PLoS ONE: Definitive karakterisering af CA 19-9 i resektable kræft i bugspytkirtlen Ved hjælp af en reference Sæt med Serum og plasma Specimens

Abstrakt

validering af kandidat biomarkører ofte vanskeliggøres af manglen på en pålidelig vurdering og sammenligning af ydeevne. Vi præsenterer her en reference sæt serum- og plasmaprøver at fremme valideringen af ​​biomarkører for resektable pancreascancer. Henvisningen Sættet indeholder en stor kohorte af fase I-II patienter bugspytkirtlen kræft, rekrutteret fra 5 forskellige institutioner, og relevante kontrolgrupper. Vi karakteriseret udførelsen af ​​den nuværende bedste serologiske biomarkør for kræft i bugspytkirtlen, CA 19-9, ved hjælp af plasma prøver fra referencen indstilles til at give et benchmark for fremtidige biomarkør undersøgelser og at fremme vores viden om CA 19-9 i den tidlige fase kræft i bugspytkirtlen og kontrolgrupperne. CA 19-9 fremtrædende pancreascancer fra de sunde og kronisk pancreatitis grupper med en gennemsnitlig sensitivitet og specificitet 70-74%, svarende til tidligere undersøgelser ved hjælp af alle stadier af pancreascancer. Kronisk pancreatitis patienter viste ikke CA 19-9 højder, men patienter med benign galdevejsobstruktion forhøjelser nær så høje som de kræftpatienter. Vi fik yderligere oplysninger om biomarkør ved at sammenligne to forskellige analyser. De to CA 9-9 analyser aftales i god samlede præstation, men afveg i målinger af de enkelte prøver, potentielt skyldes små forskelle i antistof-specificitet som afsløret af glycan array analyse. Således henvises sæt løfter være en værdifuld ressource for biomarkør validering og sammenligning, og CA 19-9 data præsenteres her vil være nyttigt for benchmarking og for at udforske relationer til CA 19-9

Henvisning:. Haab BB , Huang Y, Balasenthil S, Partyka K, Tang H, Anderson M, et al. (2015) Endelig karakterisering af CA 19-9 i resektable kræft i bugspytkirtlen Ved hjælp af en reference Sæt med serum- og plasmaprøver. PLoS ONE 10 (10): e0139049. doi: 10,1371 /journal.pone.0139049

Redaktør: Zoltán Rakonczay Jr., University of Szeged, Ungarn

Modtaget: 18 juni 2015; Accepteret: September 7, 2015; Udgivet: 2 okt 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Er tilgængelige i Støtte Information De CA19-9 data

Finansiering: Dette arbejde blev finansieret af tidlig påvisning Forskning Netværk af National Cancer Institute (U01CA152653 til BB Haab, RE Brand, og P. Allen, og U01CA111302 til AM Killary, ML Frazier, og S. Sen). Forfatterne vil også gerne takke Early Detection Research Network for at give pancreas prøver anvendt til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fremskridt i viden om kræft i bugspytkirtlen har genereret begejstring omkring udsigterne for betydelige fremskridt mod denne dødelige sygdom [1, 2]. Blandt andre områder har feltet været vidne fremskridt i forståelsen af ​​genetiske initiering og progression af sygdommen [3], rolle stroma at fremme cancer og i hindre systemiske behandlinger [4-7], og den rolle, plasticitet i cancer celle [8]. Selvom denne information vil være grundlæggende i udviklingen af ​​effektive behandlingsformer, forbedringer i overlevelse også vil afhænge af en bedre sporing, diagnosticering og behandling beslutninger baseret på individuelle patientkarakteristika. Vi er nødt til at fremme vores evne til at opdage en bugspytkirtelkræft på et tidligt tidspunkt, når det er potentielt helbredes ved kirurgisk resektion, og vi har brug for bedre måder at bestemme, hvilken rute for pleje, der vil være mest effektiv for hver patient.

