PLoS ONE: A Novel Rolle for Wnt /Ca2 + signalering i actincytoskelettet Remodeling og Cell motilitet i prostatakræft

Abstrakt

Wnt signalering er en kritisk regulatorisk vej i udvikling og sygdom. Meget lidt er kendt om mekanismerne for Wnt signalering i prostatakræft, en førende dødsårsag hos mænd. En kvantitativ analyse af ekspressionen af ​​Wnt5A protein i humane væv arrays, som indeholder 600 prostata væv kerner, viste 50% stigning i maligne forhold til godartede kerner (

s

0,0001). I et sammenhørende par af prostatacancer og normal cellelinje, blev ekspression af Wnt5A protein også steget. Calcium bølger blev induceret i prostata celler som respons på Wnt5A med en 3 gange stigning i Flou-4 intensitet. Aktiviteten af ​​Ca

2 + /calmodulin-afhængig proteinkinase (CaMKII), en transducer af den ikke-kanoniske Wnt /Ca

2+ signalering, steg med 8 gange i cancerceller; ingen ændring blev observeret i β-catenin-ekspression, som vides at aktivere kanoniske Wnt /β-catenin pathway. Udvinding af offentligt tilgængelige menneskelige prostatakræft oligoarray datasæt viste, at ekspressionen af ​​mange gener (fx CCND1, CD44) under kontrol af β-catenin transskription er nedreguleret. Konfokal og kvantitativ elektronmikroskopi viste, at specifikke inhibering af CaMKII i cancerceller bevirker omformning af actincytoskelettet, uregelmæssige sårkanterne og løs intercellulære arkitektur og en 6 og 8 gange stigning i hyppigheden og varigheden af ​​filopodia hhv. Omvendt viste ubehandlede normale prostata celler en uregelmæssig sårkanten og løs intercellulære arkitektur; inkubering af normale prostataceller med rekombinant Wnt5A protein induceret actin remodellering med en regelmæssig sårkanten og øget sårheling kapacitet. Levende celler viste, at en funktionel konsekvens af CaMKII inhibering var 80% fald i sårheling kapacitet og reduceret cellemotilitet i cancerceller. Vi foreslår, at ikke-kanoniske Wnt /Ca

2 + signalering via CaMKII virker som en ny regulator af strukturel plasticitet og celle motilitet i prostatakræft

Henvisning:. Wang Q, Symes AJ, Kane CA, Freeman A, Nariculam J, Munson P, et al. (2010) A Novel Rolle for Wnt /Ca

2 + Signalering i actincytoskelettet Remodeling og Cell motilitet i prostatakræft. PLoS ONE 5 (5): e10456. doi: 10,1371 /journal.pone.0010456

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: November 19, 2009; Accepteret: April 8, 2010; Udgivet: Maj 4, 2010

Copyright: © 2010 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af National Cancer Research Institute og Prostata Cancer Research center, Storbritannien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Vingeløse /Wnt gener koder for en familie af udskilte glycoproteiner, som regulerer mange cellulære processer [1], [2]. Aberrant signalering gennem Wnt signalveje er knyttet til en række sygdomme, herunder cancer [3] – [6]. Wnt signalering sker via den kanoniske (Wnt /β-catenin, CTNNB1) og ikke-kanoniske (Wnt /Ca

2+) veje [3], [7]. En mindre velbeskrevne Wnt-vejen er Wnt-JNK-vejen [8]. Signalering via Wnt /β-catenin pathway aktiverer transskription af mange gener, såsom cyclin Ds og membran metalloproteinaser (MMP’er), via TCF /LEF faktorer. Wnt /Ca

2+ sti fører til en stigning i intracellulært calcium [9] og aktivering af calmodulin-afhængigt proteinkinase II (CaMKII) [10] og er kendt for at modulere celle bevægelse og adfærd [11], [12] og inducerer strukturelle ændringer [11], [13], [14]. Forbindelsen mellem øget β-catenin signalering i tumorigenese og øget transkription af gener involveret i celletransformation og proliferation dokumenteres imidlertid den rolle ikke-kanoniske Wnt /Ca

2+ signalering i kræft er kun langsomt ved at blive belyst [15] , [16].

