PLoS ONE: Prækliniske Evaluering af Novel, oralt Biotilgængeligt selektiv inhibitor af Nuclear Export (SINE) KPT-335 i Spontan Canine Cancer: Resultater af et fase I Study

Abstrakt

Baggrund

formålet med denne undersøgelse var at evaluere aktiviteten af ​​selektive hæmmere af Nuclear Export (SINE) forbindelser, der hæmmer funktionen af ​​den nukleare eksport protein exportin 1 (XPO1 /CRM1) mod hunde tumorcellelinjer og udføre en klinisk fase i forsøg med KPT -335 hos hunde med spontan kræft at give en foreløbig vurdering af biologisk aktivitet og tolerabilitet.

Metoder og Resultater

canine tumorcellelinier afledt af ikke-Hodgkins lymfom (NHL), mast celle tumor , melanom og osteosarkom udviste vækstinhibering og apoptose som respons på nanomolære koncentrationer af SINE forbindelser; NHL celler var særligt følsomme i IC

50 koncentrationer i området fra 2-42 nM. En klinisk fase I studie med KPT-335 blev udført i 17 hunde med NHL (naiv eller recidiverende), mast celle tumor eller osteosarkom. Den maksimalt tolererede dosis var 1,75 mg /kg indgivet oralt to gange /uge (mandag /torsdag) selv biologisk aktivitet blev observeret ved 1 mg /kg. Klinisk fordel (CB) herunder delvis respons på terapi (PR, n = 2) og stabil sygdom (SD, n = 7) blev observeret i 9/14 hunde med NHL med en median tid til progression (TTP) for respondenter på 66 dage (rækker 35-256 dage). En dosis ekspansion undersøgelse blev udført i 6 hunde med NHL givet 1,5 mg /kg KPT-335 mandag /onsdag /fredag; CB blev observeret i 4/6 hunde med en median TTP for respondenter på 83 dage (interval 35-354 dage). Toksiciteter var primært gastrointestinale bestående af anoreksi, vægttab, opkastning og diarré og var håndterbare med understøttende behandling, dosis modulation og administration af lav dosis prednison; hepatotoksicitet, anoreksi og vægttab var den dosisbegrænsende toksiciteter.

Konklusioner

Denne undersøgelse dokumenterer, at romanen oralt biotilgængeligt XPO1 hæmmer KPT-335 er sikkert og udviser aktivitet i en relevant, spontan store dyremodel af cancer. Dataene fra denne undersøgelse giver vigtige nye oplysninger, der lægger grunden til evaluering af SINE-forbindelser i human cancer

Henvisning:. London CA, Bernabe LF, Barnard S, Kisseberth WC, Borgatti A, Henson M, et al. (2014) Prækliniske Evaluering af Novel, oralt Biotilgængeligt selektiv inhibitor af Nuclear Export (SINE) KPT-335 i Spontan Canine Cancer: Resultater af en fase I undersøgelse. PLoS ONE 9 (2): e87585. doi: 10,1371 /journal.pone.0087585

Redaktør: Kristy L. Richards, University of North Carolina i Chapel Hill, USA

Modtaget: 10 juni, 2013; Accepteret: December 28, 2013; Publiceret: 4 februar 2014

Copyright: © 2014 London et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. De finansieringskilder (Karyopharm Therapeutics) bistået i undersøgelsen design og redigeret manuskriptet efter forberedelse. Karyopharm Therapeutics havde ingen rolle i dataindsamling, dataanalyse eller faktisk forberedelse af selve manuskriptet den