Molekylære biomarkører lover at give en sådan præcis, patient-specifikke oplysninger [9], men deres udvikling og implementering er udfordrende og langsom. I bugspytkirtelkræft forskning, en væsentlig flaskehals for udviklingen af ​​molekylære biomarkører er de begrænsede ressourcer til vurdering og sammenligning af kandidat biomarkører hjælp prøver indsamlet på tidlige stadier af udvikling af kræft, når resektion for helbredelse er mulig. En betydelig mængde tid som regel er nødvendig, før en præcis vurdering af en biomarkør er muligt og før der kan foretages beslutninger om yderligere investeringer. Oftere end ikke, er lovende resultater i tidlige undersøgelser ikke dokumenteret i opfølgende undersøgelser, eller udførelsen af ​​en biomarkør ikke er i overensstemmelse mellem undersøgelser [10, 11]. Der kræves en konsekvent og systematisk tilgang til evaluering kandidat biomarkører.

For at imødekomme behovet for evaluering af kræft i bugspytkirtlen biomarkører, en kollaborativ gruppe i tidlig påvisning Research Network (EDRN) for nylig udviklet en reference sæt humane prøver . Motivationen for at udvikle referencen sæt var at give en endelig vurdering af kandidat biomarkører for kræft i bugspytkirtlen, at give nøjagtige sammenligninger mellem kandidat biomarkører, og for at teste den kombinerede anvendelse af forskellige biomarkører. Et fælles sæt prøver, indsamlet under strenge standarder på flere institutioner og omfattende de patientgrupper er mest relevante for de kliniske krav, er nødvendigt for at nå disse mål [12]. Flere principper guidede oprettelsen af ​​sættet. Sættet skulle omfatte prøver fra flere institutioner, således at det ikke repræsenterer kun ét geografisk område; prøvetagning var at følge en enkelt, detaljeret drift procedure standard, for at forhindre indførelse af skævhed i sæt; patienterne skulle omfatte mange med resektable cancer, som er de mest vanskelige at detektere endnu de vigtigste for potentiel positiv virkning; og kontrolpersonerne var at omfatte både raske mennesker og patienter med benigne tilstande i bugspytkirtlen, fordi visse godartede betingelser kan være svært at skelne fra kræft i bugspytkirtlen og kan forårsage stigninger i kræft biomarkører.

Med hensyn til den patientpopulation, vi valgte at samle prøver fra patienter med stadium i eller II cancer som bekræftet ved kirurgisk patologi. Sådanne patienter er berettiget til kirurgisk behandling og i gennemsnit har betydeligt bedre resultater end resten af ​​bugspytkirtlen kræftpatienter. Afsløring kræft endnu tidligere, det vil sige ved carcinoma in situ eller Panin-3, ville være at foretrække at detektion ved fase I, fordi patienter med stadie jeg typisk stadig udvikle tilbagefald efter operation. På nuværende har vi ikke en måde at rutinemæssigt bekræfte tilstedeværelsen af ​​Panin-3, så samle prøver fra en kohorte af disse patienter er endnu ikke muligt. En alternativ metode, der tidligere blev brugt, var at samle prøver, der var blevet indsamlet forud for diagnosen kræft i bugspytkirtlen, identificeret ved undersøgelsen af ​​opfølgende information fra massive offentlige sundhed undersøgelser for at finde emner, som vinder udviklede pancreascancer [13, 14]. Sådanne prøver er dyrebare for at udforske mulighederne for screening for kræft, men de er ikke designet til at teste for detektion forud til fase I eller II, fordi den fase af sygdommen ikke er kendt. Hertil kommer, fordi det er vanskeligt at opnå sådanne prøver, der normalt holdt for kun et lille antal undersøgelser. Derfor har vi forfulgte samlingen af ​​et prøvesæt, der kunne bruges til mange undersøgelser, og det vil være relevant at et vigtigt mål i bugspytkirtelkræft behandling, påvisning af flere kræftformer på en scene, der er berettiget til kirurgi.

