PLoS ONE: Beclin 1 og UVRAG give beskyttelse mod stråling-induceret DNA Skader og Vedligehold centrosom Stabilitet i Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

Beclin 1 interagerer med UV-bestråling-resistens-associerede gen (UVRAG) at danne centrale komplekser, der inducerer autofagi. Mens celler med defekte autofagi er tilbøjelige til genomisk instabilitet, der bidrager til tumorigenese, er det uvist, om Beclin1 eller UVRAG kan regulere DNA-skade /reparation respons på kræftbehandling i etablerede tumorceller. Vi fandt, at siRNA knockdown af

Beclin 1

eller

UVRAG

kan øge stråling-induceret DNA dobbelt strengbrud (DSBs), vist ved Patm og γH2Ax og fremme tarmkræft celledød. Desuden knockdown af

Beclin 1

,

UVRAG

eller

ATG5

øgede procentdelen af ​​bestrålede celler med nukleare foci udtrykker 53BP1, en markør for ikke-homolog ende sammenføjning, men ikke RAD51 ( homolog rekombination), sammenlignet med kontrol siRNA.

Beclin 1

siRNA viste sig at dæmpe UVRAG udtryk. Celler med en

UVRAG

deletionsmutanten defekt i Beclin en binding viste øget stråling-induceret DSBs og celledød sammenlignet med celler med ektopisk vildtype

UVRAG

. Knockdown af

Beclin 1

eller

UVRAG

men ikke

ATG5,

resulterede i en betydelig stigning i centrosom nummer (γ-tubulin farvning) i bestrålede celler sammenlignet med kontrol siRNA . Tilsammen indikerer disse data, at Beclin 1 og UVRAG give beskyttelse mod stråling-induceret DNA DSBs og kan opretholde centrosom stabilitet i etablerede tumorceller

Henvisning:. Myung Park J, Tougeron D, Huang S, Okamoto K, Sinicrope FA (2014) Beclin 1 og UVRAG give beskyttelse mod stråling-induceret DNA Skader og Vedligehold centrosom Stabilitet i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 9 (6): e100819. doi: 10,1371 /journal.pone.0100819

Redaktør: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, USA

Modtaget: Februar 5, 2014 Accepteret: 29 maj 2014; Udgivet: 23 Jun 2014

Copyright: © 2014 Myung Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute (5 K05 CA142885 og CA113681, både til FAS). DT er en modtager af økonomisk støtte fra Multi-Organisatorisk tematiske Institut for Cancer og den franske National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Macroautophagy er en kataboliske, lysosomal nedbrydningsvej der opretholder cellulær biosyntese under metaboliske, hypoxisk, eller cytotoksisk stress [1]. En vigtig regulator af autofagi er Beclin 1, hvis protein er et centralt element i klasse III-PI3K /Vps34 kompleks, der er nødvendig for autophagosome dannelse og modning [2]. Beclin 1 interagerer med adskillige proteiner, herunder Autophagy regulatorer, organel membran-anker proteiner og Bcl-2 og Bcl-x

L. En coiled-coil domæne Beclin en tjener som et protein interaktion platform til at rekruttere to store autofagi regulatorer, Atg14 og UV-stråling modstand-associerede gen (

UVRAG

) produkt [3]. UVRAG, oprindeligt identificeret gennem sin evne til at komplementere UV-stråling følsomhed i tumorceller, forbinder med Beclin 1-Bd-2-PI (3) KC3 multiproteinkompleks hvor det og Beclin 1 interagerer via deres spole spole domæne (CCD) og indbyrdes afhængighed fremkalde autophagy [4].

Beclin 1

og

UVRAG

funktion som tumorsuppressorgener, og

Beclin 1

+/-

mus viste sig at være tumor-tilbøjelige [5]. Beclin 1 kort til en region på kromosom 17q21, og

Beclin 1

[6] og

UVRAG

[7] er monoallelically slettet i visse kræftformer. Allelisk tab af

Beclin 1

og defekte autofagi blev vist at sensibilisere cellerne til metabolisk stress [8], og aktivere DNA beskadigelse respons i association med aneuploidi i immortaliserede murine epitelceller og i brysttumorer [8].