Konkurrerende interesser:. Jeg har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter. J S-M, DM, MK, og SS er alle medarbejdere i Karyopharm Therapeutics. Det kliniske forsøg arbejde blev finansieret af Karyopharm terapi. CAL har modtaget honorarer fra Karyopharm Therapeutics. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Udveksling af proteiner mellem kernen og cytoplasmaet er en tæt reguleret proces, der involverer flere proteiner, der er ansvarlige for shuttling gods ind og ud af kernen. Der er syv kendte kerneproteiner udførsel (exportin 1-7), der bærer makromolekyler fra kernen til cytoplasmaet [1], [2], [3]. Exportin 1 (XPO1, også kaldet kromosomområde Vedligeholdelse protein 1 [CRM1]) er et medlem af karyopherin β familien af ​​transport receptorer, der binder en meget forskelligartet sæt af ca. 220 målproteiner gennem en hydrofob leucin-rige nuklear eksport signal (NES) stede i lasten [4]. Interaktion af NES-directed protein fragt med lille GTPase-molekyle Ran fører til cytoplasmatisk transport via et nukleart pore kompleks [5]. XPO1 er den eneste nukleare eksportør af flere store tumor suppressor og vækstregulerende proteiner (TSP’er og GRP, herunder p53, p75, Rb, p21, p27, STAT3, FOXO og IKB blandt andre) [6], [7]. Ekspression af XPO1 vides at være opreguleret i en række både hæmatologiske maligniteter og faste tumorer, og dette korrelerer med en dårlig prognose [1], [2], [3], hvilket indikerer, at ændringer i nuklear-cytoplasmatisk handel resulterer i aberrerende lokalisering af vigtige proteiner kan bidrage til tumorigenese og potentielt resistens over for behandling.

Adskillige småmolekyleinhibitorer af XPO1 er blevet udviklet og afprøvet mod en række forskellige neoplastiske celler, primært

in vitro

. Disse omfatter Leptomycin B, ratjadone, anguinomycin, goniothalamin, blandt andet, at binde kovalent til en reaktiv cysteinrest (Cys528) placeret i NES-bindende fordybning af XPO1 [1], [2], [3]. Denne binding funktionelt inaktiverer XPO1 på en irreversibel måde og målretter proteinet for proteasom nedbrydning [8], hvilket resulterer i genoprettelsen af ​​TSP og GRP cellulær lokalisering og funktion. For eksempel Leptomycin B forvolder nuklear fastholdelse af BCR-ABL1 fusionsproteinet og inducerer apoptose ved samtidig administration med imatinib til CML celler

in vitro

[9]. Mens Leptomycin B udviser aktivitet mod flere kræftceller

in vitro

og mus xenograft tumormodeller, inducerer signifikant systemisk toksicitet i både dyr og mennesker resulterer i afbrydelse af den kliniske udvikling [10]. På det seneste har analoger af Leptomycin B blevet udviklet, som demonstrerer større styrke

in vitro

in vivo

med en betydeligt reduceret toksicitet profil i mus [11]. Men disse midler kræver intravenøs levering, begrænser hyppigheden af ​​narkotika administration.

For nylig, roman, narkotika-lignende, oralt biotilgængelige, små-molekyle selektiv inhibitor af Nuclear Export (SINE) forbindelser, der specifikt og irreversibelt binder til XPO1 på reaktive sted Cys 528 rester er blevet udviklet [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Disse er langsomt reversible med en t

1/2 af ca. 24 timer, og føre til funktionel inaktivering af XPO1 proteinet. SINE forbindelser er blevet vist at inducere apoptose og blokere proliferation i flere cancercellelinier, herunder sådanne afledt af colon [6], pancreas [12], og brystcarcinomer [16] samt kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) [15], samtidig skåne normale celler [19]. Yderligere undersøgelser har vist potent anti cancer aktivitet og god tolerabilitet af SINE

in vivo

ved hjælp af musen human xenograft (subkutan, ortotopisk eller leukemograft) modeller af bugspytkirtelkræft [12], nyrekræft [20], CLL [15 ], kappecellelymfom (MCL) [18], myelomatose [8] og akut myeloid leukæmi (AML) [17]. Disse data understøtter opfattelsen af, at SINE forbindelser vil have biologisk aktivitet i mennesker med kræft.

Spontane hunde kræft udviser mange kliniske og molekylære ligheder med menneskelige kræftformer og som sådan, tjene som en attraktiv model for prækliniske studier, der evaluerer den biologisk aktivitet og toksicitet af nye kræftlægemidler. Sådanne studier er blevet anvendt til at validere aktiviteten af ​​multi-målrettede receptor tyrosinkinaseinhibitorer (toceranib) [21], [22], nye kemoterapeutiske midler (GS-9219) [23], og forskellige andre småmolekylære inhibitorer (ibrutinib, STA -1474) [24], [25]. Derfor er formålet med dette arbejde var at undersøge effekten af ​​SINE forbindelser i hunde spontane kræftformer. Konkret blev deres aktivitet først vurderes

in vitro

mod hunde tumorcellelinier med særlig vægt på hæmatopoietiske tumorer, hvorefter en fase I undersøgelse med romanen SINE KPT-335 blev udført i hunde med metastatisk osteosarkom, mast celle tumor og ikke-Hodgkin lymfom (NHL). Disse undersøgelser lagde grunden til den aktuelle fase I evaluering af SINE sammensatte KPT-330 i mennesker med kræft og for en potentielt afgørende studie af KPT-335 til hunde med nyligt diagnosticeret eller recidiverende NHL.