CA 19-9 analysen er den nuværende bedste serologiske biomarkør for kræft i bugspytkirtlen. CA 19-9 monoklonalt antistof blev fremstillet mod en kolorektal cancer cellelinje [15], og antigenet binder er et kulhydrat struktur knyttet til en række proteiner og lipider [16]. Selv om dens blodniveauer er stærkt forbundet med pancreascancer-det er forhøjet i 70-80% af patienter med pancreascancer og i omkring 20% ​​af patienter med benigne tilstande i bugspytkirtlen [17]-dens ydeevne er ikke tilstrækkeligt til diagnosticering af cancer, som risikoen for både falsk negative og falsk positive diagnoser er uacceptabelt høj. Ca. 5% af patienter med pancreascancer ikke løfte CA 19-9 grund germlinie mutationer, der resulterer i manglende evne til at producere den glycan [18], og en anden gruppe patienter ikke løfte CA 19-9 af ukendte årsager. De ikke-specifikke stigninger i CA 19-9 resultat primært fra skader på galdegang eller dele af pancreas kanaler, der er belagt med CA 19-9-antigenet. Nye biomarkører for diagnosticering af resektable kræft skal klare sig bedre end CA 19-9, både i sensitivitet og specificitet, enten som en enkelt biomarkør eller mere sandsynligt i kombination.

Målene for den foreliggende undersøgelse var til en) bestemmer ydeevnen for CA 19-9 i referenceperioden sæt; 2) definere mere klart udførelsen af ​​CA 19-9 til fase I-II-sygdom og med henvisning til de potentielt forstyrrende betingelser for godartet galdevejsobstruktion og kronisk pancreatitis; og 3) sammenligne effektiviteten og definere oprindelsen af ​​forskellene mellem forskellige CA 19-9 analyser. Det første mål var nødvendigt at give et benchmark, som vi kan sammenligne og vurdere kandidat biomarkører. Det andet mål var nødvendig, fordi mange af de tidligere undersøgelser af CA 19-9 var stærkt vægtet mod sene kræft, primært fordi prøver fra sene kræftpatienter er mere let tilgængelige. Patienter med stadium I-II sygdom har potentiale for forbedrede resultater gennem kirurgi, så præcis og tidlig påvisning af dette niveau af sygdom er kritisk vigtigt. Det tredje mål var nødvendigt, fordi de tidligere undersøgelser af CA 19-9 i bugspytkirtelkræft har divergerende resultater, sandsynligvis på grund af forskelle i de særlige forhold antistofferne [19] eller forskelle i assay platforme. Det er vigtigt at forstå konsekvenserne af disse forskelle for beslutninger for de enkelte patienter. Desuden flere oplysninger om glykaner bundet af hver CA 19-9 antistof potentielt ville bidrage til at karakterisere glykaner produceret af kræftpatienter og formulere strategier til at detektere en større procentdel af patienter end muligt nu.

Materialer og Metoder

kriterier

Hvert websted udført prøvetagning ved hjælp af en protokol og skriftligt samtykke form, der var godkendt ved deres Institutional Review Board. Forsøgspersonerne blev forpligtet til at give skriftligt, informeret samtykke. De steder, der deltager i prøvetagningen var University of Pittsburgh Medical Center, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, University of Michigan, University of Nebraska, og Northshore University sundhedssystem (tidligere kendt som Evanston Northwestern Healthcare). Kriterierne Følgende inklusionskriterier var nødvendige for bugspytkirtlen kræfttilfælde og kontroller. Kontrolgrupperne omfattede kronisk pancreatitis patienter, akutte godartede galdevejsobstruktion patienter og raske forsøgspersoner.

bugspytkirtelkræft sager.

Emner undergik helbredende bugspytkirtlen resektion for en adenocarcinom herunder negative marginer og helst Stage 1 eller 2A (fravær af lymfeknudemetastaser).

Ingen forudgående historie af noget andet malignitet undtagen nonmelanoma hudkræft i ti år.

kronisk betændelse i bugspytkirtlen sager.

Alle fag skal have haft mindst to af de radiologiske kriterier, der er anført nedenfor, med mindre et emne havde en historie af pancreas eksokrin, i hvilket tilfælde kun én radiologisk kriterium var påkrævet.

Abdominal ultralyd, der er i overensstemmelse med kronisk betændelse i bugspytkirtlen ved standard radiologiske kriterier

Abdominal CT-scanning i overensstemmelse med kronisk betændelse i bugspytkirtlen ved standard radiologiske kriterier (dvs. forkalkninger, dilateret pancreas kanalen, uregelmæssig kontur af kirtel, cystisk læsioner).