prostatakræft udgør en anslået 25% af alle nye kræfttilfælde og er den næststørste årsag til kræftdødsfald hos mænd [17]. Hverken ekspression af Wnt proteiner eller de mekanismer Wnt-signalering i prostatacancer forstås [18]. Tidligere undersøgelser koncentreret om karakterisering af Wnt-receptorer, receptor relaterede proteiner og ekspression af Wnt-gener [5], [19] – [21], i prostata cancercellelinier. Direkte interaktion mellem androgen receptor (AR) og TCF for β-catenin og andre transkriptionsfaktorer co-faktorer blev også foreslået [22]. Imidlertid har kun en lille procentdel af prostatakræft prøver dysreguleret ødelæggelse komplekse eller muteret β-catenin [18]. Det er derfor sandsynligt, at andre mekanismer, måske direkte knyttet til Wnt-signalering, kan være involveret

Vi viste for nylig [23], at WNT5A (et af de 19 medlemmer af Wnt familie) genekspression forøges ( 50 gange) i prostatacancer væv og cancercellelinjer grund hypometylering. Men vigtige spørgsmål vedrørende Wnt5A udtryk og mekanismerne i Wnt5A medieret signalering i prostatakræft tilbage. For eksempel ved vi ikke (i) Hvorvidt stigningen i WNT5A gen transskription resulterer i øget Wnt5A proteinekspression i maligne tumorer? (Ii) Hvorvidt den kanoniske eller ikke-kanonisk signalvej aktiveres i prostatakræft? (Iii) Hvad er den funktionelle rolle af Wnt signalering i prostatakræft? For at løse disse spørgsmål vi testet følgende hypoteser: (i) At Wnt5A proteinekspression forøges i human prostatacancer (ii) At Wnt /β-catenin signalering bør resultere i forøget ekspression af TCF /LEF target gener, såsom MMP’er og TIMP3 i prostatacancer (iii) Aktivering af Wnt /Ca

2+ signalering i prostatacancerceller bør resultere i en stigning i CaMKII enzymaktivitet forårsager ændringer i cytoskelettet og cellemotilitet. Vi viser for første gang, at Wnt5A proteinekspression forøges i malign human prostata sammenlignet med godartet væv og Wnt /Ca

2+ signalering mekanismen aktiveres i prostatacancerceller. Vi tilbyder også roman mekanistisk tegn på en kritisk rolle for CaMKII som modulator af aktincytoskelettet og celle motilitet i prostatakræft.

Resultater

RNA transcript vurdering ved hjælp af real time PCR

Vi målte mRNA niveauer for WNT5A (tabel S1), tidligere identificerede fra vores oligoarray analyse skal dysreguleret i prostata kræftceller [23]. WNT5A mRNA viste en lignende størrelsesorden af ​​forandringer (~ 50 gange) i 1542-CP

3TX cancerceller sammenlignet med normale 1542-NPTX celler, uanset om målt ved hjælp oligoarray [23] eller real time PCR (tabel S1). WNT5A udskrift udtrykkes også i andre prostatakræft-cellelinier f.eks PC3 og DU145 [19], [23].

Wnt5A proteinekspression i maligne og benigne menneskelige prostata

3,3-diaminobenzidin (DAB) etiket, der repræsenterer Wnt5A udtryk, blev observeret i begge maligne og benigne vævskerner (fig. 1A og B). Vi kvantificeret etiketten på en saglig måde, ved hjælp af en reproducerbar, semi-automatiske partikel analyse (analyse Partikler) protokol ved hjælp ImageJ software [24] efter konvertering RGB-billeder i 16 bit gråtoner (Fig 1C og D) fra 600 individuelle prostata væv kerner (se Materialer og fremgangsmåder). Beregnede parametre for, total areal, gennemsnitlige størrelse og område fraktion er givet i tabel S2. Integration af arealet under kurven afslørede en 55%, 25% og 45% stigning i det samlede areal, gennemsnitlige størrelse og område fraktion (total /totalt pixel), der repræsenterer omfanget og intensiteten af ​​farvning, i maligne kerner (n = 301 ) sammenlignet med benigne kerner (n = 299), (fig 1E, F og G), der var stærkt signifikant (p 0,0001, t-test). Disse resultater viser, at Wnt5A ekspression er forøget i forhold til malign godartet human prostata.

repræsentant ondartet (A) og godartet (B) væv kerne fra humane prostata arrays anvendes til beregning Wnt5A ekspression (DAB label, brun, stort set i acinære celler). RGB-billeder (A og B) blev konverteret til 16 bit billeder (C og D) til kvantificering af DAB-signalet ved hjælp Analyser Particle protokol i ImageJ software til at opnå Samlet areal farves (E) og gennemsnitlige størrelse af partiklen målt (F) , i pixel, og området fraktion (G, samlet areal divideret med det samlede antal pixels i billedet). Wnt 5A ekspression blev forøget i maligne v benigne kerner (p 0,0001). Hver bin er data for en individuel, ondartet (rød, n = 301) eller godartede (grøn, n = 299) kerne.