i etablerede tumorer, er basal autophagy opreguleret at overleve metaboliske, hypoxiske eller cytotoksisk behandling stress, hvilket indikerer, at autophagy kan tjene som en mekanisme for terapeutisk modstand [9]. Autophagy hæmning er blevet vist at forøge cancercelle følsomhed over for kemoterapi eller strålebehandling, oprettelse autophagy som en ny mål for terapi [10], [11]. Nylige data viser, at celler med defekte autofagi er tilbøjelige til genomisk ustabilitet med øget DNA-skader og aneuploidi [8], [12]. Men, der understøtter en rolle for autophagy i genom beskyttelse i etablerede kræftformer er begrænset, og den rolle, Beclin 1, hvis nogen, er ukendt. Det er blevet rapporteret, at UVRAG spiller en dobbelt rolle ved kromosomal stabilitet, der viste sig at være uafhængig af autofagi [13]. Cancerterapier inducerer DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs), som aktiverer DNA-reparationsmekanismer herunder ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) og homolog rekombination (HR) til at gendanne genomisk integritet [14]. De seneste data viser, at UVRAG kan fremme DNA DSB reparation ved direkte binding og aktivering DNA-PK i NHEJ [13]. Histon H2AX, et substrat af ataxi telangiectasia muteret (ATM) og DNA-afhængig proteinkinase (DNA-PK) (nøgleenzym i NHEJ), phosphoryleres på serin 139 og danner foci på DSB sites, der kan tjene som en markør for DSB’er [ ,,,0],15]. Vedligeholdelse af genomisk integritet kræver ordentlig kromosom segregering under celledeling, som i høj grad afhænger samling af mitosespindelen apparatet ved centrosomer. Ekstra centrosomer næsten uundgåeligt forårsage spindel misdannelser og fejlagtig kromosomal segregering [16], som respons på DNA-skade, kan føre til aneuploidi og genomisk ustabilitet [17]. Defekter i gener involveret i DNA-reparation, har vist sig at forårsage afvigelser i centrosom nummer, der er fælles i humane tumorer [18].

Selvom rollen som Beclin 1 og UVRAG er blevet undersøgt i fastsættelsen af ​​tumorigenese [4 ], [13], [19], lidt om deres rolle i reguleringen af ​​genomisk stabilitet og den potentielle betydning af deres samspil i denne proces i etablerede tumorer. At få indsigt i mekanismen (er), hvorved tumorceller autofagi kan bibringe behandlingsresistens undersøgte vi evnen hos Beclin 1 og /eller dets cofaktor UVRAG at regulere DNA beskadigelse respons og centrosom nummer i kolorektal cancer (CRC) cellelinier. CRCs er meget modstandsdygtige over DNA-beskadigende behandlinger såsom cytotoksisk kemoterapi og stråling, som er almindeligt gives samtidig i klinikken. I denne forbindelse er vi tidligere rapporteret, at Beclin 1 overekspression var forbundet med reduceret overlevelse hos patienter med tyktarmskræft behandlet med 5-fluorouracil som supplerende behandling [20]. I den aktuelle undersøgelse fandt vi, at Beclin 1 og UVRAG interagere at regulere DNA-skade /reparation, der udnytter ikke-homolog ende sammenføjning og opretholder centrosom stabilitet som respons på stråling. En

UVRAG

deletionsmutanten defekt i Beclin 1 undlod binding at beskytte mod DSBs demonstrerer betydningen af ​​deres samspil i opretholdelsen af ​​genomisk stabilitet.

Materialer og metoder

Cell Culture , Drugs, reagenser og Cell Stråling

Humane colorektale cancercellelinier, HT-29 og DLD1, og HeLa cervikale carcinomceller blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotikum /antimykotikum. 293T-celler blev dyrket i DMEM (Sigma Chemical Co.) og suppleret som ovenfor. Alle cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC) og tidligere beskrevet [21], [22], med undtagelse af Hela-celler, der blev opnået fra Dr. S. Kaufmann på Mayo Clinic [23]. Celler blev behandlet med 5-fluorouracil, bafilomycin A1 (Sigma, B1793), og spautin-1 (Cellagen Technology, C3430-2s) som angivet. Lægemidler blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO), som også blev anvendt som en behandling kontrol. Cellerne blev også behandlet med ioniserende stråling med en cæsium 137 kilde på en MARK 1-25 bestråler (JL Shepherd and Associates).