Materialer og metoder

primær tumor prøver og Cell Culture

Kryopræserverede tumorceller opnået fra sterile lymfeknude biopsi prøver fra hunde med diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL) blev dyrket med 100 ng /ml megaCD40L (Enzo Life Science, Plymouth Meeting, PA) som tidligere beskrevet [26], [27]. Den humane T-celle-leukæmi-cellelinje, Jurkat, var fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i RPMI1640-medium (Gibco /BRL, Grand Island, NY) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO), 2-mercaptoethanol (Gibco /BRL), HEPES, L-glutamin, natriumpyruvat (Mediatech Inc., Manassas, VA), ikke-essentielle aminosyrer (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) og Primocin (Invivogen, San Diego, CA). Den hund DLBCL cellelinje CLBL1 fås fra Dr. Barbara Rütgen (universitetet i Wien, Østrig) [28], [29] og menneskelige DLBCL cellelinier OCI-Ly3 [30], [31] og OCI-Ly10 [32] fås fra Dr. Anne Novak (Mayo Clinic Cancer center, Rochester, MN) blev dyrket i komplet Iscoves Modificeret Dulbeccos medium (IMDM) indeholdende 20% FBS, L-glutamin og Primocin. Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Følgende yderligere hunde tumorcellelinier blev anvendt til at evaluere svar på SINE forbindelser: C2, mastcelletumor line leveret af Dr. George Caughey, UCSF, San Francisco, CA [33]; OSA16, osteosarcomcellelinie, leveret af Dr. Jaime Modiano, UM, Minneapolis, MN [34]; og 323.610 til 3, malignt melanom cellelinie, leveret af Dr. Michael Kent, UCD, Davis, CA [35]. Alle cellelinjer blev dyrket i komplet RPMI medier indeholdende 10% FBS, antibiotika /antimykotiske, HEPES, natriumpyruvat, ikke-essentielle aminosyrer og Glutamax (medier kosttilskud fra Gibco).

Levedygtighed og spredning Analyser

Cellelevedygtighed for lymfoide linjer blev bestemt ved MTS (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) under anvendelse af CellTiter 96 ® AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI). Kort fortalt, for lymfoide cellelinier, 5 × 10

4 celler (eller 1 × 10

5 primære DLBCL celler) blev dyrket i 100 pi komplet medium i 96-brønds plader i nærværelse af SINE forbindelser. Efter 72 timer blev 20 pi af MTS-opløsning tilsat til hver brønd og cellerne blev inkuberet i yderligere 4 timer før måling af absorbans ved 490 nm ved anvendelse af en Wallac Victor 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer, Waltham, MA). IC

50 af SINE blev beregnet ved anvendelse Prism 6 software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

For de ikke-lymfoide cellelinier, 96-brønds plader blev podet tre gange i 90 uL med 2500 celler /brønd af OSA16, 5000 celler /brønd C2, og 2500 celler /brønd af 323.610 til 3. Podede plader blev dyrket natten derefter behandlet den følgende dag med 10 pi KPT-214 i C10 medier i koncentrationer på 0,0001, 0,01, 0,1, 1,0 og 10 uM. Plader blev opsamlet ved 92 timer, centrifugeret ved 1300 rpm, og supernatanten blev fjernet ved at invertere plader på absorberende papir. Pladerne blev derefter forseglet og øjeblikkeligt anbragt ved -80 ° C i minimum 12 timer. Pladerne blev derefter optøet og CyQUANT ®Cell Proliferation Assay (Life Technologies) blev udført ved at følge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev 200 pi af det fortyndede arbejder CyQUANT opløsning tilsat til hver brønd og beskyttet mod lys. Fluorescens blev målt under anvendelse af en SpectraMax M2 mikropladelæser ved 480 nm excitation og 520 nm emission. Resultater blev repræsenteret som procent af kontrol, eller plottes at beregne IC

50 værdier ved 92 timer.

