (2010) β- TrCP Inhibering Reducerer Prostata Cancer Cell Growth via opregulering af Aryl Hydrocarbon Receptor. PLoS ONE 5 (2): e9060. doi: 10,1371 /journal.pone.0009060

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Oktober 21, 2009; Accepteret: 16 Jan 2010; Publiceret: 5 februar 2010

Copyright: © 2010 Gluschnaider et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, Prostata Cancer Foundation – Israel og Prostata Cancer Research Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den sjette mest almindelige kræftform i verden, og den tredje hyppigste årsag til kræft hos mænd. I de udviklede lande, prostatakræft udvikler sig i en af ​​hver ni mænd over 65 år. Dette er en heterogen sygdom i form af sin kliniske forløb og udfald, men androgen signalering synes at være et fælles træk i sin udvikling og progression [1]. AR signalering er kendt for at regulere normale, godartede og ondartede prostataceller i forskellige processer (fx og -proliferation). Derudover er der observationer indikerer, at AR-ekspression er oncogen i prostata epitel og fremmer progression til androgenuafhængighed [2] – [8]. Den indledende behandling af fremskreden og metastatisk prostatacancer er undertrykkelse af androgen produktion af specifikke lægemidler eller kirurgisk kastration. Senere væsentlige alle patienter udvikler en androgen uafhængig fase, som ikke reagerer på anti hormonbehandling. Sidstnævnte fase er altid dødelig; således, er alternative strategier rettet mod nye molekylære mekanismer påkrævet.

ubiquitin-proteasom system er en afgørende faktor for stort set alle biologiske processer i eukaryoter. I denne vej, er proteiner målrettes til nedbrydning ved kovalent ligering til ubiquitin, et stærkt konserveret lille protein. Protein ubiquitinering involverer samordningen af ​​E1 ubiquitin-aktiverende enzym, et E2 ubiquitin-konjugerende enzym og en E3 ubiquitin-protein-ligase, hvoraf den sidste leverer multiple ubiquitin-molekyler til målproteinet [9] – [11]. Hæmme hele ubiquitin proteasom vej har terapeutisk værdi i kræft (fx Bortezomib, [12]). Men da proteasom inhibitorer har pleiotrope virkninger, kan inhibering af en enkelt tast E3 tilbyde en mere specifik behandlingsmulighed med færre bivirkninger.

Beta-transducin repeats-indeholdende proteiner (β-TrCP) repræsenterer substratgenkendelsessted underenheder for SCF

β-TrCP E3 ubiquitin ligaser. Disse ligaser ubiquitinere phosphorylerede substrater specifikt og spiller en central rolle i reguleringen af ​​celledeling og forskellige signaltransduktionsveje, som igen, er afgørende for mange aspekter af tumorigenese [13]. Der er to β-TrCP gener i mammale genomer koder for de to meget redundante proteiner p-TrCP1 og β-TrCP2. I de senere år blev forskellige p-TrCP substrater involveret i forskellige normale og maligne pathways opdaget [14] – [23]. To godt karakteriseret

bona fide

substrater p-catenin og IKB. Nedbrydning af sidstnævnte frigør NF-KB til trænge ind i kernen og inducerer transkription [11], [24] – [27]. På den anden side, β-catenin phosphoryleres, direkte anerkendt af β-TrCP og nedbrydes af proteasomet [24]. Således har β-TrCP modsatrettede effekter på to centrale onkogene veje. Mens den rolle, β-catenin i prostatacancer er kontroversiel [28], [29], er der beviser for, at NF-KB spiller en pro-tumorigen rolle i prostatacancer [30] – [32]. Den modstående virkning på disse to oncogene proteiner eksemplificerer alsidigheden af ​​denne særlige E3-ligase. Desuden er β-TrCP direkte impliceret i flere kræfttyper [33] – [36], derfor er det plausibelt at yderligere spørge sin rolle i prostatakræft

I dette arbejde, viser vi, at β-TrCP hæmning. hæmmer prostatakræft vækst viser additiv virkning med androgen ablation,

in vitro

in vivo

. Denne effekt er i høj grad medieret via aktivering af aryl hydrocarbon receptor (AhR) som vælte dette protein ophæver effekten af ​​β-TrCP hæmning.