Endoskopisk retrograd cholangiopancreatography (ERCP) eksamen konsekvent med kronisk betændelse i bugspytkirtlen ved standard radiologiske kriterier (dilateret indviklet vigtigste pancreas kanalen med uregelmæssige sekundære grene, intraduktal calculi).

Endoskopisk ultralyd i overensstemmelse med kronisk betændelse i bugspytkirtlen ved standard sonografiske kriterier.

pancreas forkalkninger identificeret på almindeligt film af maven.

Alle emner havde en imaging undersøgelse i bugspytkirtlen inden 3 måneder af undersøgelsen indskrivning som ikke tyder på en pancreas masse.

Alle emner havde en stabil kliniske historie i det forløbne år med mistanke for kræft (vægttab, gulsot, eller ændring i abdominale symptomer).

Alle emner havde ingen forudgående historie nogen anden malignitet undtagen ikke-melanom hudkræft til fortiden ti år

Alle emner havde nogen familie historie af kræft i bugspytkirtlen

Akutte godartede galdevejsobstruktion sager

Alle emner mødte alle de følgende kliniske kriterier…:

Højde af serum bilirubin niveau større end 2,0 mg /dl

Dilated ekstrahepatiske galdesystemerne demonstreret på imaging undersøgelse

Blodprøve opnået forud for enhver korrigerende indgreb.

Alle emner havde galdevejsobstruktion der var af godartet ætiologi såsom fælles galdegang sten eller godartet biliær striktur.

Patienter med primær skleroserende cholangitis (PSC) blev udelukket.

Alle forsøgspersoner havde en komplet imaging undersøgelse udført af bugspytkirtlen, der ikke tyder på en kræft i bugspytkirtlen, såsom en diskret masse læsion.

Alle emner havde ingen forudgående historie nogen anden malignitet undtagen ikke melanom hudkræft i de sidste ti år.

Alle emner havde ingen familie historie af kræft i bugspytkirtlen.

Sunde kontroller.

Alle emner mødte følgende kriterier.

Alder , race og køn matchede til kvalificerede tilfælde kræft i bugspytkirtlen.

Ingen familie historie af kræft i bugspytkirtlen.

Ingen personlige historie akut pancreatitis eller galdevejsobstruktion som defineret ovenfor.

Ingen samtidig mavesmerter.

Ingen samtidige uforklarligt vægttab.

Ingen forudgående historie enhver anden malignitet undtagen ikke-melanom hudkræft for de seneste ti år.

der var ingen udvidet opfølgning ud over den tid, at prøverne blev sendt i slutningen af ​​opsamlingsperioden. Mens den mulighed, at en eller flere af kontrollerne havde begyndende kræft på tidspunktet for prøvetagningen, effekten på studiet sandsynligvis ville være ubetydelig. På grund af hvordan sjældne sygdommen er i den almindelige befolkning med en levetid risiko for en i 71 patienter, ville det kun forventes, at højst en af ​​disse patienter på en almindelige befolkning risiko for PC nogensinde vil udvikle en kræft i deres liv -tid.

Serum og plasma samling

Alle samlinger fandt sted efter informeret samtykke af deltagerne og før eventuelle indgreb eller procedurer. Prøverne blev indsamlet fra 21 feb 2005 til den 20. april 2011, og forsøgene blev udført i 2013 og 2014. Alle blodprøver blev indsamlet i henhold til drifts- procedure EDRN standard. Alle prøver blev nedfrosset ved -70 ° C eller koldere inden for 4 timer tidspunktet for indsamlingen. Fire ml serum og 2 ml plasma (ved hjælp EDTA som antikoagulans) blev afsendt fra de deltagende websteder til NCI Biorepository i Frederick, Maryland. Prøverne blev overført til lageret på en måde, der forhindrede optøning hjælp godkendte transporter teknikker. Alikvoter blev sendt på tøris til steder udfører CA 19-9 analyser, og ingen portioner blev optøet mere end tre gange i alt før anvendelse.

raske kontroller blev opsamlet fra 4 ud af de 5 steder med bidrag af kontrollerne matcher de samlede bidrag fra hvert sted (tabel 1). Vi overvågede kontrol rekruttering til sikre, at der var rimelig sammenligning af kontrollerne til sagerne i alder, race og køn, men vi lempes algoritmen noget med kronisk pancreatitis patienter på grund af den tidligere alder for debut i forhold til kræft i bugspytkirtlen.