Apoptose Assay

Jurkat-celler og primære hunde DLBCL celler blev dyrket i 24 timer i nærvær af 100 nM KPT-335 eller dimethylsulfoxid (DMSO). Celler blev farvet med Annexin V (eBiosciences, San Diego, CA) ifølge producentens anvisninger. Flowcytometri blev udført under anvendelse af en BD LSRII flowcytometer (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) og resultaterne blev analyseret ved anvendelse FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR).

immunblotting

kryopræserveret primære hunde DLBCL og CLBL1 celler blev lyseret i RIPA-buffer indeholdende 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1,0% Triton X-100, 1,0% natriumdeoxycholat, 5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol og en proteinaseinhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Uopløseligt materiale blev fjernet ved centrifugering, og proteinkoncentrationer på cellelysaterne blev bestemt under anvendelse af BioRad Protein Assay kit (BioRad, Hercules, CA). Proteiner (100 ug) blev separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner (BioRad, Hercules, CA). Antistof farvning blev udført under anvendelse af SNAP i.d. systemet (EMD Millipore, Billerica, MA) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Kort beskrevet membranen blev blokeret med 50% LI-COR blokeringsbuffer (LI-COR, Lincoln, NE) og farvet med kanin-anti-XPO1 antistof (1:66 fortynding, Santa Cruz, Santa Cruz, CA) og muse-anti-actin-antistof (1:1666 fortynding, Sigma-Aldrich), efterfulgt af sekundær æsel-anti-kanin-antistof konjugeret til IRDye800 og anti-muse-antistof konjugeret til IRDye680 (1:3,333 fortynding, LI-COR). Detektion blev udført ved anvendelse af Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).

KPT-335 Formulering

KPT-335 blev fremstillet som gelatine kapsler i styrker i området fra 2,5 mg til 20 mg aktive farmaceutiske bestanddel (API). API var vådformalede med Lutrol F68 NF (BASF) og vand i en Microfluidics mikro-fluidiseringsapparat, kombineret med Plasdone K29 /30 (ISP Technologies) og lyofiliseret. Lyofiliserede pulvere indeholdt 70-75% API. Kapsler blev individuelt hånd fyldt med lyofiliseret pulver til den ønskede doseringsstyrke. Alle hjælpestoffer var egnede kvaliteter til brug i lægemidler.

analyser hos raske hunde

KPT-335 blev administreret som en enkelt oral dosis i kapsel-formulering til 6 hanbeaglehunde på ca. 1,5 mg /kg efter et måltid. Serielle blodprøver blev opsamlet fra hver hund før dosering og ved 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24 og 48 timer efter dosis og anbragt i rør indeholdende K

2EDTA. Blodprøver blev lagret på våd is, indtil den forarbejdes til plasma ved centrifugering ved 3500 rpm i 10 minutter ved 5 ° C. Plasmaprøver blev opbevaret i ved -80 ° C indtil analyse ved Agilux Laboratories (Worcester, MA). Plasmaprøver blev analyseret for forælder medikamentkoncentration ved hjælp prøveforberedelse ved protein udfældning og derefter analyse ved LC-MS /MS ved anvendelse propranolol som den interne standard. Metoden blev kvalificeret til brug (en enkelt batch for at vurdere metoden præstationer: præcision og nøjagtighed, linearitet fortynding og matrix specificitet) før påbegyndelse af analysen. Godkendelseskriterier for kalibrering standarder og prøver kvalitetskontrol var inden for ± 30% nominelle koncentration. Individuelle dyr farmakokinetiske parameterværdier blev afledt ved den farmakokinetiske analyseprogram Phoenix WinNonlin udgave 6.3 (Pharsight Corporation) ved anvendelse af ikke-kompartment model 200 med ensartet vægtning. De enkeltdosis farmakokinetiske parametre vurderes nævnes: C

max (maksimal koncentration observeret); T

max (tid af observeret maksimal koncentration); AUC

0 → ∞ (arealet under koncentrations-tids-kurven fra tid nul ekstrapoleret til uendeligt); AUC

0 → sidste (arealet under koncentrations-tids-kurven fra tid nul til tidspunktet for den sidste kvantificerbare koncentration); og t

1/2 (terminal halveringstid). Deskriptive statistiske data (middelværdi, standardafvigelse og standardafvigelse af middelværdien) blev beregnet ud fra de afrundede tal er i et Excel (Microsoft) regneark. Koncentration resultater blev midler, og beregnede parametre rapporteres til 3 betydende cifre.