Resultater

NF-KB-aktivering korrelerer med prostatakræft patienternes Outcome

β-TrCP er en vigtig E3 ligase kendt for at regulere mange forskellige substrater. NF-KB er en velkarakteriseret transkriptionsfaktor negativt reguleret af IKB, således indirekte positivt moduleret af β-TrCP. Inddragelsen af ​​NF-KB i prostatacancer er godt undersøgt og tidligere undersøgelser viste sin tumorgen rolle i prostata. Der er også for nylig indikation for NF-KB involvering i progressionen af ​​prostatacancer til androgenuafhængig fase [37]. For at bekræfte relevansen af ​​denne faktor til prostatakræft progression, vi testede dens aktivering stat i primære humane prostatakræft prøver ved anvendelse af immunhistokemisk farvning med antistoffer mod p65 (figur 1A). 131 prostatakræft prøver, spottet på en enkelt væv microarray dias fra patienter med forskellige Gleason kvaliteter blev analyseret. 39% af prøverne viste mindst nogle p65 positive kerner (figur 1B). Vi analyserede også 14 prostatakræft metastaser, hvoraf 64% var positive (figur 1A, B). Vi satte til at evaluere sammenhængen mellem prostatakræft Gleason score og NF-KB-aktivering. Faktisk fandt vi en sammenhæng mellem de to (p = 0,014, Fishers eksakte test). Det fremgik, at NF-KB nuklear farvning var stærkere hos patienter med højere Gleason score eller i metastaser hæve den mulighed, at NF-KB aktivering kan være korreleret med prognose. For at teste denne mulighed, vi immunstained 80 primære tumorer for p65, fra patienter, der undergik radikal prostatektomi, og som vi havde klinisk opfølgning. 77% af de patienter, hvis primære tumor prøver negativt farvet for nuklear p65, viste ingen gentagelse op til 8 år efter radikal prostatektomi. I modsætning hertil sygdommen gentaget i 65% af NF-KB-positive patienter (figur 1C). Et andet vigtigt pro-onkogen β-TrCP substratet er β-catenin. Da β-TrCP inhibering ville øge β-catenin stabilitet og fremme tumorigenese, var det nødvendigt også at overvåge β-catening korrelation til prostatacancerpatienter ‘resultat. Kernelokalisering af β-catenin aktivering korrelerede ikke med sygdomssværhedsgrad i samme kohorte af patienter (figur S1). Samlet set viser disse resultater indebærer, en klinisk fordel til inhibering β-TrCP i prostatacancer. Men de mange p-TrCP substrater (til 37, med muligvis mere identificeres) til hinder for en omfattende analyse af dem alle på samme måde, og nødvendiggør en direkte tilgang til at studere nytten af ​​β-TrCP hæmning i prostatakræft.

prostatakræft sektioner blev immunfarvet hjælp p65 antistoffer. A. Repræsentative mikrofotografier af en primær tumor (til venstre) og lymfeknudemetastaser (højre) fra den samme patient. B. Procent af negative, positive og stærkt positive tilfælde spottet på en væv microarray fra de angivne Gleason score (p = 0,0014, Fishers eksakte test). C. primære prostatatumorer (n = 131) blev immunfarvet for p65 og vurderet for NF-KB-aktivitet. Kaplan-Meier plot afslørede en sammenhæng mellem NF-KB status og risikoen for recidiv. Blå, stærkt farvede prøver; Rød, svagt farvede prøver; Grøn, negative farvede prøver (p = 0,02).