Mekanismer af Wnt-signalering i prostatakræft

Ekspression af Wnt5A protein var også højere i 1542-CP

3TX cancerceller sammenlignet med matchede normale 1542-NPTX celler (fig. 2A). Der var også et samtidigt fald (2,5 gange) i mRNA-transkript af CTNNB1 og andre elementer af Wnt /β-catenin signalering (fx axin, DVL1, GSK3p) i cancerceller sammenlignet med normale celler (tabel S1). Antagonisme af β-catenin grund overekspression af Wnt5A, hvilket fører til nedregulering af Wnt /β-catenin target er tidligere blevet foreslået i melanom [25] og Xenopus embryoner [11]. β-catenin-proteinekspression, anvendelse af Western blotting viste et enkelt bånd (~94kDa) i et protein koncentrationsafhængig måde, i cellelysater fra både 1542-CP

3TX og 1542-NPTX celler (Fig. 2B). Densitometrisk analyse viste, at der ikke var nogen ændring i β-catenin-protein i canceren sammenlignet med normalt cellelinje (fig. 2C). Endvidere ifølge vores oligoarray data [23] en række Wnt /β-catenin-medieret transkription TCF målgener viste reduceret mRNA-ekspression i cancerceller (Tabel S3). En detaljeret undersøgelse på protein og funktionelt niveau af udvalgte mål af TCF /LEF transskription (fx MMP2, MMP14 og TIMP3) [26] bekræftet disse observationer. mRNA-ekspression for disse gener var 3-10 gange lavere i cancerceller sammenlignet med normale celler (tabel S1) understøttes ved indirekte immunfluorescens (fig. S1). MMP-14 aktivitet bør afspejle balancen mellem MMP-14 katalytiske og TIMP3 regulatoriske aktiviteter. MMP-aktivitet var 3 ± 0,06 gange lavere i cancercellerne under anvendelse gelatinezymografi (fig. S2). Disse resultater bekræftede, at talrige mål for Wnt /β-catenin-signalvejen blev nedreguleret ved gen, protein eller funktionelt niveau.

Western blot af (A) Wnt5A proteinekspression, der viser højere niveauer i 1542-CP

3TX (CP) celler sammenlignet med 1542-NPTX (NP) celler. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) β-catenin (94kDa) ekspression i cellelysat fra 1542-CP

3TX og 1542-NPTX cellelinjer (GAPDH, 35 KDa, der anvendes som et protein loading kontrol på samme blot). (C) Densitometrisk analyse blev udført ved hjælp af kommerciel software (GeneTools, Synoptics, UK). NP (fyldte bar) = 1542-NPTX og CP (hule bar) = 1542-CP

3TX.

Analyse af genekspression af CTNNB1 og TCF /LEF transskription mål, ved hjælp Oncomine [27 ] og GeneSpring software og offentligt tilgængelige microarray datasæt for normale (ikke-neoplastisk eller godartet)

vs

cancer prostata væv, viste, at ekspressionen af ​​næsten alle Wnt /β-catenin /TCF-mål analyseret, undtagen c-myc blev reduceret i prostatacancer (fig. S3). Disse resultater svarer til dem for prostata cellelinier og viser, at β-catenin-medieret stigning i TCF transkription ikke var sandsynligvis den mekanisme af Wnt signalering i prostatacancer. Vi har derfor testet den hypotese, at i prostatakræft, er Wnt signalering transduceres via Wnt /Ca

2+ vej. Vi udførte eksperimenter for at fastslå, om Wnt5A direkte induceret calcium frigivelse i prostata celler. Tilsætning af Wnt5A peptid induceret calcium bølger, der varer op til 100’erne, i prostatakræft cellelinje med en 3,1 ± 0,1 (n = 12) fold stigning i intensiteten af ​​Flou-4 fra basislinjen (figur 3 og Movie S1).