Clinical Trial Berettigelse

Denne kliniske forsøg blev godkendt af Ohio State University (OSU) Veterinary Medical Center (VMC) Klinisk Forskning det rådgivende Udvalg og OSU IACUC; IACUC godkendelse blev også opnået ved University of Minnesota og Texas A M University. Skriftligt informeret samtykke fra ejeren af ​​hver hund blev opnået før studere indrejse. KPT-335 blev administreret til hunde med metastatisk osteosarkom, mast celle tumor eller NHL, som havde undladt konventionel behandling, eller for hvilke der ikke var nogen terapeutiske alternativer, eller for hvilke konventionel behandling ikke var ønsket af ejeren. For at være berettiget til undersøgelsen, hver hund skal have været afgjort diagnosticeret via cytologi eller histopatologi og havde mødt alle inklusionskriterierne og ingen af ​​udelukkelseskriterierne. Yderligere støtteberettigelseskriterier inkluderet: 1 år gammel ved studiets start; tilstrækkelig organfunktion; mindst 2 uger siden kemoterapi eller strålebehandling med fuldstændig helbredelse fra den akutte toksicitet af disse behandlinger (3 uger til en kirurgisk procedure); mindst 1 uge siden tidligere behandling med andre lægemiddelproduktkandidaten; og ingen tegn på hjernemetastaser eller enhver alvorlig systemisk lidelse uforenelig med undersøgelsen skøn investigator.

Study Design

Denne undersøgelse var en fase I dosiseskaleringsstudie, open label vurdering af sikkerhed og biologisk aktivitet af KPT-335 i klient ejede hunde med spontane maligniteter. Vurdering af kliniske toksiciteter og tumor respons blev udført ved hvert besøg. Hunde blev evalueret for hæmatologisk og biokemiske toksiciteter hver 7 dage med rutine blodprøven. Den indledende dosis på 1 mg /kg oralt to gange om ugen (mandag /torsdag eller tirsdag /fredag) var baseret på tidligere data fra normale laboratorie hunde (data ikke vist) og dosisøgning blev fastsat til trin 0,25 mg /kg i kohorter af 3 indtil dosisbegrænsende toksicitet (DLT) blev identificeret. Den DLT blev anset for at være nogen grad 3 eller 4 hæmatologisk eller ikke-hæmatologisk toksicitet baseret på de etablerede VCOG-CTCAE kriterier [36]. Derudover eventuelle kroniske non-grade 3 eller 4 toksiciteter anses for væsentligt forringe livskvaliteten (dvs. sløvhed, appetitløshed) var kvalificeret som DLT. Sygdomsprogression eller tegn og symptomer absolut relateret til sygdom, blev ikke anset for bivirkninger (bivirkninger). Den maksimalt tolererede dosis (MTD) blev anset for at være en dosis under den, ved hvilken DLT indtraf.

Toksicitet Assessment

Hver patient gennemgik en baseline komplet historie, fysisk undersøgelse, og præ-dosis laboratorium vurdering, der omfattede en komplet blodtælling (CBC), serum biokemi profil, koagulationsparametre (PT /PTT) og urinanalyse. Patienterne blev vurderet for utilsigtede hændelser på dag 7, 14, 21 og 28, og hver 2. uge derefter, på hvilket tidspunkt alle laboratorieresultater blev gentaget. Bestemmelser vedrørende minimale hæmatologiske krav til fortsat dosering blev inkluderet i protokollen: hæmatokrit 25%, neutrofiler 1500 /L, blodplader 100.000 /L. Desuden blev levertransaminaser skal være . 4X øvre grænse for normal med en normal total bilirubin og serum kreatinin at fortsætte KPT-335 terapi

samtidig medicin

At behandle narkotikarelaterede gastrointestinale toksiciteter blev understøttende behandling administreres efter behov til hunde deltager i denne undersøgelse. Dette bestod typisk af famotidin, omeprazol, metronidazol, loperamid, metoclopramid, ondansetron, og /eller maropitant. Antihistaminer blev administreret til hunde med mastcelletumorer, da disse tumorer er kendt for at frigive histamin. Andre understøttende behandling gives til hunde bestod af prednison og non-steroide anti-inflammatoriske medicin til behandling af tumor-associerede inflammation, appetitløshed, og for smerter kontrol.