β-TrCP Hæmning Reducerer Prostata Cancer Cell Growth

Vi næste undersøgte effekten af ​​β-TrCP hæmning på prostatakræft cellevækst . Til dette formål har vi konstrueret en doxycyclin inducerbar shRNA lentiviral vector målretning både β-TrCP1 og β-TrCP2 som vi transduceret de to androgensensitive human prostatacancer-cellelinier, LNCaP og LAPC4. Doxycyclinbehandling af de trasnduced LNCaP-celler resulterede i effektiv knock down af både p-TrCP gener (85% og 75% for β-TrCP1 og β-TrCP2 henholdsvis) som bestemt ved anvendelse kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR – figur 2A). Dette var ledsaget af kBa stabilisering både før og efter TNF-stimulering, demonstrerer en effektiv induktion af protein nedregulering (figur 2B). At evaluere konsekvensen af ​​β-TrCP banke ned på prostatacancerceller, monitorerede vi doxycyclin-behandlede og ubehandlede LNCaP-celler i ni dage og måles cellevækst

in vitro

. Figur 2C viser formindsket cellevækst efter enten β-TrCP hæmning eller androgen ablation behandling (nederst til venstre og øvre højre paneler, henholdsvis). Desuden kombinerer β-TrCP inhibering med androgen ablation viser en additiv virkning (figur 2C nederste højre panel og figur 2D). Vi kvantificerede næste cellevækst ved anvendelse af XTT-metoden og bekræftet vores morfologisk analyse (figur 2D). Lignende resultater blev opnået med LAPC4 celler (figur S2). Salg

LNCaP-celler blev inficeret med en lentiviral vektor, som bærer en inducerbar doxycyclin afhængig β-TrCP shRNA. A. Celler blev behandlet i 72 timer med 1 ug /ml doxycyclin og RNA-niveauer af β-TrCP1 og β-TrCP2 blev målt under anvendelse QRT-PCR. B. Western blot-analyse af proteinekstrakter fra celler behandlet med TNF, doxycyclin eller MG-132 blev immunoblottet med enten IKB eller tubulin. C. repræsentativt mikrofotografi af celler behandlet som angivet og farvet med hematoxylin og eosin. D. XTT-assay anvendes til at kvantificere cellevækst på forskellige tidspunkter. DOX, doxycyclin; NT, ingen behandling; FCS, konditioneret medium indeholdende føtalt kalveserum; CSS, konditioneret medium indeholdende androgen depleteret serum (kul strippet serum). Fejllinjer, SD. * Signifikant forskellig fra ikke behandlede celler og fra hinanden, p-værdi. 0,01, t-test

For at udelukke shRNA off target effekter, vi brugte en tidligere beskrevet β-TrCP dominant negative konstruktion mangler F-box-domænet [33]. Denne variant stabiliserer β-TrCP substrater, da det binder phosphorylerede mål, men formår ikke at rekruttere de yderligere komponenter i SCF kompleks, der er kritiske for E3 ligase katalytisk aktivitet. De β-TrCP hæmning effekter ved hjælp af den dominerende negative form var væsentlige svarer til de shRNA resultater (Figur S3A og B).

β-TrCP hæmning samarbejder med androgen ablation

In Vivo

for yderligere at analysere effekten af ​​β-TrCP hæmning på menneskers prostatakræft tumorvækst, vi brugte en xenograftmodel. Vi injicerede LNCaP-celler der bærer en inducerbar β-TrCP shRNA konstruktion i underhuden på 39 immunsupprimerede