Små interfererende RNA (siRNA)

Celler blev transficeret med siRNA oligonukleotider hjælp Lipofectamine RNAiMAX Reagent (Invitrogen) og målretning sekvenser for

Beclin 1 Hotel (GGGTCTAAGACGTCCAACA),

cytosol-associeret protein let kæde 3 B Hotel (

LC3B

) (GAAGGCGCTTACAGCTCAA),

UVRAG

(TCACTTGTGTAGTACTGAA), og

autophagy protein 5 fotos (

ATG5

) (GGCATTATCCAATTGGTTT) i henhold til producentens protokol. For at udføre dobbelt knockdown blev celler transficeret med to siRNA oligonukleotider rettet mod forskellige proteiner, 24 timer i mellem for celler at komme sig.

Lentiviral Short Hårnål RNA

Kort hårnål RNA (shRNA) template-oligonukleotider ( syntetiseret af Mayo Clinic molekylærbiologi Core Facility) blev ligeret i lentivirale shRNA kloning og ekspression vektor pSIH1-H1 (System Bioscience, Mountain View, CA. kontrol shRNA sekvens var CAACAAGATGAAGAGCACCAA (Sigma). den targeting sekvens for ubiquitin-peptidase 10 (

USP10)

var GCCTCTCTTTAGTGGCTCTTT lentivirus produktion under anvendelse 293T-celler og transduktion af målceller blev udført som tidligere beskrevet [24] puromycin (2 ug /ml; Sigma, P8833).. blev tilsat ved 48 timer post- transduktion, og puromycin-resistente celler blev udnyttet.

Ektopisk ekspression af retroviral

UVRAG

cDNA af

UVRAG

(Origene) subklonedes i pBabe- puro vektor med en N-terminal 3-tag. Frembringelsen af ​​en muteret

UVRAG

med udeladelse af coil-domæne (

ΔCCD

) [25] blev opnået ved PCR under anvendelse af overlappende primere der spændte over området af interesse. Pseudo-indtastet retrovirus blev produceret ved hjælp af disse

UVRAG

konstruerer pr en tidligere beskrevet procedure [24]. Aminosyrer 144-269 blev slettet for at opnå den

UVRAG ΔCCD

mutant.

Cell Levedygtighed og apoptose Analyser

3-4,5-dimethylthiazol-2-yl ) -5- (3-carboxymethoxyphenly) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) kolorimetrisk assay blev anvendt til måling af cellelevedygtighed. Apoptose assay blev udført under anvendelse af annexin V /PI-farvning og caspase-3-spaltning, som beskrevet tidligere [22].

immunblotting

Proteinprøver blev fremstillet og derefter sat på en SDS-PAGE-gel med elektroforetisk overførsel på en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Bio-Rad), som tidligere beskrevet [24]. Antistoffer mod følgende proteiner blev udnyttet: Beclin 1, kløvet caspase-3, γH2Ax, H2AX, pCHK2, LC3, UVRAG, ATM (alle fra Cell Signaling Technology, 1:1000), γ-tubulin, Patm (EPITOMICS, 1:2000 ) og P62 (MBL, 1:2000). Protein bands kvantificeres og normaliseret mod γ-tubulin hjælp ImageJ (National Institute of Health).

Klonogen Survival Assay

To hundrede celler blev podet i hver brønd af en seks-brønds plade og derefter bestrålede (4 Gy) alene eller i nærvær af 5-fluoruracil (5-FU) (2 uM). Efter inkubation i 7-14 dage blev celler fikseret med 10% methanol /10% eddikesyre og derefter farvet med 0,4% krystalviolet i 10% methanol. Antallet af kolonier med 50 celler blev bestemt og udtrykt som den relative ændring i lægemiddelbehandlede

vs

ubehandlede celler

Immunopræcipitation

Celler blev lyseret i CHAPS buffer. [5 mmol /l MgCl

2, 137 mmol /L KCI, 1 mmol /l EDTA, 1 mmol /L EGTA, 1% CHAPS, 10 mmol /l HEPES (pH 7,5)] i 30 minutter på is og derefter klaret ved centrifugering ved 17.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Lysater blev inkuberet med et antistof natten over ved 4 ° C. Antigen /antistof-kompleks blev taget med magnetisk protein A /G-perler (Thermo Scientific) i 2 timer ved 4 ° C. Ubundne proteiner blev vasket tre gange med 1 ml CHAPS puffer uden proteasehæmmere. Bundne proteiner på perler blev elueret ved inkubation i LDS prøvebuffer i 10 minutter og blev efterfølgende lastes til immunblotting.