tumorrespons Assessment

Tumor vurderingerne blev afsluttet før studere indrejse, og dage 7, 14, 21, og 28. til hunde, der fortsatte ud over 4 uger blev respons vurderinger udført hver 2. uge derefter, eller på tidspunktet for mistanke tumor progression. Svarene blev vurderet af investigator efter foruddefinerede protokol kriterier. Svaret på hunde med vurderbare sygdom blev udført ved klinisk undersøgelse, ultralydsscanning eller thorax røntgen. Mange læsioner var ikke modtagelig for kvantitativ radiografisk billeddannelse, men blev enten efterfulgt af seriel klinisk undersøgelse (overfladiske læsioner, håndgribelige lymfeknuder) eller ved ultralydsundersøgelse (abdominale lymfeknuder). Thorax læsioner blev vurderet af thorax røntgen.

Svaret på hunde med målbar sygdom blev vurderet af investigator på grundlag af svar evalueringskriterier for Peripheral Nodal lymfom hos hunde (v1.0) [37]. En komplet respons (CR) blev defineret som forsvinden af ​​alle sygdomme på to målinger adskilt af en periode på 3 uger minimum. En partielt respons (PR) blev defineret som mere end 30% reduktion i summen af ​​den længste diameter af target-læsioner dokumenteret ved to vurderinger adskilt af mindst 3 uger. En stigning på 20% i størrelsen af ​​alle målbare tumor områder som målt ved summen af ​​længste diametre af target-læsioner taget som reference den mindste sum siden initiering af behandlingen, eller fremkomsten af ​​en ny læsion (r) ville kvalificere som progressiv sygdom (PD). Stabil sygdom (SD) blev defineret ved fravær af kriterier for enten en reaktion eller progression; skal betragtes SD skal hunde har vist nogen tegn på PD i 28- dages forløb. Hunde, der havde ingen tegn på tumor progression, og som ikke havde oplevet nogen uacceptabel toksicitet var berettiget til udvidet behandlingsserier. Dosisøgning fra to gange om ugen administration til tre gange om ugen administration i en individuel hund var tilladt, hvis hunden var tolerere terapi.

Livskvalitet Assessment

Et værktøj til at vurdere livskvaliteten i hunde med kræft under behandlingen er tidligere blevet offentliggjort [38]. Dette blev anvendt til at vurdere ejer opfattede ændringer i hunde gennemgår KPT-335 behandling både under dosisstigning og dosis ekspansion undersøgelser. En samlet livskvalitet (QOL) score blev oprettet på grundlag af svarene på spørgsmål om livskvalitet spørgeskema. Pointene fra hvert spørgsmål blev opsummeret resulterer i en samlet livskvalitet score, som kunne variere fra 23 til 115. Tendenser i livskvalitet (QOL) i løbet af undersøgelsen blev undersøgt ved hjælp af lineære mixed modeller indeholder faste effekter af tid og en autoregressiv korrelationsstrukturen for de tilfældige fejl. Wald tests blev anvendt til at teste for en betydelig ændring i QOL med frihedsgrader beregnet ved hjælp af Kenward-Roger metoden [39]. Målinger opnået efter 90 dage blev ikke medtaget i analysen for dosiseskaleringsstudie og måling efter 70 dage ikke var inkluderet i analysen af ​​dosis ekspansion data som følge af nogle datapunkter efter disse tidspunkter.