Balb /c RAG1

– /- hanmus. 25 i mus (64%) udviklede synlige og målbare tumorer 30 dage efter injektion. Da indledende udvikling tumor var noget uensartet i størrelse og kinetik, vi delt tilfældigt disse 25 mus i fire behandlingsgrupper: 1. Intakt ubehandlede mus (NT, n = 4; betyde tumorvolumen 123,1 ± 70,7); 2. Mus givet tetracyclin i drikkevandet resulterer i β-TrCP inhibering (Tet, n = 5; betyde tumorvolumen 80,3 ± 98,2); 3. Kastrerede mus resulterer i androgen ablation (Cast, n = 7; betyder tumor volumen 121,6 ± 95,0); 4. Kastration plus tetracyclin (Cast + Tet, n = 8; betyde tumorvolumen 180,3 ± 143,9). Der var ingen signifikant forskel i den gennemsnitlige tumorstørrelse ved påbegyndelse af behandling mellem de fire grupper. Vi overvågede tumorvækst gang om ugen, og aflivet musene 30 dage efter den første behandling. RNA ekstraheret fra tumorer fra Tet behandlede mus udviste β-TrCP banke ned i området fra 50% til 80% (figur 3A). Svarende til vores

in vitro

resultater, inhibering β-TrCP reducerede tumorvækst med eller uden androgen ablation (figur 3B). Analyse af tumorproliferation hjælp BrdU-immunfarvning viste, at mus behandlet med både androgen ablation og β-TrCP inhibering viste de laveste opformeringsrater (figur 3C og fig S4). Tumorvækst suppression kunne ikke forklares via apoptose, da anti spaltet caspase-3 immunfarvning ikke afslørede forskelle mellem behandlingsgrupper (figur 3D). Lignende resultater blev opnået med AT2.1 rotte prostatacancerceller stabilt transficeret med et inducerbart dominant negativ β-TrCP transgen (fig S2B). Afslutningsvis vores resultater viser, at β-TrCP hæmning undertrykker prostatakræft vækst både

in vitro

in vivo

og viser en additiv virkning med androgen ablation.

LNCaP celler bærer en tetracyclin induceret β-TrCP shRNA konstruktion blev injiceret subkutant til immunsupprimerede

RAG1

– /- mus. Mus (n≥4 i hver gruppe) var enten ubehandlede (NT), behandlet med tetracyklin i deres drikkevand (Tet), fysisk kastreret (Cast) eller begge (Cast + Tet) i 30 dage. Tumorvolumener blev målt ugentligt. (EN). QRT-PCR for både p-TrCP isoformer blev udført på RNA ekstraheret fra tumorerne høstet på dag 30. (B) tumorvækst kinetik. Vævssnit blev farvet for BrdU (C) eller aktiveret caspase 3 (D) og celleproliferation og apoptose scorer henholdsvis blev bestemt for hver tumor. Vist er middelværdi ± standardafvigelse (A) eller ± S.E.M (B, C og D) * p-værdi. 0,05, ** p-værdi = 0,0002, t-test; p-værdi i C refererer til t-test.

Aryl Hydrocarbon receptor (AhR) opreguleres ved β-TrCP hæmning og androgen ablation

For at belyse de molekylære veje, der er ansvarlige for væksten inhibitoriske virkning af β-TrCP udtynding i kombination med androgen ablation vi gennemført en lang række microarray analyse. LAPC4 celler inficeret med shβ-TrCP lentiviral vektor, var enten ubehandlede eller behandlet i 72 timer med doxycyclin, trækul strippet serum eller begge. cDNA prøver blev underkastet microarray analyse ved anvendelse U133 Affimetrix chips sondering ~30,000 probesæt. Vi derefter søgte at identificere gener, som er samvirkende berørt af både androgen ablation og β-TrCP hæmning. Blandt de opreguleres gener, var potentielle anti inflammatoriske gener (fx ANXA1) og blandt de fremtrædende nedreguleret var prostata specifikke gener (fx KLK2). Men den mest dramatiske stigning var ekspressionen af ​​aryl carbonhydrid (dioxin) receptor (AhR). Dette gen blev opreguleret af enten androgen ablation eller β-TrCP hæmning og var den mest forandrede gen skyldes den kombinerede behandling (figur 4). Vi kunne tilskrive AhR niveau opregulering til p-TrCP udtømning, da doxycyclin alene ikke ændrede receptorens mRNA (figur S5).