Definitioner af tumor stadier

de bugspytkirtlen adenocarcinomer blev iscenesat i henhold til kriterierne i amerikanske Blandede Cancer (AJCC) Iscenesættelse Manual 7

th edition. Følgende definitioner af tumorudbredelse og nodal status blev anvendt: T1 = Tumor begrænset til bugspytkirtlen ≤2 cm største dimension; T2 = Tumor begrænset til bugspytkirtlen 2 cm i største dimension; T3 = Tumor strækker sig ud over bugspytkirtlen men uden involvering af cøliaki aksen eller øvre mesenteriske arterie; N0 = Ingen regional lymfeknude metastaser; og N1 = Regional lymfeknude metastaser. Etaperne blev defineret som: Stage 1 a = T1N0M0; Stage 1b = T2N0M0; Stage 2a = T3N0M0; og Stage 2b = T1-3N1M0.

CA 19-9 analyser

To laboratorier løb CA 19-9 analyser om portioner af plasma prøver, der blev modtaget uden identificerbare oplysninger. Et assay, VVM-1474 kit [Lot # RN-45.868] fra DRG International (Springfield, NJ), blev kørt i laboratoriet af Dr. Killary ifølge tidligere offentliggjorte metoder [20]. Den anden assay blev udviklet og kørt i laboratoriet af Dr. Haab anvendelse af en tidligere offentliggjort protokol [19, 21, 22]. I den efterfølgende tekst henvises til førstnævnte som “Assay 1” og sidstnævnte som “Assay 2.” DRG-kit nominelt er kun godkendt til serum, men det tidligere blev anvendt for plasma til at opnå resultater, der ligner dem, der opnås ved anvendelse af serum [20]. I denne undersøgelse, vi yderligere valideret brugen med plasma ved at bekræfte statistisk ækvivalens med Assay 1 og med Abbott Architect platform (se resultater). En delmængde af prøverne (n = 82) blev analyseret under anvendelse af CA 19-9 analyse på Abbott Architect Immunoassay platform ved University Health Network i Toronto, Canada. Se S1 Fil for yderligere oplysninger om de protokoller og assay karakteristika.

Statistisk analyse

For hver gruppe, vi sammenlignede CA19-9 fordelinger mellem de to CA19-9 analyser ved hjælp af parret t -test (på log-transformerede CA19-9) og Wilcoxon-test. Den Spearman rank korrelationskoefficient mellem de to analyser blev også beregnet. Til beskrivende analyser, genereret vi et boxplot for hver CA19-9 assay og hver gruppe; de geometriske hjælp af individuelle analyser og deres 95% Wald konfidensintervaller også blev beregnet.

For parvise sammenligninger mellem den sunde, godartet galdevejsobstruktion, kronisk betændelse i bugspytkirtlen og kræft grupper, udførte vi to-sample t-test ( på log-transformerede CA19-9 værdier) og Wilcoxon Rank Sum test. Hertil kommer, for hver parret kontrol og casegruppe, vi genereret en parametrisk skøn over de modtagende transporterende egenskaber (ROC) kurve [23] og området-under-the-kurven (AUC) for de enkelte CA19-9 analyser og for en lineær kombination af log-transformerede værdier fra de to assays afledt af logistiske regressionsmodeller. Proceduren bootstrap med 500 gange resampling blev brugt til at konstruere konfidensintervaller for AUC af de enkelte analyser, af forskellene i AUC mellem de to CA19-9 analyser, og forskellen i AUC mellem de enkelte CA19-9 analyser og de kombinerede assays.

for de enkelte CA19-9 analyser, vi undersøgte følsomheder og særlige ved hjælp af kliniske cutoff på 37 U /ml samt en afledt cutoff, der maksimerer summen af ​​sensitivitet og specificitet. Vi har også estimeret sensitivitet og specificitet baseret på kombinationer af de to CA19-9 assays under anvendelse af og /eller regler. Proceduren bootstrap med 500 gange resampling blev brugt til at konstruere konfidensintervallerne for følsomhed, specificitet, og summen af ​​sensitivitet og specificitet.