en repræsentativ graf af calcium frigivelse i prostatacancer-cellelinie (PC3) som en funktion af Fluo-4 intensitet ændre sig over tid ved hjælp af konfokal levende celler. Den grønne linie repræsenterer ændringen i Fluo-4 intensitet (grøn linje) i (A) kontrol (efter tilsætning af køretøjet PBS) eller (B) rekombinant Wnt5A peptid (100 ng /ml). Der var en 3,1 ± 0,1 gange stigning i Fluo-4 intensitet efter tilsætning af Wnt5A (n = 12). I nogle eksperimenter Fura Red (rød linje) blev fyldt med Fluo-4. Forholdet mellem ændring i Fluo-4 og Fura-rød er plottet i (C).

CaMKII aktivitet og dens rolle i strukturel plasticitet prostata celler

CaMKII er en stor transducer af Wnt /Ca

2+ signalering. I alle prostata cellelinjer var CaMKII enzymaktivitet Ca

2+ afhængig, mindst i 1542-NPTX, større i 1542-CP

3TX og DU145 og udtalt i PC3 cellelinje (fig. 4). Der var en 4 og 8 gange stigning i Ca

2 + -afhængig CaMKII aktivitet in1542-NPTX og 1542-CP

3TX celler (Fig. 4), henholdsvis. Vigtigere er det, Ca

2+ afhængig aktivitet af CaMKII blev øget med ca. 4 gange i 1542-CP

3TX forhold til 1542-NPTX (

indsat

Fig. 4). Disse resultater peger på en stigning i aktiviteten af ​​CaMKII i cancerceller sammenlignet med normale celler.

phosphotransferase aktivitet af CaMKII i cellelysater blev målt ved anvendelse af et [γ-

32P] ATP baseret CaMKII assay ( Upstate, UK) med Ca

2+ (skraverede søjler) eller uden Ca

2 + (hule søjler).

Indsat

: Ca

2 + -afhængig CaMKII aktivitet blev beregnet som beskrevet i Materialer og Metoder. Værdier er gennemsnit ± SE fra 3 eksperimenter. NP is1542-NPTX, CP is1542-CP

3TX, DU er DU145 og PC er PC3 prostata cellelinje.

For at undersøge betydningen af ​​Wnt signalering i aktincytoskelet af normale og cancer prostata celler , brugte vi et sår /scratch assay i kombination med konfokal og scanning elektronmikroskopi og levende celler. For det første blev den forreste kant af såret observeret for actin-remodeling, under anvendelse af konfokal mikroskopi efter farvning med fluorescensmærket phalloidin. I 1542-CP

3TX celler forkanten af ​​såret, ved 4 h efter sårdannelse, viste glat, regelmæssig actin-farvning, med celler der findes i en lamellipodia lignende formation (fig. 5A). I 1542-NPTX celler forkanten af ​​såret var uregelmæssig med morfologi af individuelle celler, nogle med fine filopodia lignende strukturer synlige ved 4 timer (fig. 5B).

Celler blev såret og farvet med phalloidin- fluorescein -5-isothiocyanat (FITC, green) for at visualisere actinfilamenter bruger Leica SP2 konfokalt mikroskop. A, B og G er ubehandlede 1542-CP

3TX, 1542-NPTX og PC3 celler. C, D og H er AIP (10 uM) behandlede 1542-CP

3TX, 1542-NPTX og PC3 celler. E og F er 1542-CP

3TX og 1542-NPTX behandlet med rekombinant Wnt5A (100 ng /ml). Uregelmæssig sår forkant og løs af intercellulære forbindelser og fine filamenter af actin (filopodia fremspring), hvide pile, er synlige i 1542-NPTX normale celler og efter AIP behandling i 1542-CP

3TX og PC3 kræftceller. Propidiumiodid blev anvendt til at farve nukleinsyre (rød). Scale bar = 10 um

Vi næste testet følgende hypoteser: (i) hæmning af CaMKII bør forstyrre såret forkant i prostatakræft-cellelinier (ii) aktivering af Wnt5A signalering i 1542-NPTX celler bør fremme actin remodellering af såret som observeret i 1542-CP

3TX celler. Vi anvendte myristoyleret autocamtide-2-relateret inhiberende peptid (AIP), en inhibitor af CaMKII, og rekombinant Wnt5A protein (for at aktivere Wnt-signalering) i normale celler og cancerceller til at teste disse hypoteser (fig. 5). Konfokal mikroskopi af sårede /ridset monolag af 1542-CP