A. LAPC4 celler inficeret med inducerbar β-TrCP shRNA blev behandlet i 72 timer med den angivne behandling, underkastes RNA-ekstraktion og cDNA microarray analyse (Affymetrix). Efter data normalisering blev genekspressionsprofiler sammenlignet mellem behandling og de ubehandlede kontrolprøver. A. Heat map dendrogram der viser ti mest op (rød) og ned (grøn) regulerede gener på grund af den kombinerede behandling. Fold ændring refererer til den kombinerede behandling prober værdier i forhold til kontrol. Ekspression af p-TrCP isoformer er vist nedenfor. B. LAPC4 celler inficeret med den samme lentiviral vector og behandles som anført blev udsat for RNA-ekstraktion og QRT-PCR-analyse med de anførte primere. CSS, trækul strippet serum; DOX, doxycyclin; Fejl barer, SD.

Ahr er en ligand aktiveret transskription faktor involveret i organogenese, i afgiftning af endo- og miljøfremmede stoffer og mediere forskellige organspecifikke toksiske reaktioner af dioxin. Denne receptor tilhører den grundlæggende helix- loop-helix (bHLH) /PAS (Periode -aryl kulbrinte receptor nukleare translokatoren-Single minded) familie af heterodimere transkriptionelle regulatorer. bHLH /PAS proteiner er involveret i kontrollen af ​​forskellige fysiologiske processer, såsom døgnrytmer, organudvikling, neurogenese, metabolisme og stress respons på hypoxi [38] – [40]. Nylige undersøgelser viste en sammenhæng mellem Ahr vej og prostatakræft både

in vitro

in vivo

, der viser, at AhR interagerer og hæmmer AR. Desuden Ahr fungerer som en E3-ligase af AR [41] og AhR

null Salg TRAMP-mus viser øget prostata tumorigenese [42]. Vi bruges QRT-PCR til at validere cDNA array analyse. Vi fandt, at mens hver behandling alene øgede AhR RNA-niveauer mere end 2 folder, den kombinerede behandling resulterede i mere end 4 gange opregulering i både LAPC4 (figur 4B) og LNCaP-celler (figur S6). For at teste den funktionelle aktivitet af AHR pathway målte vi mRNA-niveauerne i dens kanoniske target cytochrom P450 1A1 (CYP1A1). Vores analyser viser, at CYP1A1 niveauer blev forøget i sammenhæng med Ahr niveauer i de 4 behandlingsgrupper (figur 4B). Det skal bemærkes, at denne opregulering skete uden tilsætning af et eksogent AhR ligand. Tilsætning af den potente AhR ligand TCDD forøges yderligere CYP1A1 opregulering (figur 5C og data ikke vist).

LNCaP-celler inficeret med en inducerbar lentiviral vektor til Shahr alene (A) eller sammen med shβ-TrCP (B) var behandlet i 72 timer med den angivne behandlinger og cellevækst blev målt ved XTT-assay. C. QRT PCR bekræftede β-TrCP og AhR effektiv vælte. D. Western blots viser stabilisering β-catenin efter β-TrCP hæmning og bekræfter AhR proteinniveau elevation eller vælte på grund af relevante shRNAs. DOX, doxycyclin; FCS, føtalt kalveserum; CSS, trækul strippet serum. Fejl barer, SD.

Den Vækstsuppression Effekt af β-TrCP Hæmning medieres via opregulering af Aryl Hydrocarbon Receptor