glycan array-eksperimenter og analyser

Kernen laboratorium for Glycan Array Synthesis (en del af konsortiet for Funktionelle Glycomics, CFG) ved Emory University udført de glycan array-eksperimenter og primære analyser. Grupperingen anvendte version her var 5,1, indeholdende 610 unikke glycaner. Forsøgene fulgte offentliggjorte protokoller [24]. Vi brugte programmet GlycoSearch [25] for at analysere de glycan array-data.

Resultater

CA 19-9 i referencen sat

Henvisningen sæt inkluderet serum- og plasmaprøver indsamlet på fem forskellige institutioner under en fælles standardprocedure. Prøverne fra 98 patienter med stadie I-II bugspytkirtelkræft, 62 patienter med kronisk pancreatitis, 31 patienter med benign galdevejsobstruktion, og 61 raske kontrolpersoner (tabel 1).

Vi bestemmes CA 19-9 værdier i plasmaprøverne under anvendelse af to forskellige assays, én et kommercielt tilgængeligt kit (benævnt assay 1), og den anden en in-house-system (benævnt Assay 2). Vi anvendte to forskellige assays med henblik på at tage højde for eventuelle forskelle mellem assays, givet tidligere observationer af sådanne forskelle [26, 27]. Vi testede pålideligheden de anvendte assays her ved sammenligninger med en automatiseret platform (Abbott Architect CA 19-9 immunoassay) for 82 af prøverne fordelt på de patientgrupper. Værdierne inden for hver af de patientgrupper var statistisk ækvivalente mellem alle tre analyser, bortset fra lidt højere niveauer blandt raske kontrolpersoner for Assay 2 i forhold til Abbott analysen (tabel A1 i S3 File), og diskrimination af kræft fra kontrolgrupperne var statistisk ækvivalent mellem alle assays (tabel B i S3 Fil og S1 fil). Dette resultat bekræfter pålideligheden af ​​de opnåede resultater ved brug Analyser 1 og 2 og deres generelle ækvivalens med automatiserede platforme.

Vi undersøgte først fordelingerne af værdierne for hver af analyserne i de forskellige patientgrupper (Fig 1A) . De raske forsøgspersoner og kronisk pancreatitis patienter havde de laveste niveauer; godartede galdevejsobstruktion patienter havde signifikant højere niveauer (p-værdien er mindre end 0,0001 og lig med 0,006 ved Wilcoxon Rank Sum test, i forhold til raske personer i Assay 1 og 2); og kræftpatienter havde de højeste niveauer (p 0,0001 i forhold til raske forsøgspersoner baseret på enten t-test eller Wilcoxon Rank Sum test for hver analyse). De to analyser viste tilsvarende tendenser. Detaljerede resultater om de geometriske middelværdier for de enkelte analyser og deres konfidensintervaller 95% er vist i tabel C i S3 Filer, og p-værdier for sammenligninger mellem patientgrupper er vist i tabel D i S3-fil.

A) CA 19-9 niveauer i hver gruppe. Vi præsenterer de log-transformerede værdier for bedre at visualisere alle områder af værdierne. Kasserne angiver kvartiler af fordelingerne, de vandrette linjer i felter angiver medianerne, og de stiplede linjer giver intervallerne, med individuelle outliers angivet med cirklerne. A1, Assay 1; A2, Assay 2. B-D) receiver-operatør-karakteristik (ROC) kurver, der sammenligner alle bugspytkirtlen kræftpatienter til de angivne kontrolgrupper. Legenderne angive det område-under-the-kurver (AUC) for hver analyse, med intervaller af konfidensintervaller 95%.

Vi spurgte, om CA 19-9 niveauer var anderledes mellem tidligere trin (trin Ia, Ib og IIa) og den senere fase (fase IIb) patienter. De CA19-9 niveauer var ikke signifikant forskellig mellem de to grupper (p-værdier baseret på t-test og Wilcoxon Rank Sum-test); og areal-under-the-kurven (AUC) værdier i receiver-operativsystem-karakteristik (ROC) analyse var også ikke statistisk signifikant forskellig mellem grupperne for differentiering af kræft fra raske forsøgspersoner (S2-fil). Derfor vil der i de efterfølgende analyser vi samlet alle kræftpatienter sammen.