3TX celler inkuberet med AIP (10 uM), der vises afbrudt, uregelmæssig sår forkant med fine filopodia (fig. 5C, pile) i forhold til almindelig sår kant i ubehandlede celler (Fig . 5A). Forkanten af ​​sårede 1542-NPTX celler med eller uden AIP viste en uregelmæssig kant, med løs celle til celle-kontakt og fine endeløse actin fremspring (fig. 5B og D). Disse mikrografer viser, at inhibering af CaMKII i 1542-CP

3TX cancerceller inducerer filopodia lignende fremspring. Omvendt sårede 1542-NPTX normale celler, inkuberet med rekombinant Wnt5A protein (100 ng /ml), vises en regelmæssig forkant (fig. 5E) af såret sammenlignet med den ubehandlede kontrol (fig. 5B). blev ikke observeret nogen tilsyneladende forskel i det førende sårkanten for ubehandlet vs Wnt5A protein inkuberes 1542-CP

3TX celler (fig. 5A og F).

For at validere, at actin remodeling blev formidlet af CaMKII og ikke via andre kinaser (f.eks CaMKIV, PKA, PKC, Raf eller MAPK1, JNK1α1 eller Raf), vi brugte tatCN21a, en specifik hæmmer af CaMKII [28]. 1542-CP

3TX celler behandlet med 5 uM tatCN21a viste uregelmæssige sårkanterne, løs celle til celle kontakt og filopodia dannelse (fig. S4) som observeret med AIP (fig. 5). Inhibering af CaMKII også induceret, uregelmæssig sår kant, løsning af celle til celle-kontakt og filopodia i andre prostatacancer cellelinjer, herunder PC3 (Fig. 5G og H og fig. S5), DU145 (Fig. S6) og androgen følsomme LNCaP-cellelinie (fig. S7).

Den mekanisme, hvorved CaMKII hæmning forårsaget filopodia dannelse i prostata kræftceller var næste overvejes. Vi anvendte scanningselektronmikroskopi at kvantificere filopodia lignende strukturer (fig. 6). Lav forstørrelse scanning elektron mikrografier af 1542-CP

3TX celler viser regelmæssige og uregelmæssige sår førende kanter i ubehandlet (

indsat

Fig. 6A) og AIP behandlede celler (

indsat

Fig. 6B ). Stor forstørrelse billeder viser tydeligt talrige og udvidet fint filopodia fremspring fra cellemembranen (fig. 6B) i AIP behandlede 1542-CP

3TX celler sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 6A). Inhibering af CaMKII med AIP forårsagede en lignende effekt i PC3-cellelinie (fig. 5H og fig. S5B). Hyppigheden og længden af ​​filopodia blev målt manuelt ved hjælp ImageJ software. En Gauss fit af længden fordeling histogram af behandlet og ubehandlet 1542-CP

3TX celler afslørede en 8 gange stigning i længden og en 6 gange stigning i den samlede hyppighed af filopodia fremspring i AIP behandlede i forhold til ubehandlede 1542-CP

3TX celler (fig. 6C og tabel 1). Histogrammet kan monteres i mindst to længder af filopodia fremspring i 1542-CP

3TX celler: lang (op til 2 um) og meget lange ( 2 um). Yderligere analyse viste, at der var en 5 gange stigning i længden, men en langt større (15 gange) forøgelse i frekvensen af ​​de meget lange fremspring i AIP behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler (tabel 1). Disse resultater bekræfter en stor rolle for CaMKII medieret Wnt signalering i actin remodeling i prostatakræft ved at reducere længden og hyppigheden af ​​filopodia.

De vigtigste billeder er repræsentative billeder (skala bar 1 um) af ubehandlet (A) og AIP (10 uM) behandlet (B) celler. Indsat er lav forstørrelse billede (skala bar 10 um) den af ​​hovedbilledet. Uregelmæssig sår kant og fine filopodia ligesom fremspring er synlige efter behandling med AIP (B, vigtigste billede). Længde på filopodia fremspring blev målt ved hjælp af billede J software og omdannes til distributionen histogram (C) for AIP behandlet (hule søjler) og ubehandlede (skraverede søjler) celler. blev observeret En 8-fold stigning i arealet under kurven for behandlet i forhold til ubehandlede celler ved hjælp af en gaussisk pasform.

