PLoS ONE: Udnyttelse af Quantitative In Vivo Pharmacology Approaches to Vurdere kombinationseffekter af everolimus og irinotecan i Mouse xenograftmodeller af kolorektal cancer

Abstrakt

Formål

PI3K /AKT /mTOR pathway ofte dysreguleret i kræft og hæmning af mTOR har demonstreret evnen til at modulere pro-overlevelse veje. Som sådan, søgte vi at bestemme evnen af ​​mTOR inhibitor everolimus at forstærke antitumor virkninger af irinotecan i kolorektal cancer (CRC).

Eksperimentel udformning

kombinatoriske virkninger af everolimus og irinotecan var evalueret

in vitro

in vivo

i CRC cellelinjer huser almindeligt forekommende mutationer i

PIK3CA

,

KRAS

og /eller

BRAF

. Farmakokinetisk-rettet doseringsprotokoller everolimus og irinotecan blev fastsat og anvendt til at vurdere in vivo antitumorvirkninger af midlerne. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev 3-6 tumorer pr behandling arm høstes til biomarkør analyse af NMR metabolomics.

Resultater

Everolimus og irinotecan /SN38 demonstrerede synergistiske anti-proliferative virkninger i flere CRC-celle linjer

in vitro

. Kombinationseffekter af everolimus og irinotecan blev bestemt i CRC xenograftmodeller hjælp klinisk relevante dosering protokoller. Everolimus viste signifikant tumorvækstinhibering alene og i kombination med irinotecan i HT29 og HCT116 tumorxenoplantater. Metabolomiske analyse viste, at HT29 tumorer var mere metabolisk responsiv end HCT116 tumorer. Everolimus forårsagede et fald i glycolyse i begge tumortyper ruller irinotecan behandling resulterede i en dyb akkumulation af lipider i HT29 tumorer indikerer en cytotoksisk virkning.

Konklusioner

Kvantitativ analyse af tumorvækst og metabolomiske data viste at kombinationen af ​​everolimus og irinotecan var mere gavnlig i

BRAF /PIK3CA

mutant HT29 tumorxenoplantater, som havde en additiv effekt, end de

KRAS /PIK3CA

mutant HCT116 tumorxenoplantater, som havde en mindre end additiv effekt

Henvisning:. Bradshaw-Pierce EL, Pitts TM, Kulikowski G, Selby H, Merz aL, Gustafson DL, et al. (2013) Udnyttelse af Quantitative In Vivo Pharmacology Approaches to Vurdere kombinationseffekter af everolimus og irinotecan i Mouse xenograftmodeller af kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (3): e58089. doi: 10,1371 /journal.pone.0058089

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: September 4, 2012; Accepteret: 31 januar 2013; Udgivet: 8 marts 2013

Copyright: © 2013 Bradshaw-Pierce et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Novartis International AG og University of Colorado Cancer center Grant P30 CA046934. Novartis havde nogle input i undersøgelsen design, men ikke spillede en rolle i dataindsamling analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Jeg har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter . En del af udgifterne til de undersøgelser, blev leveret af Novartis. Novartis gav også alle everolimus for undersøgelserne. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Der er i øjeblikket stort fokus på udvikling af nye midler med henblik på at forstyrre signaltransduktionsveje vigtige i cancer progression. Den kliniske anvendelse af disse molekylært målrettede midler ofte involverer kombinationer med andre terapeutiske modaliteter og flere kliniske undersøgelser har vist fordelen ved at tilføje signaltransduktion modulatorer (STM’er) for kemoterapi eller stråleterapi [1] – [5]. Den vellykkede udvikling af medicinsk behandling og behandlingsstrategier kræver tankevækkende brug af prækliniske modeller og omhyggelig tolkning af data.

Anvendelse af kvantitative metoder, herunder anvendelse af farmakokinetiske data og kvantitative mål for respons, er afgørende for at belyse virkningsmekanismer og forbedre translationel farmakologi forskning [6]. En almindelig mangel af

in vivo

farmakologiske undersøgelser er brugen af ​​doser og /eller skemaer, der ikke er klinisk mulig som kan føre til misvisende resultater af effekt og /eller udvikling af biomarkører, som ofte undlader at oversætte til den kliniske indstilling. Her præsenterer vi en undersøgelse, hvor vi kvantitativt bestemt fordelen ved at tilføje et lille molekyle STM, everolimus (Novartis, East Hanover, NJ), til standard kemoterapi, irinotecan (Pfizer Inc., New York, NY), ved hjælp af doser og tidsplaner i vores prækliniske modeller forventes at give narkotika eksponeringer der nærmer dem observeret hos patienter

Everolimus (40-

O

– (2-hydroxyethyl) -rapamycin RAD001 /Afinitor®). er en oralt biotilgængelig inhibitor af pattedyr mål for rapamycin (mTOR), som er i dag godkendt til behandling af fremskreden nyrekræft og progressive neuroendokrine tumorer i bugspytkirtlen oprindelse (PNET) [7], [8]. mTOR, en serin /threonin-kinase, er en central regulator af veje, der signalerer vækst, proliferation, overlevelse, metabolisme og angiogenese [7], [9]. mTOR aktivitet medieres af vækstfaktor signalering, næringsstoffer og energitilstande samt hypoxisk stress. Endvidere mTOR spiller en central rolle i phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT pathway som ofte dysreguleret og involveret i væksten og progression i flere kræftformer, hvilket gør det til et attraktivt terapeutisk mål [10], [11]. Nylige undersøgelser tyder på, at PIK3CA mutationer eller AKT aktivitet giver følsomhed for mTOR terapi [12] – [15].