For at undersøge betydningen af ​​AhR-aktivering efter β- TrCP udtømning, vi først inficeret LNCaP celler med inducerbare AhR shRNA. Mens doxycyclin behandling resulterede i reducerede AhR mRNA-niveauer kunne vi ikke finde nogen virkning på cellevækst (figur 5A). Næste vi samtidig er inficeret LNCaP celler, som bærer inducerbare β-TrCP shRNA med den inducerbare AhR shRNA vektor. Tilsætning af doxycyclin til mediet af dobbelt knockdown-celler resulterede i reducerede β-TrCP mRNA niveauer, der svarer til de enkelte knockdown-celler; Endnu som forventet, i disse celler Ahr niveauer blev reduceret snarere end øget både på mRNA og protein niveauer (figur 5C, D). Således er de dobbelte Knockdown celler tillade os at teste om vækstinhiberende virkning af β-TrCP modulation medieres via AhR opregulering. Faktisk, i de dobbelte Knockdown LNCaP-celler, β-TrCP udtømning undladt at reducere cellevækst enten med eller uden androgen ablation (figur 5B). Lignende resultater blev opnået med en anden shRNA målrettet mod AHR (data ikke vist). Interessant, tilsætning af den potente exogene ligand TCDD reducerede ikke cellevækst alene; heller ikke havde en virkning med en af ​​de forskellige behandlinger (fig S7). Dette antyder, at dette AhR effekt er ligand uafhængige. Western blot-analyse bekræftede stabilisering β-catenin og Ahr mRNA opregulering ved β-TrCP inhibering (figur 5C). Således de dobbelte knockdown resultater indikerer, at det meste af effekten af ​​β-TrCP knockdown medieres af opregulering af AHR.

AhR Ekspression i prostatacancerpatienter Salg

Observing AhR opregulering ved β-TrCP inhibering i prostatacancerceller fik os til at inspicere AhR status i forskellige stadier af prostatacancer. For at løse dette mål, vi samlet 39 eksemplarer af primære prostatakræft tumorer fra Hadassah Medical Center. Ud af denne kohorte, led 17 patienter fra recidiv. Vi udførte immunohitochemical anti AhR farvning og overvåges cytoplasmatisk og nuklear AhR udtryk. Først, vi har registreret høj AhR i basale celler beliggende i den godartede kirtel perimeter (figur 6A). Interessant proliferativ inflammatorisk atrofi (PIA), betragtes som en forløber læsion til prostatakræft udviste meget stærk cytoplasmatisk og nukleær farvning (figur 6B). Vi anvendte en subjektiv score fra 0 til 3 for at kvantificere farvningsintensitet i normale og maligne epitelceller i hver prøve. Vores analyse viser opregulering af AhR i både de cytoplasmiske og nukleare steder i den maligne epitel (figur 6C, D, P 0.001, Mann-Whitney test). Men vi ikke observere en sammenhæng mellem AhR ekspression i tumorceller og recidiv (data ikke vist).

Prostata sektioner blev immunfarvet med AhR antistof. Mikrofotografier viser stærk AhR ekspression i basale celler (pile i A) og proliferativ inflammatorisk atrofi (B). C. Højere AhR ekspression bemærkes i maligne kirtler (T) sammenlignet med normale kirtler (N). D. Normal og maligne kirtler blev scoret med en 0-3 skala. Middelværdier ± standardfejl. er vist (p-værdi 0,001, Mann-Whitney-test).

Diskussion

Prostatakræft er en heterogen sygdom, omfattende mange genetiske og fænotypiske egenskaber. Et vigtigt kendetegn for prostatacancer er progression til en androgen uafhængig trin (AI) efter hormonbehandling. Årsagerne til denne overgang er ikke fuldt forstået og adjuverende behandlinger styrkende hormonal manipulation er påkrævet. En faktor, der ofte impliceret i tumorudvikling i mange typer af kræft er NF-KB. Her bekræfter vi, at NF-KB ofte aktiveres i fremskreden prostatacancer-patienter (figur 1). Desuden NF-KB-aktivering korrelerer med prostatakræft tilbagefald (figur 1C). En af de store regulatorer af NF-KB er E3 ubiquitin ligase SCF

