PLoS ONE: Kombination af Gefitinib og DNA-methylering Inhibitor Decitabin Udøver Synergistisk Anti-Cancer aktivitet i Colon Cancer Cells

Abstrakt

På trods af nylige fremskridt i behandlingen af ​​menneskets tyktarmskræft, kemoterapi effekt mod tyktarmskræft er stadig utilfredsstillende. I den foreliggende undersøgelse blev virkningerne af samtidig inhibering af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) og DNA methyltransferase undersøgt i humane coloncancer-celler. Vi viste, at decitabin (en DNA methyltransferase inhibitor) synergieffekt med gefitinib (en EGFR-inhibitor) for at reducere cellernes levedygtighed og kolonidannelse i SW1116 og LoVo-celler. Kombinationen af ​​de to forbindelser udviste minimal toksicitet til NCM460 celler, en normal human colon mucosal epithelial cellelinie. Kombinationen var også mere effektiv til at inhibere AKT /mTOR /S6 kinase pathway. Desuden giver kombinationen af ​​decitabin med gefitinib markant inhiberede coloncancer cellemigrering. Desuden gefitinib synergistisk forbedret decitabin-induceret cytotoksicitet skyldes primært apoptose som det fremgår af Annexin V mærkning, der blev svækket af z-VAD-FMK, en pan caspaseinhibitor. Samtidig hermed blev celle apoptose som følge af co-behandling af gefitinib og decitabin ledsaget af induktionen af ​​BAX, spaltet caspase 3 og spaltes PARP, sammen med reduktion af Bcl-2 i forhold til behandling med hvert lægemiddel alene. Interessant, kombineret behandling med disse to lægemidler steg ekspressionen af ​​XIAP-associeret faktor 1 (XAF1), som spiller en vigtig rolle i celle apoptose. Desuden lille interfererende RNA (siRNA) udtømning af XAF1 betydeligt svækkede coloncancerceller apoptose induceret af kombinationen af ​​de to lægemidler. Vores resultater viste, at gefitinib i kombination med decitabin udøvede forbedret celle apoptose i kolon kræftceller var involveret i mitokondrie-medieret vej og induktion af XAF1 udtryk. Som konklusion, baseret på observationer fra vores undersøgelse, vi foreslog, at kombinerede administration af disse to lægemidler kan betragtes som en ny terapeutisk regimen til behandling af tyktarmskræft

Henvisning:. Lou YF, Zou Zz, Chen Pj Huang Gb, Li B, Zheng dq, et al. (2014) Kombination af Gefitinib og DNA-methylering Inhibitor Decitabin Udøver Synergistisk Anti-Cancer aktivitet i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 9 (5): e97719. doi: 10,1371 /journal.pone.0097719

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: 9. januar 2014 Accepteret: April 23, 2014; Udgivet: May 29, 2014

Copyright: © 2014 Lou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af South China Normal University Science Fund for Young Scholars (Grant nr 13KJ19 til Zheng-zhi Zou), Bureau of Dongguan city videnskab og teknologi 2010 nøglen Fund projekt (Grant No. 201.028 til Xiao-yong Luo). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tyktarmskræft er en af ​​de mest almindeligt forekommende tumorer og en væsentlig årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan, hvilket understreger behovet for effektive strategier til at forebygge og behandle denne malignitet. Terapier tilgængelige til behandling af coloncancer omfatter kirurgi, stråleterapi, kemoterapi, immunmodulerende behandling, og molekylært målrettede behandlinger, såsom anti-vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) og anti-epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) -terapi [1], [ ,,,0],2]. Blandt disse molekylært målrettede behandlinger, har EGFR-målrettet terapi som en af ​​de vigtige kliniske strategier blevet stadig mere almindeligt anvendt i patienter med metastatisk kolorektal cancer [3].