Vi brugte AUC til at bestemme evne CA 19-9 at skelne grupperne. De CA19-9 assays var bedst til at adskille kræft fra sunde kontrolgrupper (AUC svarende til 0,78 med 95% CI (0.70,0.84) for Assay 1, og 0,76 (0,68, 0,83) for Assay 2) (fig 1B). Assayene havde også gode resultater med at adskille kræft fra kronisk pancreatitis grupper (AUC svarende til 0,73 med 95% CI (0,65, 0,80) for assay 1, og 0,77 (0,69, 0,83) for Assay 2) (Fig 1C), men de var ikke effektive til at adskille kræft fra godartede galdevejsobstruktion grupper (AUC svarende til 0,56 med 95% CI (0,47, 0,67) for Assay 1, og 0,62 (0,45, 0,71) for Assay 2) (fig 1D). Der var ingen statistisk signifikante forskelle i AUC mellem Analyser 1 og 2 i hver af disse sammenligninger.

For at mere direkte relatere disse resultater til klinisk praksis, vi undersøgte følsomheder og særlige forhold CA19-9 analyser på typiske cutoff anvendes i praksis, 37 U /ml, og ved cutoffs der gav maksimale summer af følsomhed og specificitet (tabel 2). Ved 37 U /ml cutoff, gennemsnittet af følsomheden plus specificiteten varierede fra 70 til 74 for diskrimination af kræft fra de sunde og kroniske pancreatitis kontrolgrupper. For begge assays, en lavere tærskel stærkt forøget følsomhed med mindre fald i specificitet, hvilket resulterer i en statistisk signifikant forbedring i gennemsnitlig sensitivitet og specificitet (tabel 2).

Patient-by-patient sammenligning af CA 19-9 analyser

ovenstående analyse viser, at CA 19-9 præstation er ens mellem Assay 1 og Assay 2, når evalueret i løbet af alle patienter, men vi ønskede også at vide, hvordan de to analyser i forhold til de enkelte patienter. En direkte sammenligning af værdierne opnået for hver patient viste store forskelle for visse patienter (fig 2). Forskellene mellem analyserne var jævnt fordelt; i nogle tilfælde Assay 1 var højere, og i andre tilfælde Assay 2 var højere.

log-transformerede CA 19-9 værdier for alle fag fra Assay 1 og Assay 2 blev afbildet i forhold til hinanden. Hver cirkel angiver en individuel patientprøve. Den tendenslinje er den lineære-mindste kvadraters bedste pasform, og Spearman rang korrelationskoefficient er 0,74.

På det praktiske plan, uoverensstemmelser mellem analyserne kun stof i relation til de cutoffs anvendes i klinisk praksis. forespørges vi derfor, hvor ofte status af en prøve var forskellig mellem assay 1 og Assay 2 i forhold til cutoff (tabel 3). Brug af 37 U /ml som cutoff, 8 af patienterne 53 cancerpatienter (15%) forhøjet i assay 1 var lave i Assay 2, og 7 af patienterne 52 cancerpatienter (14%) forhøjet i Assay 2 var lave i assay 1. Syv af de 128 kontrolpersoner (5%) ikke forhøjet i Assay 1 var forhøjet i Assay 2, og 9 af de 130 kontroller (7%) ikke forhøjet i Assay 2 blev forhøjet i Assay 1. Uoverensstemmelser også var til stede ved hjælp af en 100 E /ml cutoff. Selv de to assays giver generelt den samme samlede præstation, tydelige forskelle for enkelte patienter. Hver assay lejlighedsvis gav falsk negative eller falsk positive resultater i forhold til den anden.