β-TrCP, som er rettet mod IKB samt mange andre substrater for ubiquitinering og nedbrydning, [27]. P-TrCP menes at spille en pro-tumorigen rolle i visse typer af kræft [43]. Baseret på observerede opregulering af NF-KB, var det vigtigt at følge en anden fælles pro-onkogen β-TrCP substrat, β-catenin, hvilket også var impliceret i prostatakræft [28], [29], [44]. Men vi kunne ikke finde en sammenhæng mellem β-catenin aktivering og prostatakræft tilbagefald (figur S1), hvilket tyder på, at kun nogle p-TrCP mål er af relevans for sygdomsprogression. For at evaluere det fulde omfang af p-TrCP effekter, vi satte os for at hæmme β-TrCP i prostatacancerceller og overvåge dens virkning på prostatakræft cellevækst. Vores

in vitro

in vivo

undersøgelser viste, at ved β-TrCP hæmning prostatakræft cellevækst reduceres. Vi kunne også påvise en additiv virkning ved kombination af β-TrCP inhibering med androgen ablation (figur 2 og 3). For at belyse de mekanismer for væksthæmning ved β-TrCP inhibering gennemførte vi et cDNA array analyse og observeres en additiv opregulering af AHR (figur 4). AhR er tidligere påvist at fungere som en E3 ligase af AR [41], hvilket giver os en mulig forbindelse til AR signalering. Desuden har vi bemærket, at AhR udtryk er højere ved at kombinere androgen ablation og β-TrCP hæmning. Vores hypotese derfor, at opregulering af Ahr kunne mediere vækstinhiberende virkning af β-TrCP knockdown i prostatacancerceller. Dette begreb blev støttet af tidligere rapporter, som viser en hæmmende rolle for AhR vej i prostatakræft. Morrow

et al

viste en AhR ligandafhængig vækstinhibering i LNCaP-celler. Ligeledes har andre undersøgelser også impliceret androgenreceptoren i Ahr vækstinhibering [45], [46]. I vores undersøgelse vælte Ahr

per se

i LNCaP-celler ikke ændrede prostatakræft cellevækst (figur 5A), hvilket antyder, at de basale niveauer af AhR ikke udøver en inhibitorisk virkning, medmindre stimuleret af ligand. På den anden side øge AhR ekspression via β-TrCP depletering var forbundet med betydelig ligand-uafhængig vækst suppression. AhR udtømning vendt væksten undertrykkelse effekt af β-TrCP knockdown, selv under androgen ablation, der beviser, at AhR opregulering, som vi også bemærket i andre stress (f.eks atrofi, inflammation og androgen ablation) tegner sig for den β-TrCP hæmmende virkning (figur 5). Interessant, havde ligand administration ikke påvirke cellevækst, selvom det gjorde opregulere udtryk for den klassiske AhR pathway target CYP1A1. Disse resultater implicerer en ligand og CYP1A1 uafhængig AhR vej i prostata kræftceller.

Chesire

et al

identificeret Ahr som en formodet β-catenin mål i LNCaP celler [47]. Som vi vise, at β-TrCP depletion stabiliserer β-catenin sammen med opregulering af AhR (figur 5D), er det muligt, at årsagen til AhR elevation efter β-TrCP depletion er β-catenin stabilisering.

Vores undersøgelser viser en ny ligand uafhængig strategi for at øge AhR udtryk som middel til at undertrykke prostatakræft vækst. Denne strategi kan også gentaget i den naturlige historie af prostatakræft. Vi fandt, at AhR normalt udtrykkes i lave niveauer i den prostatiske epitel basale celler (cytoplasmatisk og nukleær farvning, figur 6A) og i det væsentlige opreguleret i områder af proliferativ inflammatorisk atrofi (PIA), betragtes en forløber læsion til kræft (figur 6B). AhR aktivering i basal og atrofiske celler kan derfor ses som en anticancer mekanisme. Det er muligt, at microenvironmental inflammatoriske signaler er ansvarlig for denne stress induceret signalering. En mutation i én allel af β-TrCP1 blev identificeret i ét human prostata tumor i en systematisk skærm af Wnt pathway mutationer [48]. Men denne mutation er usandsynligt, at have en virkning på NF-KB vej som den anden allel og muligvis både β-TrCP2 alleler var vildtype. Tilsvarende til vores viden, aktiverende mutationer i NF-KB-vejen blev hidtil ikke rapporteret i humane prostatatumorer. Ikke desto mindre er NF-KB vides at mediere malign transformation konstitutivt opreguleret i denne tumortype via flere mekanismer. Vi konkluderer, at forskellige stress-signaler, herunder inflammation, atrofi og androgen ablation opregulere AhR udtryk i både normale og maligne prostata celler og føre en beskyttende mekanisme. Hæmme β-TrCP ved fremskreden sygdom stadier kan være relevant i at udvikle strategier for at øge effekten af ​​prostatakræft behandlinger.