Immunofluorescens og konfokal mikroskopi

Celler blev dyrket i glas-bund skåle overtrukket med poly- L-lysin (MatTeck Corp.) og efterfølgende eksponering for y-stråling (2-8 Gy). Celler blev fikseret i 10 minutter med 4% paraformaldehyd, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i PBS, og blokeret i 3% bovint serumalbumin (BSA). Derefter blev cellerne farvet med primære antistoffer mod 53BP1 (Cell Signaling Technology, 4937, 1:100), eller RAD51 (Calbiochem, PC130, 1:100), efterfulgt af tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488 eller 568, Molecular Probes, Invitrogen). Prøver blev skyllet, nedsænket i 0,05 ug /ml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 5 minutter, og monteret med dækglas under anvendelse Prolong Gold (Invitrogen). Fluorescens konfokal mikroskopi blev udført ved hjælp af en Axiovert 100 M mikroskop udstyret med en Plan Apochromat 63 X /1.4 objektiv og Zeiss LSM510 software (Carl Zeiss). Procentdelen af ​​celler, der indeholder mere end 10 nukleare fluorescerende foci pr totale celletal blev beregnet ved at undersøge mindst 100 celler i fem områder ved 63X for hver eksperimentel betingelse.

Til farvning af centrosomer, cytoplasmatisk tubulin blev udtømt med en stabilisering mikrotubulus-buffer (3 moll /L EGTA, 50 mmol /l Pipes, 1 mmol /l MgSO

4, 25 mmol /L KCI). Celler blev fikseret i 10 minutter i -20 ° C methanol [26], permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i PBS, og inkuberet i en blokerende buffer (5% gedeserum, 1% glycerol, 0,1% BSA, 0,1% fisk hud gelatine). Derefter blev cellerne farvet med et primært antistof mod γ-tubulin (Sigma, GTU-88, 1:5000) efterfulgt af tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer. Procentdelen af ​​celler med mere end 2 centrosomer blev bestemt ved anvendelse af en fluorescerende mikroskop, hvorved mindst 100 celler i fem felter ved 63X blev talt for hver eksperimentel betingelse.

Statistisk analyse

Statistiske sammenligninger til eksperimenter i dyrkede celler blev udført ved anvendelse af t-test. Statistiske tests var to-sidet med et signifikansniveau defineret på

P.

0,05

Resultater

cytobeskyttende Effekt af

Beclin 1

i celler udsat for 5-FU og /eller stråling

Vi afgøres, om undertrykkelse af Beclin 1 kan forbedre chemoradiation-induceret cytotoksicitet. Tyktarmskræft cellelinjer blev behandlet med γ-stråling (4 Gy) alene eller kombineret med 5-FU (2 uM). I behandlede celler,

Beclin 1

knockdown

vs

kontrol siRNA blev vist at reducere cellernes levedygtighed (fig. 1A, B,

venstre paneler

).

Beclin 1

knockdown faldt også langsigtet klonogene celle overlevelse efter stråling ± 5-FU i forhold til celler med kontrol siRNA (Fig. 1A, B,

højre paneler

). I disse eksperimenter tilsætning af et klinisk opnåelig dosis af 5-FU havde en minimal effekt på omfanget af strålingsinduceret celledød.

A, B,

HT-29 (A) eller DLD1 (B) celler blev transficeret med

Beclin 1

vs kontrol siRNA og behandlet med stråling (RT; 4 Gy) alene eller kombineret med 5-FU (2 uM). Resultaterne af MTS (24 h), og klonogene overlevelses assays er vist. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse for eksperimenter udført i triplikat. Statistisk signifikans blev bestemt ved en tosidet Students t-test og defineret som *

P

0,05.

C

, Cells med

Beclin 1

eller kontrol siRNA blev bestrålet (4 Gy) og derefter blev undersøgt for ekspression af LC3I-II, γH2Ax og kløvet caspase-3 ved immunoblotting på 24 timer . Proteinbånd kvantificeres og relativ intensitet blev mærket under det tilsvarende blot. Kun LC3II blev kvantificeret for LC3 protein.