EGFR er et transmembrant glycoprotein med et ekstracellulært EGF-bindende domæne og en intracellulær region indeholdende tyrosinkinasedomæne, der regulerer signalveje til kontrol celleproliferation, differentiering, lægemiddel og stråling følsomhed og angiogenese [4]. Ekspression af et højt niveau af EGFR er fundet i forskellige typer af humane cancere, herunder coloncancer, gastrisk cancer, lungecancer, brystcancer og pladecellecarcinom i hoved og hals [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Overekspression og konstitutiv aktivering af EGFR er blevet forbundet med en dårlig prognose hos patienter med coloncancer. Som aktivering af EGFR er korreleret med tyktarmskræft progression, har EGFR været mål for anticancer lægemiddeludvikling indsats. Disse strategier rettet mod EGFR omfatter anvendelse af monoklonale antistoffer, såsom cetuximab, og små molekylære tyrosinkinaseinhibitorer (TKI) som f.eks gefitinib og erlotinib. Gefitinib er et syntetisk anilinoquinazolin og oral aktiv selektiv EGFR-TKI, som blokerer signaltransduktion pathway involveret i proliferation og overlevelse af cancerceller. I et klinisk miljø, er gefitinib behandling blevet godkendt af forskellige former for kræft, herunder coloncancer [11]. Men det spirende klinisk erfaring har skuffende afsløret, at trods gefitinib demonstrerer nogle antitumorvirkning i coloncancer, er der en høj grad af

de novo

resistens mod en sådan behandling [12]. Derfor pågår for udviklingen af ​​anti-kolon cancer regimer, der ville kombinere gefitinib med andre lægemidler.

Epigenetisk ændringer, primært DNA methylering og histoner acetylering, er nu anerkendt som de vigtigste mekanismer bidrager til tumor maligne fænotyper [13]. Som følge heraf har flere lægemidler, som påvirker epigenetiske veje blevet godkendt til behandling af kræft og flere er i øjeblikket i kliniske forsøg [14], [15]. Især reversibilitet epigenetiske ændringer af små molekyler hæmmere betyder, at off target effekter bør være minimal og reversible efter ophør af behandling. For nylig, DNA methyltransferase-hæmmere er på et mere klinisk avanceret udviklingstrin end hæmmere af histondeacetylaser eller histon metyltransferaser, at være blevet grundigt testet i kliniske fase I-III-forsøg [16]. Den arketypiske DNA methyltransferase inhibitor decitabin (dvs. 5-aza-2′-deoxycytidin), en deoxyribose analog af 5-azacytidin, er i øjeblikket anvendes til behandling af myelodysplastisk syndrom (MDS), og er under efterforskning for behandling af akut myeloid leukæmi (AML) og andet fast kræft [17], [18]. Desuden decitabin og suberanilohydroxamic syre (SAHA, en histondeacetylaseinhibitor) samarbejder om at bevidstgøre kolon kræftceller til Fas ligand-induceret apoptose [19].

I øjeblikket er der gjort en stor indsats for at udvikle nogle anticancer terapier baseret på de små molekyler, der specifikt retter sig mod DNA demethylere protein eller EGFR, mens der ikke meget kendte oplysninger om den kombinerede effekt af EGFR-hæmmere og demethylering agenter i tyktarmskræft. Tidligere undersøgelser viste gefitinib kunne aftage kemoterapi modstand ved at hæmme transmembrane transportører af ABC familien, herunder P-glycoprotein (P-gp), multidrug resistens protein 1 (MRP1) og brystkræft resistens protein (BCRP) [20]. Baseret på disse lokaler, besluttede vi at bestemme, om kombinationen af ​​gefitinib og decitabin har synergistisk aktivitet i tyktarmen kræftceller.

I den aktuelle undersøgelse, vi forudsat prækliniske data, der viste at kombinationen af ​​gefitinib og decitabin var synergistisk på inhibering af celleproliferation, migration og inducere apoptose i dyrkede humane colon cancerceller. Desuden har vi forudsat beviserne at gefitinib kombineret med decitabin reguleret celle apoptose var involveret i mitokondrie-medieret vej og induktion af XAF1 udtryk. Tilsammen kan disse akkumulerende data vejlede udviklingen af ​​nye kolon behandlinger mod kræft.