Materialer og metoder

Etik Statement

Forsøg med humane væv blev godkendt af Institutional Review Board, Hadassah-Hebrew University Medical center. På grund af den tilbagevirkende kraft af denne undersøgelse og i henhold til erklæringen fra Helsinki, deltagerne blev ikke opnået konstant informeret. Desuden er vores IRB frafaldes behovet for skriftligt informeret samtykke. Alle mus eksperimenter blev godkendt af IACUC.

Dominant Negativ β-TrCP (WD)

Dominant negativ β-TrCP (WD)

blev klonet ved hjælp E3RS udelukket fra pCDNA3 -EE-hE3RS plasmider med primerne 5 ’til 3′ frem: GCGGCCGCTATGGACCC-GGCCGAG (med

NotI

websted i sin 5 ‘); omvendt: TTATCTGGAGATGTAGGTGT; produktet blev klonet i TA-vektoren (Invitrogen). Den sidste vektor blev skåret med

AvrII /Asp718

, udfyldt og stump ligeret. Den relevante fragment blev skåret og indsat i pFLAG-CMV ™ -2 ekspressionsvektor (Sigma-Aldrich) med

NotI /BamHI

. Denne procedure produceret en WD konstruktion mangler en del af F-box og konjugeret til FLAG. WD-FLAG blev indsat under tovejs teracycline promotor udtrykker GFP. Det resulterende plasmid blev transficeret ind AT2.1 Rat prostatacancerceller, der udtrykker tetracyklin trans-aktivator, ved anvendelse af Fugene reagens (Roche Applied Science). De transficerede celler blev selekteret under anvendelse af hygromycin og neomycin (Sigma-Aldrich) indeholdende medier for at fremstille en stabil klon, der udtrykker en dominant negativ β-TrCP ved tilsætning af tetracyclin eller dets derivat doxycyclin.

Inducerbar β-TrCP og AhR shRNA

Den menneskelige shRNA 5’GUGGAAUUUGUGGAACAUC 3 ‘rettet mod β-TrCP1 og β-TrCP2 blev bygget i PTER plasmid og indsat i en modificeret pRRL.sin.PPT.tetO7.MCS.PRE lentiviral vektor. Vektoren består af en HI-promotor, tet-operator, den shRNA kodende sekvens og eF1α promotor, der driver tet repressor fusioneret til eGFP. Virusproduktion og infektion blev udført som tidligere beskrevet [49]. For at målrette Ahr brugte vi følgende shRNA sekvenser: 1. 5 ‘CAGCUGAAUUAAAUAACAU 3’; 2. 5 ‘CAGACAGUAGUCUGUUAUA 3’. Som begge viste sig at være effektive i at banke ned receptoren (de præsenterede data repræsenterer dem opnå med sidstnævnte sekvens). shRNA udtryk induceres først efter Tetracyklin eller Doxycyclin (Sigma-Aldrich) administration. Vektoren alene blev anvendt som kontrol. Dobbelt slået ned LNCaP celler blev designet af co-inficerende shβ-TrCP celler med lentivirale vektorer, der bærer enten af ​​den ovenfor beskrevne sekvens.

Cell Culture

DMEM, RPMI 1640, trypsin EDTA, penicillin-