D,

Tidsforløb af effekten af ​​stråling på Patm udtryk i celler med

Beclin 1

siRNA vs kontrol siRNA.

E

, Effekt af

Beclin 1

siRNA på autophagic flux i celler, der blev behandlet med RT (4 Gy) og /eller 5-FU (4 uM).

for at afgøre, om Beclin 1 kan regulere DNA skade responset undersøgte vi effekten af ​​stråling ved ekspression af DSB markører phosphorylerede histon H2AX (γH2Ax) [27] og phosphoryleret ataksi telangiectasia muteret (Patm). ATM er en kritisk sensor DNA-skader, der er involveret i DNA-reparation og G2-til-M checkpoint kontrollen [28], og hvis aktivering kræver sin autophosphorylering [29]. Undertrykkelse af

Beclin 1

af siRNA forøget γH2Ax ekspression todelt, induceret Patm og øget caspase-3 spaltning (2 gange) i celler udsat for stråling sammenlignet med kontrol siRNA (Fig. 1C, D). Modulering af γH2AX ved 24 timer sandsynligvis repræsenterer ikke-repareret, residual DNA-skade efter bestråling. Vi derefter afgøres, om

Beclin 1

siRNA kan hæmme stråling-induceret autophagic flux. Brug af bafilomycin A1, der inhiberer vakuolær H + ATPase, observerede vi akkumulering af cytosolisk (LC3I) og membranbundet (LC3II) former af LC3 (fig. 1E), hvis forholdet er korreleret med omfanget af autophagosome formation [1], [30]. I celler behandlet med 5-FU + stråling og bafilomycin A1,

Beclin 1

knockdown blev vist sig at svække akkumuleringen af ​​LC3I-II sammenlignet med kontrolceller og øge ekspression af autofagi substrat P62 /sequestosome1 [24] overensstemmelse med hæmning af autophagic flux (fig. 1E).

Vi derefter bestemmes evne Beclin 1 og UVRAG at modulere DNA skade responset i bestrålede celler. Angivelse af 53BP1 er en sensor til DNA-skader og en formidler af NHEJ [31], mens RAD51 er en kritisk regulator af DNA-reparation via HR [32]. Bestråling blev forbundet med en stigning i procentdelen af ​​celler med 10 53BP1 nukleare foci efter 4 timer, der var signifikant (p 0,05) forbedret i

Beclin 1

,

UVRAG

eller

ATG5

knockdown

vs

kontrol celler (fig. 2A).

ATG5

Knockdown celler blev anvendt som en kontrol for at deaktivere autofagi. Bestråling også øget antallet af RAD51 foci, som ikke adskiller sig væsentligt blandt

Beclin 1

,

UVRAG

eller

ATG5

knockdown

vs

kontrol celler (Fig . 2B).

A, B,

Immunofluorescens farvning for 53BP1 (A) eller RAD51 (B) blev udført i HT-29 celler med knockdown af

Beclin 1

,

UVRAG

eller

ATG5

og udsat for stråling (2 Gy) på de angivne tidspunkter. Procentdelen af ​​celler med 10 nukleare foci udtrykker enten 53BP1 eller RAD51 blev beregnet og plottet som vist. 53BP1 og RAD51 er markører for ikke-homolog ende sammenføjning og homolog rekombination, hhv. DAPI blev anvendt til at modfarve kernen. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse for eksperimenter udført i triplikat. Statistisk signifikans blev bestemt ved en tosidet Students t-test og defineret som *

P

. 0,05

USP10 og USP13 har vist sig at mediere deubiquitination af Beclin 1, derved stabilisere Vps34 komplekset [33]. Hæmning af disse deubiquitinases kan derfor repræsentere en strategi til at undertrykke autofagi. Vi fandt, at undertrykkelse af

USP10

af shRNA inducerede en 2-fold stigning i DSB markør γH2Ax og caspase-3-spaltning, og også reduceret klonogen overlevelse i bestrålede celler (fig. 3A). Inhibering af USP10 og USP13 blev også opnået under anvendelse spautin-1, en potent lille molekyle hæmmer af autofagi der fremmer nedbrydning af Vps34 PI3 kinase komplekser [33]. Spautin-1 hæmmede autophagy som angivet med reduceret LC3I-II konvertering og akkumulering af P62 /sequestosome 1 (fig. 3B). Desuden spautin-1 forbedrede DSBs, beskedent induceret apoptose (fig. 3B, C), og nedsat klonogen overlevelse i celler udsat for stråling alene eller kombineret med 5-FU (fig. 3D).