Materialer og metoder

Cell Culture, reagenser og narkotika behandling

De tyktarmskræft-afledte cellelinjer SW1116 og LOVO blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i DMEM-medium (Gibco; Life Technologies, Carlsbad, CA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator. Celler blev dyrket i monolag og passeret rutinemæssigt 2-3 gange om ugen. decitabin og gefitinib blev indkøbt fra Selleck Chemicals LLC (Houston TX, USA). MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid], dimethylsulfoxid (DMSO), z-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone (z-VAD-fmk), necrostatin-1 , necrostatin-5 blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Efter narkotika behandling, decitabin, gefitinib, z-VAD-fmk, necrostatin-1, og necrostatin-5 blev opløst i DMSO henholdsvis portioner blev opbevaret ved -80 ° C. Stamopløsninger blev fortyndet til de ønskede slutkoncentrationer med vækstmedium lige før brug. Forud for narkotika behandling blev cellerne inkuberet i mindst 12 timer og derefter erstattet med medium indeholdende lægemidler; DMSO-behandlede celler blev anvendt som en mock kontrol.

cellelevedygtighed blev Klonogen Cell Survival apoptoseassays Salg

Cellelevedygtighed vurderes ved anvendelse af standard MTT assay. Kort beskrevet blev celler udpladet med en tæthed på 0,5-1 x 10

4 celler per brønd i 96-brønds plader og inkuberet i 12 timer i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C før behandling af de udsættes for lægemidler. Medierne blev derefter fjernet, og cellerne blev behandlet med decitabin og /eller gefitinib. Efter at cellerne var inkuberet i 48 timer, 100 pi MTT løsninger (2 mg /ml) blev tilsat til hver brønd, og pladen blev inkuberet i yderligere 4 timer ved 37 ° C. De dannede formazankrystaller blev opløst i DMSO (200 pi per brønd) under konstant omrystning i 5 minutter. Opløsningens absorbans blev derefter målt under anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA) ved 495 nm. Dette assay blev udført i tre eksemplarer

I klonogene celleoverlevelsestilstande eksperimenter, de bundne celler fra den samme 10 cm dyrkningsskål der blev trypsiniseret med 1 ml trypsin-EDTA. (Gibco; Life Technologies, Carlsbad, CA) og inaktiveret med medier indeholdende 10% FBS. Cellerne blev talt under anvendelse af et hæmocytometer og udpladet ved lav densitet (1000 pr brønds plade brønd i seks). Efter 24 timer blev medikamenter tilsat ved angivne koncentration i 24 timer. Efter fjernelse lægemidler blev celler lov til at proliferere i en befugtet 5% CO

2, 37 ° C miljø i 15 dage i frisk medium. Celler blev fikseret i 70% ethanol og farvet med 0,005% krystalviolet (Sigma, St. Louis, MO, USA) til analyse af klonogen celleoverlevelse som tidligere beskrevet [21]. Den kolonidannende enheder med mere end 100 celler blev talt under anvendelse af et lysmikroskop.

Måling af apoptose blev gennemført af Annexin V-FITC (fluoresceinisothiocyanat) /PI (propidiumiodid) analyse som tidligere [22] beskrevne. Kort beskrevet blev celler podet og behandlet med lægemidlerne i 48 timer. Bagefter blev cellerne vasket to gange med PBS og 1 x 10

6 celler blev resuspenderet i 1 ml 1 × Annexin V-bindingsbuffer. Celler, der undergår apoptotisk celledød blev analyseret ved tælling af celler, der farves positive for Annexin V-FITC og negativ for PI, og sen fase af apoptose som Annexin V-FITC og PI positive under anvendelse af FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA , USA).

kombinationsindeks

til kombinationsbehandling af decitabin og gefitinib, blev MTT-assay data konverteret til brøkdel af væksten påvirket af den enkelte lægemiddel eller kombinationen behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler og analyseret under anvendelse CalcuSyn software (Biosoft, Ferguson, MO, USA) for at bestemme, om kombinationen var synergistisk. Dette program er baseret på Chou-Talalay ligning [23], som beregner en kombination indeks (Cl). Den generelle ligning for den klassiske isobologram er givet ved: CI = (D)

1 /(Dx)

1+ (D)

2 /(Dx)

2. Hvor Dx angiver dosis af en forbindelse alene kræves for at producere en effekt, (D)

1 og (D)

2 er doserne af forbindelser 1 og 2 henholdsvis er nødvendige for at producere den samme virkning i kombination. Fra denne analyse, kan de kombinerede effekter af de to forbindelser sammenfattes således: CI 1, CI = 1, CI 1 indikerer synergistisk, additiv og antagonistiske virkninger henholdsvis

Western blot analyse

.