Funktionelle konsekvenser af Wnt /Ca

2 + signalering i prostata kræftceller

Cytoskeleton spiller en integrerende rolle i celle motilitet. For at undersøge de mulige manifestationer af cytoskeletale ændringer testede vi den hypotese, at CaMKII inhibering vil falde cellemotilitet i prostata cancercellelinier. Vi brugte såret scratch assay og levende celler med Incucyte (Essen Instruments) til at beregne hastigheden af ​​sårlukning som et mål for celle motilitet. Satsen for sårlukning blev reduceret med 80% i PC3 cancer cellelinjer behandlet med AIP (fig. 7 og Movie S2, kontrol og Movie S3, AIP).

Konfluente PC3 prostatakræft-cellelinier blev såret og filmede natten over ved 1h intervaller. Billederne blev sammensat (se film S2, kontrol og S3, AIP) og data importeres til et regneark. Tilsætning af AIP (10 uM, skraveret søjle) reducerede den sårlukning med 80% sammenlignet med kontrol (hul stang, * p 0,001) eller Wnt5A (100 ng /ml, udfyldt søjle). Dataene er angivet som middelværdi ± SE, signifikans forskel mellem kontrol og AIP opnåedes ved ANOVA. Sats for sårlukning blev bestemt ved at udføre lineær regression til at beregne hældningen af ​​linjen (

Indsat

, repræsentant for n = 6-7) til ubehandlet kontrol (udfyldte trekanter,

R

= 0,99) , Wnt5A (fyldte firkanter,

R

= 0,99) eller AIP (udfyldt cirkel,

R

= 0,97) behandlet PC3 celler.

diskussion

Wnt udtryk og mekanismer i Wnt signalering forbliver en dårligt undersøgt område i prostata. Vi viser, at (i) Wnt5A proteinekspression er forøget i forhold til malign godartet humant prostatavæv og i cancercellelinjer sammenlignet med normale. (Ii) Wnt5A er større transducer af Wnt signalering via aktivering af Wnt /Ca

2+ pathway og ikke Wnt /β-catenin pathway i prostataceller. (Iii) Aktivering af CaMKII er en hidtil ukendt og kritisk regulator af cytoskeleton i prostatacancer. (Iv) CaMKII hæmning signifikant nedsætter celle motilitet og kapaciteten af ​​sårheling i prostata cancer cellelinjer.

En forståelse af den molekylære basis for prostatakræft, og den rolle, som signalering netværk såsom Wnt-pathway spillet, ikke blot kræver en omfattende beskrivelse af genet og proteinekspression i humant prostatavæv, men også en celle system, som på undersøge mekanismerne i signalering og dets funktionelle konsekvenser i sygdom. Vores prostata væv array-undersøgelser viser, at der var en stærkt signifikant (p 0,0001) stigning i både det samlede areal (omfang) og gennemsnitlige størrelse af de mærkede partikler (intensitet) og område fraktion (Fig 1E, F og G og tabel S2) . Disse resultater understøtter de tidligere observationer af stigningen i angivelsen af ​​Wnt5A gen i prostatakræft grund hypometylering [23] og også en meget nylig rapport fra Yamamoto

et et

l [29], der brugte konventionelle, ikke-quantiative , histologisk undersøgelse for at vurdere Wnt5A ekspression prostata. Disse data er også i overensstemmelse med den, der opnås for normal (1542-NPTX) og cancer (1542-CP

3TX) cellelinjer (figur 2). Taget sammen de humane data vævs- og cellelinie antyder, at Wnt5A protein udtrykkes i normal (eller godartet) væv, men dets ekspression er dramatisk forøget i maligne (kræft) prostatavæv og denne ændring er afspejlet i de cellelinier anvendt i dette studie.