A,

Celler med

USP10 vs

kontrol shRNA blev bestrålet og analyseret for ekspression af USP10, LC3I-II, γH2Ax og kløvet caspase-3 ved 24 timer ved immunoblotting (

venstre

) eller for klonogene overlevelse (

rigtige

).

B, Salg Celler blev behandlet med bestråling alene eller kombineret med spautin-1 (10 uM) og ekspression af de angivne proteiner blev analyseret ved 24 timer ved immunoblotting.

C, D, Salg Celler blev behandlet med spautin-1 (10 uM) alene eller kombineret med RT (4 Gy) (C) eller RT ± 5-FU (2 uM) (D). I disse celler, annexin V

+ PI

– mærkning efter 24 timer (C) og klonogene overlevelse (D) blev analyseret. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse sammenlignet med kontroller for tredobbelte eksperimenter. **

P

. 0,01

UVRAG

interagerer med

Beclin 1

at regulere DNA skade responset

Nye beviser tyder på, at nedsat ekspression af

UVRAG

set i nogle kræftformer kan gør tumorceller sårbare til kromosomskader [34]. Vi fandt, at

Beclin 1

siRNA kan kraftigt reducere UVRAG ekspression i nærvær eller fravær af stråling (fig. 4A). Knockdown af

UVRAG

efter siRNA øget strålingsinducerede DSBs (γH2Ax) (fig. 4B), niveauerne af Patm (fig. 4C), og caspase-3-spaltning sammenlignet med kontrol siRNA (fig. 4B). For at afgøre om

Beclin 1

har en additiv virkning med

UVRAG

om regulering af stråling-induceret DNA-skader og apoptose, vi sammenlignet celler med knockdown af

UVRAG vs

dem med dobbelt knockdown af

Beclin 1

og

UVRAG

. Mens tilsvarende niveauer af γH2Ax og pCHK2 blev fundet, viste bestrålede celler med dobbelt-knockdown øget caspase-3 spaltning tyder på, at modulering af apoptose ved Beclin 1 sker uafhængigt af

UVRAG

(fig. 4D). Vi studerede derefter interaktionen mellem Beclin 1 og UVRAG i kontrol og bestrålet cellelinier. Immunpræcipiteret UVRAG blev vist at associere med Beclin 1 i nærvær eller fravær af stråling (fig. 5A).

A, B,

HT-29 og DLD1 celler blev transficeret med

Beclin 1 Hotel (A) eller

UVRAG

(B)

vs

kontrol siRNA. Celler blev bestrålet, og ekspressionen af ​​de angivne proteiner blev analyseret ved 24 timer efter stråling ved immunblotting.

C,

Tidsforløb af effekten af ​​stråling på Patm udtryk i celler med

UVRAG vs

kontrol siRNA.

D,

Effekt af stråling på DNA skader og apoptose markører i celler med dobbelt knockdown af

Beclin 1

og

UVRAG

vs

UVRAG

siRNA alene ( 24 h). Densitometri blev udført og normaliseret mod tubulin.

A,

Immunpræcipitation af UVRAG efterfulgt af sondering for Beclin 1 blev udført i HT-29 cellelysater (4 h) følgende stråling (4 Gy)

vs

ubehandlede celler. Normal IgG blev anvendt som en kontrol for antistofspecificitet. Både korte (SE) og længere (LE) engagementer er vist for UVRAG.

B,

HT-29-celler, der overudtrykker

UVRAG

vildtype (wt) eller en deletionsmutant ved sin coil domæne (ΔCCD), begge mærket med en tre-tandem-tag [ ,,,0],3tag: s-tag, 2XFLAG og streptavidin protein (SBP)], blev udsat for immunopræcipitation for FLAG. Udfældede proteiner blev probet under anvendelse af antistoffer mod Beclin 1, UVRAG eller FLAG. Normal IgG blev anvendt som en kontrol.