Celler blev lyseret på is i 30 minutter i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,5% deoxycholsyre, 0,02% natriumazid, 1% NP-40, 2,0 mg /ml aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid). Lysaterne blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-farvestof metode. Lige store mængder (30 til 60 ug) af celleekstrakt blev underkastet elektroforese i 6-12,5% natriumdodecylsulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE) og overført til PVDF-membraner (Millipore, Darmstadt, Tyskland) i antistof-blotting. Membranerne blev blokeret og derefter inkuberet med p-mTOR (Ser2448), mTOR, Akt1, p-AKT (Ser473), p-S6K, S6K, BAX, Bcl-2, spaltet caspase 3 (Asp175), spaltet PARP (Asp214) , og Actin antistoffer (alle fra cellesignalering Technologies, Massachusetts, USA). Og XAF1, XIAP antistoffer blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, U.K.). Efterfølgende blev membranerne inkuberet med et HRP-konjugeret sekundært antistof (Protein Tech Group, Chicago, IL) ved stuetemperatur i 1 time. Detektion blev udført med ECL-kittet (GE Healthcare; Munich, Germany)., Ifølge producentens instruktioner

caspaseaktivitet Assay

fluorometriske assays af caspase-aktivitet blev udført ved anvendelse af substratet Ac -DEVD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) for caspase 3 og Ac-IETD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) for caspase 8. Kort beskrevet blev cellerne lyseret i lysisbuffer (10 mM HEPES, 142 mM KCI, 5 mM MgCI2, 1 mM EDTA, 0,2% NP-40 og pH 7,2) med 10 mM DTT. Efter inkubation i 30 min på is blev prøverne centrifugeret ved 12.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C, og proteinindholdet i supernatanterne blev bestemt ved Bradford-farvestof metode. Alikvoter af 10 mg /100 ml assayvolumen blev inkuberet med 140 mM stedspecifik tetrapeptid substrater Ac-DEVD-AMC for caspase 3 og Ac-IETD-AMC for caspase 8 i en caspase assaybuffer (20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% (vægt /volumen) CHAPS, 10% (vægt /volumen) sucrose og pH 7,2) med 10 mM DTT i 30 min. Frigivelsen af ​​fluorogene gruppe AMC blev bestemt ved 37 ° C i en VersaFluor Fluorometer (Bio-Rad, Hercules, CA) med excitation ved 380 nm og emission ved 440 nm.

RNA Interference

Små interfererende RNA (siRNA) til nedregulering XAF1 genekspression blev udført ved transfektion af RNA oligonukleotider med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. En dag før transfektion blev SW1116 og LoVo-celler udpladet på en 35-mm dyrkningsskål i RPMI-1640 komplet medium. Efter cellerne nåede 50% -60% konfluens, blev de transficeret med siRNA’er som tidligere beskrevet [24]. Kort beskrevet blev celler anbragt i 1 ml siRNA blanding med 100 nM siRNA og 5 pi lipofectamin 2000. Efter 8 timers transfektion blev 1 ml RPMI-1640 komplet medium blev tilsat, og forsøg blev udført 48 timer efter transfektion. Proteinniveauer blev analyseret ved Western blot. Den negative kontrol (NC) siRNA og siRNA mod XAF1 blev syntetiseret ved Shanghai GenePharma Co. For XAF1: 5′- AUGUUGUCCAGACUCAGAG-3 ‘[25];

Ekstraktion af totalt RNA og kvantitativ reel-tid Reverse Transcription PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. cDNA blev fremstillet fra total RNA ved anvendelse vilkårlige primere (Promega, Madison, USA) og Omniscript RT kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). De relative niveauer af mRNA blev bestemt ved real-time kvantitativ revers transkription-PCR (RT-PCR) under anvendelse af en Eppendorf Realplex Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) og Quantitect SYBR Green PCR-kittet (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). XAF1 Primer sekvenser anvendt var som følger: 5′-ATGGAAGGAGACTTCTCGGT-3 ‘og 5′-TTGCTGAGCTGCATGTCCAG-3’ [26]. Actin (BioVision, Palo Alto, CA, USA) blev mRNA-niveauer anvendes til normalisering.