Resultater

Aktivitet af SINE forbindelser mod canine tumorceller

in vitro

Vi først evalueret effekten af ​​KPT-185, som er en af ​​de mest potente SINE forbindelser, men med begrænset oral biotilgængelighed og derfor kun egnet til

in vitro

studier på Jurkat (human T-celle leukæmi celler) og 6 primære hunde DLBCL prøver (5 adskilte tumorer med et par af samme tumor). KPT-185 inhiberede effektivt levedygtighed Jurkat og hunde DLBCL celler (figur 1A og tabel 1). IC

50 af KPT-185 mod Jurkat (n = 3) og den primære hunde DLBCL prøver (n = 6) var 8,7 ± 0,7 nM og 13,3 ± 6,2 nM. KPT185-trans-isomeren (som har -100 gange mindre XPO1 hæmning aktivitet med cis-isomeren), viste meget mindre toksicitet, når det blev testet under anvendelse Jurkat-celler og en af ​​de primære hunde DLBCL prøver (IC

50 var 1000nM i begge tumorceller). Dernæst vi evaluerede effekten af ​​KPT-335, en klinisk kandidat-forbindelse med god oral eksponering anvendes i dette kliniske forsøg, på hunde og mennesker DLBCL celler. KPT-335 inhiberede levedygtighed OCI-Ly3, OCI-Ly10, og CLBL1 på IC

50 på 2,1 ± 1,3 nM, 41,8 ± 21,0 nM og 8,5 ± 4,1 nM (figur 1B og tabel 1). Vi viste også KPT-335 inducerede apoptose i CLBL1 og primærbatterier hunde DLBCL celler under anvendelse af flowcytometri. Behandling af celler med KPT-335 i 24 timer øget apoptotiske celler (Annexin V

+ -celler) sammenlignet med mock-behandlede celler (figur 1C). Endelig bekræftede vi ekspressionen af ​​XPO1, som blev påvist ved den skønnede størrelse af XPO1 (~123 kDa), i hunde celler under anvendelse af CLBL1 cellelinie, humane DLBCL cellelinier og hunde primære DLBCL celler (figur 1D). Tilsammen både mennesker og hunde DLBCL udtrykker XPO1 og SINE forbindelser viser potent aktivitet mod disse tumorceller, hvilket tyder på en potentiel terapeutisk fordel for menneskerettighederne og hunde patienter med DLBCL.

(A) Jurkat celler og primære hunde DLBCL celler (prøve # 1-5, # 5 blev testet uafhængigt to gange) blev dyrket i 96-brønds plader i 72 timer med log seriefortyndinger af KPT-185 og cellelevedygtigheden blev analyseret under anvendelse af MTS-assayet. Hvert forsøg blev udført i dobbelte brønde og forsøg blev gentaget tre gange (B) Human og hunde DLBCL celler blev dyrket i en 96-brønds plade i 72 timer med 3-fold serielle fortyndinger (0-1000 nM) på KPT-335 og analyseret ved hjælp af MTS-assayet. Hvert forsøg blev udført i dobbelte brønde og forsøg blev gentaget tre gange. (C) CLBL1 celler og primære hunde DLBCL celler (prøve # 1) blev behandlet med 100 nM KPT-335 i 24 timer og analyseret for apoptose ved anvendelse af flowcytometri. Eksperimenter blev udført tre gange uafhængigt og de gennemsnitlige resultater er vist. (D) Ekspression af XPO1 i humane og hunde DLBCL cellelinier. Proteinlysater fremstillet fra OCI-Ly3, OCI-Ly10, og CLBL1 blev separeret ved SDS-PAGE og udsat for immunblotting for XPO1; β-actin tjente som kontrol.

For at give en foreløbig vurdering af den potentielle aktivitet af SINE XPO1 antagonister mod yderligere hunde kræft, C2 mastcelletumor linje, den OSA16 osteosarcomcellelinie og 323.610 til 3 melanoma cellelinien blev anvendt. Til disse undersøgelser en tidligere analog, KPT-214, var til rådighed for de i vitro forsøg (Figur 2). IC

50 af KPT-214 mod C2, OSA16 og 323.610 var 490 nM, 89 nM, og 70 nM. Sammenfattende SINE udviser biologisk aktivitet

in vitro

mod en lang række af hunde tumorcellelinjer, med lymfoide linier er den mest følsomme i den meget lave nanomolære område. Disse data støttede efterfølgende

in vivo

evaluering af SINE i hunde med spontane kræftformer, med særlig vægt på hunde NHL.