C, Salg Cellelysater fra bestrålede (4 Gy) celler blev probet for LC3I-II og γH2Ax ved 24 timer efter bestråling ved immunoblotting. Stabil

UVRAG

vægt eller

ΔCCD

mutant celler blev udnyttet her og i fig. 5B.

D

, Celler med vægt

UVRAG

eller

UVRAG ΔCCD

mutant vs tom vektor kontrol blev behandlet med køretøj eller strålebehandling, og langsigtet klonogene overlevelse blev bestemt. Dataene blev normaliseret i forhold til ubehandlede celler for hver celle fænotype. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse for eksperimenter udført i triplikat. Statistisk signifikans blev bestemt ved et to-sidet Student t-test og defineret som * P. 0,05

HT-29 celler, hvor UVRAG blev immunopræcipiteret blev dets induktion ved stråling observeret sammenlignet med ubehandlede celler og UVRAG viste sig også at binde til Beclin 1 (fig. 5A). For at undersøge virkningen af ​​den Beclin 1 og UVRAG interaktion i reguleringen af ​​radiosensitivitet, genereret vi HT-29-celler, der stabilt udtrykker vildtype (wt)

UVRAG

eller

ΔCCD

mutanter, der medierer dens interaktion med Beclin 1 [25].

UVRAG ΔCCD

mutant celler viste nær fuldstændigt tab af binding til Beclin 1 i modsætning til UVRAG vægt celler (fig. 5B). Ektopisk vægt

UVRAG

viste sig at forbedre LCI-II konvertering i bestrålede celler (fig. 5C). Vi derefter forsøgt at afgøre, om

UVRAG ΔCCD

kan medføre tab /dæmpning af autophagy induktion ved stråling.

UVRAG ΔCCD

celler viste en beskeden reduktion i stråling-induceret LC3I-II konvertering i forhold til WT celler (fig. 5C), som kan være relateret til sameksistensen af ​​endogen UVRAG. Celler med UVRAG

ΔCCD

var mere modtagelige for stråling-induceret DSBs, der angives med øget γH2Ax (fig. 5C) i forhold til vægt

UVRAG

og tomme vektor kontrol celler. Desuden celler med

UVRAG ΔCCD

var mere modtagelige for stråling-induceret celledød vist i en langsigtet klonogene overlevelse assay i forhold til UVRAG vægt celler (Fig. 5D).

Beclin 1

og

UVRAG

regulere centrosom Stabilitet

Selvom celler med defekte autofagi er tilbøjelige til genomisk instabilitet, der understøtter en rolle for autophagy i genom beskyttelse er begrænset, og den rolle, Beclin 1 eller UVRAG eventuelt er dårligt forstået. Vi undersøgte evne autofagi lovgivere til at mægle genom beskyttelse ved analyse af centrosom forstærkning. Centrosom forstærkning er blevet påvist i humane cancerceller med DNA skader fremkaldt af ioniserende stråling eller cytostatiske lægemidler [35], og kan føre til mitotisk fiasko og efterfølgende celledød [36]. Autophagy hæmning ved undertrykkelse af

ATG5

eller

LC3

af siRNA blev vist at øge stråling-induceret γH2Ax og caspase-3 spaltning (fig. 6A), der angiver evne autofagi at regulere disse processer . Vi derefter afgøres, om Beclin 1 og /eller UVRAG kan regulere centrosom stabilitet. I ubehandlede HT-29 eller Hela celler, fandt vi en statistisk signifikant stigning i centrosom antal efter knockdown af

Beclin 1

eller

UVRAG

og i mindre grad for ATG5, sammenlignet med kontrol siRNA vist ved γ-tubulin immunfluorescens (fig. 6B). I bestrålede celler blev en statistisk signifikant stigning i centrosom antal begrænset til celler med knockdown af

Beclin 1

eller

UVRAG

men ikke

ATG5

(fig. 6B). Disse resultater tyder på, at Beclin 1 og UVRAG kan regulere centrosom stabilitet uafhængigt af autophagy.

A,

Effekt af knockdown af

LC3

(

venstre

) eller

ATG5

(

højre

) på markører for DSBs (γH2Ax), apoptose (caspase-3), og autophagy (LC3I-II konvertering) i HT-29 og /eller DLD1 celler eksponeret for stråling

vs

kontrol 24 timer efter bestråling.