Statistik Salg

Alle eksperimenter blev gentaget tre gange, og blev udtrykt som middel ± SD.

P

værdier blev beregnet ved hjælp af student t-test og

P

værdi 0,05 blev betragtet som signifikant. Statistisk analyse blev analyseret ved hjælp af statistiske Package for Social Sciences (SPSS) software (version 16,0).

Resultater

Synergistiske Antineoplastiske virkninger induceret af Decitabin og Gefitinib i Colon Cancer Cells

for at bestemme virkningerne af kombinationsbehandlingen af ​​DNA methyltransferase inhibitor decitabin og EGFR-inhibitor gefitinib på human colon tumor cellelevedygtighed, SW1116 [27] og LoVo-celler [28] bærer vildtype

EGFR

gen blev udsat for forskellige koncentrationer af decitabin eller gefitinib alene eller i kombination i op til 48 timer, efterfulgt af bestemmelse af cellelevedygtighed under anvendelse af MTT-assayet. Som vist i fig. 1A og B, decitabin eller gefitinib alene forårsagede en koncentrationsafhængig hæmning af cellernes levedygtighed med IC

50 værdier på 24,2 uM (Decitabin) og 4,71 uM (gefitinib) i SW1116 celler og IC

50 værdier på 21,9 uM ( decitabin) og 5,33 uM (gefitinib) i LoVo celler. Derudover viser fig. 1A og B viser, at en kombination af decitabin og gefitinib havde en stærkere inhiberende virkning på cellelevedygtigheden af ​​SW1116 og LoVo celler end enten forbindelse alene. Endvidere fig. 1A viste, at behandling af SW1116 celler med faste koncentrationer af decitabin faldt IC

50 værdier for gefitinib fra 4,71 uM (i fravær af decitabin) til 1,25 uM (i nærvær af 5 pM decitabin) og 0,19 uM (i tilstedeværelse af 10 pM decitabin). Ligeledes faldt behandling af LoVo-celler med faste koncentrationer af decitabin IC

50 værdier for gefitinib fra 5,33 uM (i fravær af decitabin) til 0,63 uM (i nærvær af 10 uM decitabin) og 0,12 uM (i nærvær af 20 uM decitabin) (fig. 1B).

(A) og (B) SW1116 og LoVo-celler blev dyrket i kontrolbetingelser (DMSO) eller i nærvær af de angivne koncentrationer af decitabin (DAC) og gefitinib (GEF), alene eller i kombination, i 48 timer og derefter vurderet for levedygtighed ved MTT-analysen. Resultaterne er gennemsnit af dobbeltbestemmelser vurderinger fra én ud af tre uafhængige forsøg. (C) og (D) SW1116 celler og LoVo-celler blev udpladet, som behandles, og behandlet som i A og B. Dosis-respons-kurven for hvert lægemiddel blev bestemt og kombination (CI) værdier for DAC /GEF koncentrationsforhold (2,5 :1 i SW1116-celler, 2:01 i LoVo-celler) blev beregnet efter den Chou-Talalay metode på 48 h tidspunkt, med det biologiske respons udtrykkes som den del af påvirkede celler. Rektangel symbol og diamant symbol udpege CI værdi for hver fraktion påvirket (effekt). CI 1, CI = 1, CI 1 indikerer synergistisk, additiv og antagonistiske virkninger, hhv. Effekten varierer fra 0 (ingen inhibering) til 1 (fuldstændig inhibering). Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (E) Indflydelse af SW1116-celler og LoVo celler af antallet af kolonidannende celler, som bedømt ved klonogene assay. For kolonidannende assay blev klongenicitetsassayet udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Kolonner, gennemsnit af tre bestemmelser; barer, SD. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. **,