Næsten alle kendte transskriptionsfaktorer mål aktiveres af Wnt /β-catenin pathway, f.eks CTNNB1, CCCNDs, MMP, PITX2, CD44, APCDD1 JUN [30] – [32], er uændrede eller nedreguleret i prostatacancer væv eller cellelinier i forhold til normalt væv eller cellelinie (. Fig S3 og tabel S1) . Disse resultater viser, at cellelinien datasæt vidt omfang afspejler genekspression mønster for TCF /LEF regulerede gener i både cellelinie og cancer væv. Desuden var der ingen stigning i protein ekspression eller funktionel aktivitet af downstream mål for kanoniske Wnt-signalering (fx MMP-14). Dette antyder, at 1542-NPTX og 1542-CP

3TX og PC3-cellelinjer kan være en nyttig model til at undersøge mekanismerne i Wnt-signalering i prostatacancer som integritet Wnt signalering elementer i prostatacancer er bevaret i disse cellelinier på genet, proteinet og funktionelle niveauer.

CaMKII er en vigtig mediator af Wnt /Ca

2+ signalering selvom foreslås en yderligere delmængde af den ikke-kanoniske Wnt signalering via Wnt5A at være en β-catenin nedbrydningsvej, som ikke kræver aktivering af CaMKII [33]. En 3 gange stigning i fri intracellulær calciumkoncentration blev observeret efter tilsætning af Wnt5A i prostata celler (fig 3 og Movie S1). Desuden har vi ikke se et fald i β-catenin protein-ekspression og aktivitet CaMKII fandtes at stige i prostatakræft-cellelinier, hvilket indikerer, at Wnt /Ca

2+ vej var sandsynligvis operativ via CaMKII i prostata kræft

De mange roller CaMKII i actin remodeling, celle motilitet og migration af normale keratinocytter, muskel- og nerveceller er kendt [34] – [36].. Men inddragelsen af ​​CaMKII medieret Wnt /Ca

2 + signalering i sygdom er blevet mindre godt karakteriseret. Pukrop

et al

[37] foreslog, at den ikke-kanoniske vej kan være involveret i den øgede migration /invasionsevne af MCF7 brystcancer cellelinjer når rekombinant Wnt5A føjes til cellekultur. Men de mekanismer, eller om Wnt5A formidlede sin virkning gennem CaMKII aktivering, blev ikke undersøgt. Cell motilitet kræver to hovedtyper af actin baserede strukturer i cellemembranen, lamellipodia og filopodia. Det er blevet foreslået, i fibroblaster, som filopodia dannelse ud fra lamellipodia er en tæt reguleret proces, som er delvist styret af actinbindende proteiner såsom aktiveret (Ena) /vasodilator-stimuleret phosphoprotein (VASP) capping glødetråden actin [38]. Fibroblaster flytte ved at udvide lamellipodia på forkant og dannelse af fine actin strukturer på forkant forårsager retrograd bevægelse [39]; beslaglæggelse af Ena /VASP for mitokondrier stiger, mens dens målretning til cellemembranen reducerer motilitet [38]. Rolle Wnt5A medieret signalering i celle motilitet [37] og andre formidlende proteiner (fx Ena /VASP, ARP2 /3) i filopodia dannelse er blevet undersøgt i humane [14], [40] og mus [41] melanom celler. Weeraratna og kolleger [40] foreslog, at Wnt5A forøget cellemotilitet i humane melanoma cellelinier ved aktivering af protein kinase C (PKC). Witze

et al

[14] viste, at akut reaktion af modermærkekræft cellelinjer til Wnt5A involverer rekruttering af større cytoskeletproteiner (actin og myoxin IIB) og Frizzled 3 og melanom celleadhæsionsmolekyle i en intracellulær struktur via Wnt5A regulering af Rab4 og RhoB guanosin triphosphatases. Et andet studie undersøgte rollen for ROR2 kinase i Wnt5A induceret cellemigrering [42]. I modsætning til de data, som præsenteres her, disse undersøgelser [40], [42] hverken undersøgt eller direkte manipuleret CaMKII aktivitet i deres eksperimenter eller undersøgt sin rolle i filopodia formation. Vi anvendte tatCN21a, en specifik inhibitor af CaMKII (men ikke CaMKIV, PKA, PKC, MAPK1, JNK1α1 eller Raf). Behandling af prostatacancer celler med tatCN21a forårsagede også en lempelse af celle til celle-kontakt og induceret filopodia-dannelse (fig. S4) ligner resultaterne opnået med AIP (fig. 5). Disse resultater indikerer, at direkte inhibering af CaMKII (og ikke CaMKIV, PKC, PKA og andre kinaser) resulterer i tab af celle til celle-kontakt og filopodia dannelse i prostatacancerceller.