Test af CA 19-9 analyser i kombination

Vi vurderede, om en kombination af de to analyser gav bedre resultater end enten assay alene. Dette koncept er baseret på den forudsætning, at hvis antistofferne i hvert assay optimalt detektere distinkte undergrupper af patienter, ville blive detekteret en større procentdel af patienterne, hvis assayene blev kombineret. Vi brugte logistisk regression til at udlede lineære kombinationer af de log-transformerede værdier af de to analyser, og vurderet AUC til adskillelse kræft fra hvert kontrolpunkt grupper baseret på den samlede score. Kombination af de to assays viste ikke signifikant forbedring for at skelne kræft fra rask eller kronisk pancreatitis grupper (figur 1 og tabel 2). Desuden ved hjælp af simple kombination regler baseret på AND eller OR operatører, på enten optimerede cutoffs eller standard 37 U /ml cutoff, der var minimal forbedring i gennemsnit sensitivitet og specificitet i forhold til de enkelte analyser (tabel 2). Skønt de to analyser potentielt identificere ikke-overlappende sæt patienter (som foreslået af den manglende perfekt korrelation i figur 2), de ikke bidrager komplementære, kræft-specifikke oplysninger.

Specificitet forskelle mellem CA 19-9 antistoffer

Mere information om oprindelsen af ​​forskellene mellem analyser kunne være nyttigt at optimere påvisning af kræftpatienter samtidig minimere detektion af kontrolpersoner. Antigenet nominelt genkendes af CA 19-9 antistoffer er en glycan kaldet sialyl Lewis A [16], med sekvensen Siaα2,3Galβ1,3 (Fucα1,4) GlcNAc, hvor Sia er sialsyre, Gal er galactose, Fuc er fucose, og GlcNAc er N-acetylglucosamin. Sialyl Lewis A er et medlem af Lewis blodgruppesystemet af glycaner på røde blodlegemer og en række glycoproteiner og glycolipider [22, 28]. Selvom sialyl Lewis A er den vigtigste glycan bundet af CA 19-9 antistoffer, kan andre glycaner være bundet [19, 29]. Et kraftfuldt værktøj til at få mere information om hvilke andre glycaner et antistof binder, er det glycan array [24, 30], som muliggør målinger af binding af et protein til mange forskellige glykaner parallelt. Vi opnåede således glycan array-data for de anvendes i assays 1 antistoffer og 2.

Begge antistoffer bundet den kanoniske CA 19-9 antigen-sialyl Lewis A-men med forskelle (figur 3 og figur 4). Antistoffet fra Assay 2 (9L426) bundet kraftigere end Assay 1-antistof til dimer slea-lea, som det fremgår af bedre signal ved den lave koncentration på 0,2 ug /mL, men det udviste ingen binding til sialinsyre variant Neu5Gc. Det er også bundet til sialyl Lewis C (ikke-fucosylerede sialyl Lewis A) ved den relativt høje koncentration på 20 ug /ml. I modsætning hertil Assay 1-antistof (kun påvisning antistof var tilgængelige fra kommercielt kit) viste større binding til Neu5Gc men ingen yderligere binding til SLEC. En tredje antistof (klon M081221, Fitzgerald, Acton, MA), som ikke anvendes i assay 1 eller 2, men medtaget for sammenligning, bundet andre glycaner ud over dem, der viser den kanoniske CA 19-9 antigen. Dette antistof krydsreagerede med glycaner indeholdende sialyl Lewis X, en isomer af sialyl Lewis A, hvor fastgørelsen af ​​fucose og galactose til kernestrukturen er tændt. Således CA 19-9 antistoffer har overlappende, men distinkte særpræg, herunder binding til nogle strukturer uden den kanoniske CA 19-9 antigen.

Hvert antistof blev inkuberet ved 2 mg /ml på en glycan array med 610 forskellige glycaner (glycan matrix-version 5.1 fra konsortiet for Funktionel Glycomics). Grafen omfatter glycanerne viser de højeste niveauer af binding af nogen af ​​antistofferne. For hvert antistof, vi normaliseret de rå fluorescens værdier til at indstille den højeste værdi til 1. liste angiver de glycaner indgår i plottet, og etiketterne over søjlerne angiver det primære motiv i hver glycan. DRG er Assay 1-antistof, 9L426 er Assay 2-antistof, og M081221 er en anden anti-sialyl Lewis A antistof inkluderet til sammenligning.

I hvert antistof bindingen intensitet til de angivne glykaner, i