P

0,01, ***,

P

0,001 sammenlignet med DAC-behandlede celler. ##,

P

0,01, ###,

P

. 0,001 sammenlignet med GEF-behandlede celler

Disse data tydede på, at to forbindelser, decitabin og gefitinib, kan synergi til at hæmme cellernes levedygtighed i tyktarmen kræftceller. For at bekræfte dette synergisme, behandlede vi cellerne med en kombination af de to midler i et konstant forhold til hinanden og bruges CalcuSyn software til at beregne kombinationen index (CI) efter Chou og Talalay metode som beskrevet under Metoder. Fig. 1C og D afslørede en betydelig synergi mellem de to agenter (CI 1) i SW1116 og LoVo celler. Desuden ved klonogenisk celleoverlevelse assay fandt vi, at decitabin og gefitinib udøvet synergistiske virkninger til at inhibere klonogene aktivitet af SW1116 og LoVo-celler (Fig. 1E). Endvidere er de få celler overlevede decitabin plus gefitinib genereret kolonier, der var meget mindre i størrelse end dem, der genereres af celler overlever enten af ​​disse midler alene (data ikke vist). Især når de anvendes sammen, behandling af NCM460 celler, en normal human colon mucosale epitelcellelinje, med decitabin og gefitinib viste en større virkning end når hver forbindelse blev anvendt individuelt, men virkningerne var mindre end additiv tyder antagonisme (fig. S1A og B ). Desuden er en kombination af en lav koncentration af decitabin (2,5 uM) og gefitinib (1 uM for LoVo-celler og 0,5 uM for SW1116 celler) effektivt ophævet cellemigration i en synergisk måde (fig. S2A). I mellemtiden har vi opdaget cellelevedygtigheden af ​​colon cancerceller behandles ved de to midler alene eller i kombination (fig. S2B), og fandt, at kombinationen af ​​en lav koncentration af decitabin og gefitinib ikke signifikant nedsætter cellernes levedygtighed. Disse resultater viste, at reduktionen af ​​migration celler forårsaget af de to lægemidler ikke var involveret i hæmning af cellernes levedygtighed.

Decitabin og Gefitinib Kombination behandling er mere effektiv til at hæmme AKT og mTOR signalveje i Colon Cancer Cells

Decitabin og gefitinib hæmmede markant væksten af ​​to typer af kolon kræftceller sammenlignet med behandling med enten agent alene. Som AKT og mTOR signalveje spiller en kritisk rolle i cellevækst og celle apoptose, bestemte vi effekten af ​​decitabin og gefitinib på aktiveringen af ​​disse veje. Vi beregnede Cl-værdier for yderligere at finde, at kombinationen af ​​10 uM decitabin med 5 pM gefitinib i SW1116-celler eller 4 pM gefitinib i LoVo-celler var den mest effektive. SW1116 og LoVo-celler blev behandlet med decitabin og gefitinib enten alene eller i kombination. Efter 48 timer blev cellerne behandlet til Western-blot som beskrevet under metoder. Som vist i fig. 2A og B, decitabin (10 uM) kunne ikke føre til væsentlige ændringer i AKT, eller mTOR aktivitet, som vurderet ved Western blot for fosforylering af AKT, mTOR og S6K. Derudover observerede vi minimale reduktioner af fosforylering af AKT, mTOR og S6K med 5 uM gefitinib i SW1116 og 4 uM i LoVo celler. Kombinationen af ​​de to lægemidler fuldstændigt ophævet AKT og mTOR aktiviteter i SW1116 og LoVo-celler (fig. 2A og B).