I prostata cancercellelinier (1542 -CP

3TX og PC3) en glat, regelmæssig sårkanten observeres med tæt celle til celle-kontakt forud for lamellipodia ligesom forkanten (fig. 4 og 5). I modsætning hertil behandling med AIP inducerer en stigning i filopodia fremspring med en lempelse af celle til celle-kontakt forud sårkanten (fig. 5 og 6 og tabel 1). Faktisk hastigheden af ​​sårlukning blev reduceret med 80% efter hæmning af CaMKII i cancer cellelinje (PC3). Omvendt tilsætning af Wnt5A til normal cellelinje (1542-NPTX) steg hastigheden af ​​sårlukning (um /h) sammenlignet med ubehandlede celler ved 25 ± 4%. Vi foreslår, at aktivering af CaMKII via Wnt5A signalering er en fordel at kræftcellen mobilitet som det undertrykker dannelsen af ​​fine filopodia at fremkalde retrograd bevægelse dermed reducere celle mobilitet.

Protein udtryk for Wnt5A i human prostatacancer og mekanismer i Wnt signalering i normale og cancer prostata-cellelinjer, der er beskrevet her, giver den første ramme, inden for hvilken den nøjagtige deltagelse Wnt receptorer og sekretorisk frizzlede relaterede proteiner [20], [21] og forskellige actin-bindende proteiner og formidlende signalmolekyler såsom Ena /VASP og ERK1 [34], [38], kunne undersøges i kræft. Yderligere undersøgelser for at identificere receptor (er) for Wnt5A binding og andre proteiner involveret i nedstrøms signalering via CaMKII i cellemotilitet i prostatakræft vil bidrage til at belyse den hidtil ukendte rolle CaMKII i undertrykkelsen af ​​filopodia formation for at øge cellemotilitet i prostatacancer . Som konklusion, fra de præsenteres her resultater og vores seneste undersøgelse [23] viser hypometylering som en regulator af Wnt5A gen transskription i prostata, kunne overvejes følgende rækkefølge: (i) Gen-ekspression af Wnt5A er steget i kræft sammenlignet med normale celler grund til hypomethylering af genet promotorregionen (ii) Stigning i genekspression resulterer i forøget proteinekspression af Wnt5A i human prostatacancer (iii) Wnt /Ca

2+ pathway (og ikke β-catenin pathway) aktiveres i prostatacancer celler (iv) signalering via Wnt /Ca

2+ vej aktiverer CaMKII (v) CaMKII aktivitet, sandsynligvis via mellemled signalering involverer actin bindende proteiner, forårsager en større reorganisering af cytoskeleton i cancerceller ved at reducere længden og hyppigheden af ​​fine , filopodia ligesom aktin strukturer. (Vi) cytoskeletale remodeling grundet CaMKII forårsager en stigning i cellemotilitet. Målretning af Wnt /Ca

2+ signalering, især CaMKII kan være et nyttigt redskab i prostatakræft terapi.

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige prostata epitelcelle line1542-NPTX og prostatacancer-cellelinie 1542-CP

3TX [43] (afledt af normalt og prostatacancer væv fra den samme patient [43]) blev opnået fra SL Topalian, National cancer Institute, NIH, USA, ophavsmændene til disse cellelinjer. Prostata carcinom cellelinje PC3 blev opnået fra M E Kaighn ophavsmændene denne cellelinie [44]. DU145 blev opnået fra cellen bank vedligeholdes af Jørgen Fogh på Sloan Kettering Cancer Center, NY, USA, fra en indbetaling foretaget af ophavsmanden til denne cellelinje [45]. PC3 og DU145 blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) medium indeholdende 5 mM L-glutamin og føtalt bovint serum (FBS) og 1542-NPTX og 1542-CP

3TX blev opretholdt i keratinocyt-SFM (KSFM) medium og supplementer ( Invitrogen) med 5% FBS og KSFM kosttilskud (Invitrogen).

Kvantitativ real time PCR

Fluorescerende real-time PCR (TaqMan blev Applied Biosystems, UK), der anvendes til at kontrollere genekspression i 1542 -NPTX og 1542-CP

3TX oprindeligt identificeret fra microarray eksperimenter [23]. RNA-isolering er beskrevet andetsteds [23]. TaqMan prober og primere til real-time PCR blev indkøbt som et tidligere udviklet analysesystem; Applied Biosystems assay id’er til de anvendte prober og en kort protokol er angivet i tabel S4.