PIK3CA

er det gen, der koder for PI3K p110-katalytiske underenhed og mutationer (exon 9 og exon 20) kan findes i 10-30% af CRC [11], [16], [17].

CRC er den tredje mest almindelige kræftform type, tegner sig for næsten 10% af alle kræftrelaterede dødsfald i USA [18]. Mens tidlige fase CRC har en gunstig 5-års overlevelse, sent stadium sygdom med fjernmetastaser har en 5-års overlevelse på kun 10%, der angiver behovet for en forbedret behandlingsform til metastatisk CRC (mCRC). Irinotecan (Camptosar®) er en standard for pleje kemoterapeutisk middel anvendes til behandling af mCRC. Vi antager, at everolimus ville øge irinotecan behandling på grund af graduering af effektorer på pro-overlevelse veje og havde til formål at evaluere kombinationen i mus xenograftmodeller af CRC huser vanskelige at behandle samtidige

PIK3CA

KRAS

eller

BRAF

mutationer. Derudover, på grund af de kendte metaboliske virkninger af mTOR pathway inhibering, vi kvantitativt vurderet de metaboliske profiler af tumorerne behandlet med klinisk relevante doser af everolimus og irinotecan ved kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Irinotecan for

in vivo

studier blev opnået fra University of Colorado Hospital Apotek (Aurora, CO) og SN38 for

in vitro

undersøgelser blev indkøbt fra LKT labs (St. Paul, MN). Everolimus blev givet som en suspension af Novartis. SN38 stamopløsninger til

in vitro

eksperimenter blev foretaget i DMSO (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Alle andre anvendte materialer blev indkøbt fra enten Fisher Scientific eller Sigma (St. Louis, MO), medmindre andet er angivet.

Cellekultur

colontumorcellelinier, HCT8, HT29, LS180 og HCT116, var indkøbt fra American Type Culture Collection, (Manassas, VA), og holdes på vævsdyrkningsplader (BD Falcon, San Jose, CA) i RPMI (Gibco) suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco) og penicillin (100 enheder /ml) -streptomycin (100 ug /ml; Life Technologies). Celler blev rutinemæssigt screenet for mycoplsma hjælp MycoAlert (Lonza). Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. Alle

in vitro

medicinsk behandling blev udført med anvendelse af komplet vækstmedium.

cytotoksicitet og kombinationseffekter

cytotoksisk effekter blev bestemt ved hjælp af sulforhodamin B (SRB) assay. Kort fortalt blev 5000 levedygtige celler udpladet i plader med 96 brønde og inkuberet natten over før eksponering med forskellige koncentrationer af lægemidler. Celler blev udsat for stigende koncentrationer af everolimus (0-200 nM), SN38 (0-8 nM), og kombinationer af de to. Efter en 72 timers inkubation blev mediet fjernet, og cellerne blev fikseret med kold 10% trichloreddikesyre i 30 minutter ved 4 ° C. Celler blev vasket med vand og farvet med 0,4% SRB i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev igen vasket med 1% eddikesyre og pletten blev solubiliseret med 10 mM Tris ved stuetemperatur og aflæses ved en OD på 565 nm. Resultaterne af den kombinerede behandling blev analyseret ifølge den isobolografiske fremgangsmåde til Chou og Talalay, under anvendelse CalcuSyn software program (Biosoft, Cambride, UK). Den resulterende kombination Index (CI) blev anvendt som et kvantitativt mål for graden af ​​interaktion mellem forskellige lægemidler. En CI-værdi lig med 1 betegner additivitet; CI større end 1, antagonisme; CI mindre end 1, synergisme.

immunblotting

Celler blev podet i plader med 6 brønde 24 timer før behandling med hvert lægemiddel alene eller i kombination i 24 timer. Celler blev skrabet over i RIPA-buffer indeholdende proteaseinhibitorer, EDTA, NaF og natriumorthovanadat. Totalt protein blev bestemt under anvendelse af Pierce 660 nm Protein Assay (Pierce, Rockford, IL). Tredive mikrogram totalt protein blev fyldt på en gradientgel 4-12%, elektroforeret og overført til nitrocellulose ved hjælp af iBlot systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA). Membraner blev blokeret i en time ved stuetemperatur med Licor blokeringsbuffer (Licor, Lincoln, NE) forud for inkubering natten over ved 4 ° C med et af følgende antistoffer: pS6RP, tS6RP, Pakt, Takt, Perk, Terk, p21, PARP , actin og α-tubulin (Cell Signaling, Beverly, MA). Alle antistoffer blev anvendt ved en 1:1000 fortynding bortset pERK, som blev anvendt ved 1:2000. Efter primære antistof inkubering blev blots vasket i TBS-Tween (0,1%), derefter inkuberet med det passende sekundære antistof ved 1:15,000 (Licor, Lincoln, NE) i en time ved stuetemperatur. Efter tre yderligere vaske blev blots udviklet ved hjælp af Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE).