(A) og (B) SW1116 og LoVo-celler blev udpladet, behandlet i 48 h med decitabin (DAC) og gefitinib (GEF) enten alene eller i kombination, og ekspressionsniveauerne af AKT, mTOR, S6K, og phosphorylering blev bestemt ved Western blot-analyse som beskrevet under Metoder. Ekspression af β-actin tjente som en loading kontrol. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Decitabin synergistisk Gefitinib-induceret apoptose i Colon Cancer Cells

For at afgøre, om de cytotoksiske virkninger af gefitinib kombineret med decitabin skyldtes induktion af apoptose, blev SW1116 og LoVo-celler behandlet med de to forbindelser, alene eller i kombination, i 48 timer og derefter celleapoptose blev bestemt ved Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) farvning og flowcytometri-analyse. Som vist i fig. 3A og C, behandling med gefitinib (2 uM eller 5 uM) eller decitabin (10 uM) alene havde svage virkninger på apoptose i SW1116-celler. Der var imidlertid en signifikant højere apoptose pris fundet efter behandling med kombinationen af ​​gefitinib og decitabin (fig. 3A og C). Lignende resultater blev fundet i LoVo celler (Fig. 3B og C). Endvidere blev celle apoptose målt ved påvisning sub-G1 population med PI-farvning og flowcytometri-analyse. Som vist i fig. S3, de sub-G1 population procenter induceret af behandlingerne med kombinationen to lægemidler var større end dem, fremkaldt af narkotika individuelt.

(A) og (B) SW1116 og LoVo celler blev dyrket i kontrol betingelser ( DMSO) eller i nærvær af de angivne koncentrationer af decitabin (DAC) og gefitinib (GEF), alene eller i kombination, i 48 timer. Og derefter blev cellerne farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) og analyseret ved flowcytometri. Dette eksperiment blev udført tre gange og repræsentative diagrammer af Annexin V-FITC assays er vist. (C) kvantitativ måling af Annexin V-FITC flowcytometri analyser viste positive apoptotiske celler som respons på DAC og GEF, alene eller i kombination. Kolonner, betyder; barer, SD. **,

P

0,01, ***,

P

0,001 sammenlignet med DAC-behandlede celler. ##,

P

0,01, ###,

P

0,001 sammenlignet med GEF-behandlede celler. (D) og (E) SW1116 og LoVo-celler blev forbehandlet med 10 uM z-VAD-fmk (zVAD) eller 20 uM necrostatin-1 (Nec1) eller necrostatin-5 (Nec5) i 1 time efterfulgt af behandling med den angivne koncentrationer af DAC og GEF, alene eller i kombination, for yderligere 48 timer. Og derefter de apoptotiske celler blev bestemt ved Annexin V-FITC /PI-farvning og flowcytometri-analyse. Dette forsøg blev gentaget tre gange. Kolonner, betyder; barer, SD. **,

P

. 0,01

For at afgøre, hvorvidt gefitinib plus decitabin forårsaget caspasekaskaden, den pan caspaseinhibitoren z-VAD-fmk (10 pM) blev anvendt at forbehandle SW1116 eller LoVo celler, før behandlingen af ​​gefitinib plus decitabin. Som vist i fig. 3D og E, z-VAD-fmk kan bemærkelsesværdigt begrænse celle apoptose induceret af gefitinib plus decitabin. Imidlertid kunne celleapoptosen udløst af de to forbindelser i kombination ikke blokeres af necrostatin-1 eller necrostatin-5, en ny klasse af potente små molekyler inhibitorer af cellenekrose. Disse resultater viste, at apoptosecyklus var involveret i celledød induceret af gefitinib kombineret med decitabin, i tyktarmen kræftceller.

Decitabin og Gefitinib kombinationsbehandling Alters ekspressionsniveauerne af Apoptotiske Regulatory Faktorer i Colon Cancer Cells

da apoptose stramt reguleres af pro- og anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-protein-familien, de proapoptotiske faktorer BAX, byde og BIM samt de antiapoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-XL blev undersøgt i SW1116 og LOVO celler efter behandling med decitabin eller gefitinib eller deres kombination ved Western blot-analyse. SW1116 og LoVo celler reagerer på decitabin plus gefitinib manifesteret øgede mængder af den proapoptotiske BAX samt væsentlig reduktion i niveauet af anti-apoptotiske protein Bcl-2 (fig. 4A og B). Men de to forbindelser i kombination ikke påvirke ekspressionsniveauerne af andre medlemmer af Bcl-2-protein familien, herunder proapoptotiske proteiner byde og BIM samt antiapoptotisk protein Bcl-XL (data ikke vist).