Canine tumorcellelinier C2 (mast celle), OSA16 (osteosarkom) og 323.610 til 3 blev dyrket i plader med 96 brønde i tre eksemplarer med serielle fortyndinger af KPT-214 for 92 timer, hvorefter pladerne blev opsamlet, mediet fjernet, og pladerne blev nedfrosset ved -80 ° C. Analyse for virkninger på celleproliferation blev derefter udført under anvendelse af CyQUANT assay ifølge producentens specifikationer. Forsøg blev gentaget tre gange; IC

50 for hver celle linie vises.

farmakokinetik KPT-335 i raske hunde

For at vurdere farmakokinetik KPT-335, seks sunde beagle hunde var administreret en enkelt dosis af lægemiddel ved 1,5 mg /kg efter at være blevet fodret med et måltid. Blodprøver blev opnået i løbet af en 48 timers periode og analyseres for plasma KPT-335-koncentrationer. Resultaterne er vist i tabel 2. Den gennemsnitlige T

max var ca. 4 timer med en C

max på ca. 250 ng /ml og en gennemsnitlig AUC på 1800 ng /ml.

dosiseskaleringsstudie

Patientdemografi.

Patientdemografi og tumortyper er anført i tabel 3. i alt 17 hunde blev indskrevet i dosiseskalerende del af undersøgelsen. Den mediane alder var 7,5 år og median vægt var 35 kg. De fleste hunde tilmeldt havde NHL (n = 14), og de fleste (n = 12) havde også modtaget tidligere behandling, herunder kirurgi, kemoterapi og /eller prednison. Prednison blev administreret til 10 hunde i løbet af KPT-335 behandling ved 0,5 mg /kg enten en gang om dagen eller hver anden dag; i 8/10 tilfælde hundene indgik i undersøgelsen efter at have oplevet sygdomsprogression i lyset af prednison terapi og følgelig blev lægemidlet ikke afbrydes. De resterende to hunde blev anbragt på prednison efter de første 28 dages behandling for at løse appetitløshed /anoreksi knyttet til behandling. Disse hunde fik prednison ved 0,5 mg /kg hver anden dag for varigheden af ​​behandlingen med KPT-335.

Kliniske toksiciteter og maksimalt tolererede dosis.

For alle hunde indskrevet i dosiseskaleringsdel undersøgelsen, de primære kliniske toksiciteter bestod af hovedsagelig grad 1 og 2 gastrointestinale hændelser, herunder anoreksi, opkastning og diarré, såvel som sløvhed (opsummeret i tabel 4 og 5). MTD blev etableret som 1,75 mg /kg to gange om ugen (mandag /torsdag). Alle tre hunde i 2 mg /kg kohorte oplevet DLT herunder grad 3 anoreksi (n = 2), grad 3 opkastning (n = 1), grad 3 diarré (n = 1), grad 3 ALT elevation (n = 2), grad 3 AST elevation (n = 1), og grad 3 ALP elevation (n = 1). Derfor blev bivirkningsprofil af KPT-335 primært begrænset til mave-tarmkanalen og klinisk relevant hepatotoksicitet blev observeret primært ved doser over MTD.

Fotos

I 4 tilfælde, hunde, der var på lægemiddel til over 4 uger havde en ændring i regimen fra to gange om ugen til tre gange om ugen (mandag /onsdag /fredag) som lægemiddel var veltolereret og hundene oplever stabil sygdom. Dette skete i én hund modtog 1 mg /kg, to hunde, der fik 1,25 mg /kg, og en hund modtog 1,5 mg /kg. De forblev på denne øgede dosering frekvens regime for varigheden af ​​behandlingen (median 68,5 dage), uden nogen stigning i kliniske toksiciteter. I 4 tilfælde blev gjort dosisændringer til hunde, der har oplevet bivirkninger. To af disse forekom hos hunde, som modtog lægemidlet ved 2 mg /kg og erfarne klasse 3 utilsigtede hændelser; i begge tilfælde, blev dosis reduceret til 1,5 mg /kg to gange om ugen. I de to andre tilfælde blev en hund reduceret fra 1,75 mg /kg til 1,5 mg /kg derefter 1,25 mg /kg på grund af vedvarende problemer med anoreksi, og den anden hund blev reduceret fra 1,5 mg /kg til 1,25 mg /kg, også grundet anoreksi. Denne sidste patient blev på terapi for 246 dage.

Reaktion på terapi.

Den mediane TTP for alle hunde var 35 dage (interval 14-246 dage). I alt 7 hunde oplevede PD i de første 4 uger af behandlingen.