B

, centrosom tal blev bestemt ved immunfluorescens i

Beclin 1

,

UVRAG

eller

ATG5

knockdown celler (HT-29 eller HeLa) behandlet med stråling (4, 8 Gy)

vs

kontrol. Cellerne blev derefter farvet for γ-tubulin (rød farve) og repræsentative billeder vises (

venstre

). Procentdelen af ​​celler med mere end to centrosomer (multi-centrosomer) blev talt og plottet (

højre

). Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse for eksperimenter udført i triplikat. Statistisk signifikans blev bestemt ved en tosidet Students t-test og defineret som *

P

. 0,05 sammenlignet med kontrol celler

Diskussion

Mens rolle Beclin 1 og UVRAG i DNA-skade er blevet undersøgt i fastsættelsen af ​​tumorigenese [4], [13], [19], lidt om de molekylære detaljer i deres rolle i tumorcelle respons på cancerterapi. Forståelse cellulære mekanismer modstand mod DNA skader og reparation svar er afgørende for at forbedre terapeutiske resultater hos kræftpatienter. Passende udførelse af DNA DSB-reparation er kritisk for tumorcelleoverlevelse efter DNA beskadigelse og til vedligeholdelse af genomisk stabilitet. Vi fandt, at Beclin 1 og dets cofaktor UVRAG kan regulere DNA-skade /reparation respons og centrosom stabilitet i humane CRC-celler. Konkret undertrykkelse af

Beclin 1

eller

UVRAG

var forbundet med ophobning af DSBs og med øget apoptotisk celledød som respons på stråling ± 5-FU, med angivelse af deres evne til at regulere disse processer. En mekanisme, som

UVRAG

og

Beclin en

regulere DNA skade responset er foreslået af konstateringen af, at undertrykkelsen af ​​enten gen steg signifikant antallet af bestrålede celler med nukleare foci udtrykker 53BP1 som bidrager til NHEJ ved interaktion med kromatin i DSB sider for at regulere 5′-ende resektion [31]. Denne observation er i overensstemmelse med data i

53BP1

deficiente mus, der viser overfølsomhed over for bestråling og udviser kromosomafvigelser indikative DNA reparation defekter [37]. I modsætning til 53BP1, fandt vi, at antallet af RAD51 nukleare foci var upåvirket af

Beclin 1

eller

UVRAG

undertrykkelse, selvom yderligere undersøgelse er nødvendig for at bestemme præferencetolden inddragelse af NHEJ

vs

HR i denne indstilling. Da Beclin 1 stabilitet styres af ubiquitinering, har inhiberende deubiquitinases der nedregulerer Beclin 1 vist sig at deaktivere cytobeskyttende virkning Beclin 1. Svarende til

Beclin 1

knockdown, fandt vi, at undertrykkelse af ubiquitin-peptidase, USP10, eller et lille molekyle hæmmer af deubiquitinases USP10 og USP13, dvs. spautin-1 [33], kan øge stråling-induceret DSBs og fremme tumor celledød. De seneste data viser en tæt sammenhæng mellem Beclin 1 og p53 via deubiquitinases USP10 og USP13 [33]. Siden USP10 medierer deubiquitination af p53, kan regulering af deubiquitinase aktivitet USP10 og USP13 af Beclin 1 give en mekanisme, hvormed det kan styre p53 protein niveauer. Men relevansen af ​​disse fund for celler med mutant

p53

, som anvendes i denne undersøgelse, er ukendt. Mens vi udnyttet Knockdown tilgange og en autofagi inhibitor (spautin), erkender vi, at visse autofagi regulatorer direkte eller indirekte kan regulere cellulære processer, der er uafhængige af autofagi [13], [38].

Vi fandt, at undertrykkelse af

Beclin 1

var forbundet med nedregulering af UVRAG, i overensstemmelse med dokumentation for, at stabiliteten af ​​komponenter af PI (3) KC3 kompleks, der regulerer autofagi er indbyrdes afhængige på en post-transkriptionel niveau [3], [4 ]. For at bestemme den funktionelle overlap mellem disse gener, genereret vi celler med dobbelt knockdown af

UVRAG

og

Beclin 1

som blev vist at øge apoptose, men ikke DSBs, sammenlignet med

UVRAG

knockdown alene. Dette fund tyder på, at Beclin 1 kan regulere apoptose uafhængigt af UVRAG.