SW1116 og LoVo-celler blev udpladet, behandlet i 48 (DAC) og gefitinib (GEF) enten alene eller i kombination. (A) og (B) ekspressionsniveauerne af spaltet-caspase 3, spaltes-PARP, XAF1, XIAP, BAX, Bcl-2 blev bestemt ved Western blot-analyse som beskrevet under Metoder. Ekspression af β-actin tjente som en loading kontrol. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) og (D) Den caspase 3-aktivitet blev kvantificeret som beskrevet under metoder. Dette forsøg blev gentaget tre gange. Kolonner, betyder; barer, SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001. (E) og (F) Caspase 8-aktivitet blev kvantificeret som beskrevet under Metoder. Dette forsøg blev gentaget tre gange. Kolonner, betyder; barer, SD. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

. 0,001

Inhibitor af apoptose protein (IAP) er et protein familie virker gennem hæmning af caspase aktivitet. X-linked IAP (XIAP), et medlem af IAP, og XIAP-associeret faktor 1 (XAF1) blev undersøgt i colon cancerceller stimuleret med decitabin sammen med gefitinib. Fig. 4A og B indikerede, at ingen ændringer i XIAP proteinniveauer blev fundet i SW1116 og LoVo celler behandlet ved decitabin og gefitinib alene eller i kombination. Især kombineret behandling med begge lægemidler bemærkelsesværdigt forøgede ekspressionen af ​​XAF1 sammenlignet med enkelt middel behandling (fig. 4A og B).

For at teste evnen af ​​gefitinib kombineret med decitabin at aktivere caspaser, spaltet caspase 3 og spaltes PARP blev undersøgt i SW1116 og LoVo-celler efter behandling med gefitinib eller decitabin eller deres kombination ved Western blot analyse. Betydelig stigning i de mængder af både kløvet caspase 3 og kløvet PARP blev noteret i tyktarmskræft celler behandlet med to lægemidler i kombination i forhold til behandling med enkelte midler (fig. 4A og B). Desuden blev tyktarmskræft celler behandlet med de to forbindelser analyseret for caspase 3 og caspase 8 aktiviteter ved fluorogent substrat spaltning. Som vist i fig. 4C og D, coloncancer celler behandlet med to forbindelser i kombination udviste signifikant stigning i caspase 3-aktivitet. Derudover decitabin plus gefitinib udøves tidsafhængige caspase 3-aktivitet induktioner på SW1116 og LoVo-celler (fig. 4C og D). I modsætning hertil blev der fundet nogen ændringer i caspase 8 aktiviteter (fig. 4E og F).

XAF1 spiller en afgørende rolle i cellulær apoptose udløst af Decitabin Kombineret med Gefitinib

De data, vist ovenfor angivne at decitabin kombineret med gefitinib øgede XAF1 niveauer i SW1116 og LoVo-celler. Vi spurgte derefter, om de to lægemidler i kombination kan øge XAF1 mRNA-niveauer i colon cancerceller. Som vist i fig. 5A og B, XAF1 mRNA niveauer blev forøget betydeligt ved decitabin plus gefitinib. Endvidere blev coloncancer-celler behandlet med de to lægemidler i kombination for forskellige tidsintervaller. Vi viste, at XAF1 protein og mRNA-niveauer blev øget med decitabin plus gefitinib i en tidsafhængig måde (fig. 5C, D, E og F).

(A) og (B) SW1116 og LoVo-celler var behandlet i 48 timer med de angivne koncentrationer af decitabin (DAC) og gefitinib (GEF) enten alene eller i kombination. MRNA ekspressionsniveauer af XAF1 blev bestemt ved real-time kvantitativ PCR. Ekspression af β-actin tjente som kontrol. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Kolonner, betyder; barer, SD. **,

P

0,01; **,

P

0,001. (C) og (D) SW1116 og LoVo-celler blev behandlet i de angivne tidsintervaller med de angivne koncentrationer af DAC og GEF i kombination. Ekspressionsniveauerne af XAF1 blev bestemt ved Western blot-analyse som beskrevet under metoder. Ekspression af β-actin tjente som en loading kontrol. Dataene er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Som vist i fig.