Dyr

Kvindelige athymiske nøgne mus, 5 til 10 uger gamle, blev købt fra National Cancer Institut. Dyrene blev huset 3-5 per bur i polycarbonat bure og holdt på en 12 timers lys /mørke cyklus. Mad og vand blev givet

ad libitum

. Alle undersøgelser blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og udføres i overensstemmelse med de NIH retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr, og dyrene blev anbragt i et anlæg akkrediteret af American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care .

i tumorbærende undersøgelser blev celler høstet og resuspenderet i en 1:01 blanding af serum-frit RPMI og Matrigel (BD Bioscience). En million celler blev injiceret subkutant i hver bageste flanke af musene. Tumor volumener, målt ved digitale skydelærer, blev beregnet ved

V

(mm

3) = længde x (bredde)

2 x 0,5236.

farmakokinetisk

En farmakokinetisk undersøgelse af everolimus blev gennemført i mus med HT29 tumorer (gennemsnitligt volumen ~300 mm

3). Mus blev behandlet med enten 2,5 eller 10 mg /kg everolimus dagligt i 7 dage ved oral sondeernæring. Tre mus pr dosisniveau blev aflivet ved hjertepunktur stick forblødning ved 30 minutter, 2, 4, 6 og 24 timer efter lægemiddeladministrering på dag 7. Plasma og tumorvæv blev snap-frosset i flydende N

2 og opbevaret ved -70 ° C indtil analyse.

Everolimus blev målt i plasma og tumorer ved LC /MS /MS assay. Analytiske standarder, kvalitetskontrol (QC) og ubekendte blev alle fremstillet ved tilsætning af 200 pi ukendt eller spiked blank plasma eller tumor homogenat (100 mg /ml i vand) prøver til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Prøver blev ekstraheret ved tilsætning af 1 ml MTBE (MTBE) efterfulgt af 10 min hvirvelblanding. Prøverne blev centrifugeret ved 13.000 rpm i 10 min, og supernatanten opsamles og 900 pi overført til et rent reagensglas. Prøver blev inddampet til tørhed på en rotationsinddamper efterfulgt af resuspension i 100 pi 50% acetonitril /50% 10 mM ammoniumacetat og overført til autosampler hætteglas til analyse. Massespektre for ekstraherede prøver blev opnået på et MDS Sciex 3200 Q-TRAP tripel kvadrupol massespektrometer (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) med en turbo ionspray kilde grænseflader til en Agilent 1200 Series Binary Pump SL HPLC-system (Santa Clara , CA) .De nedre og øvre grænser for kvantificering for assayet var 1 og 5000 nM. Nøjagtighed og præcision (% RSD) baseret på analyse af standarder og QC prøver til denne analyse var 90,7% og 5,5% for plasma og 93,0% og 4,2% for tumor. Yderligere detaljer kan findes i tillæg S1 (afsnit SA.1.).

Terapeutisk Study

Når HT29 og HCT116 tumorer nåede en gennemsnitlig volumen på ~325 mm

3 dyr blev randomiseret i fire behandlingsgrupper (n = 9-10 mus pr gruppe): (i) køretøjer, (ii) 5 mg /kg everolimus (RAD) ved oral sondeernæring (PO) dagligt, (iii) 10 mg /kg irinotecan (IRI) gang ugentligt ved intravenøs (iv) haleveneinjektion, og (iv) en kombination af RAD og IRI. Everolimus, fortyndet i sterilt vand, og irinotecan, fortyndet i sterilt 0,9% saltvand, blev indgivet ved 4 ml /kg. Dyr blev behandlet i 28 dage. Tumorvolumener og legemsvægte blev målt 2-3 gange ugentligt. På dag 28 i behandlingen blev 3-6 dyr pr gruppe ofret, ca. 24 timer efter everolimus behandling, og tumorer høstet for metabolomiske analyse.

NMR-baserede Metabolomics

For metabolomisk analyse, dyr var fastet i 4 timer og fik 250 mg /kg af [1-

13C] glucose (Cambridge Isotopes, Cambridge, MA) ved IV injektion 60 minutter før tumor høst. Lynfrosset tumorprøver undergik tofaset syreekstraktion procedure (under anvendelse af 8% perchlorsyre) tidligere konstaterede og omfattende publiceret [19] – [22]. Yderligere oplysninger kan også findes i tillæg S1 (afsnit SA.2.).

Dataanalyse

Plasma og tumor farmakokinetiske parametre blev beregnet ved noncompartmental analyse med WinNonlin. Everolimus plasma data var egnet til en to-kompartment model med første-ordens absorption og simuleringer af plasmakoncentrationer på en 5 mg /kg dosis af everolimus blev udført af SAAM II version 2.1 (The Epsilon Group, Charlottesville, VA /University of Washington) .

en-vejs ANOVA analyser med Tukey post-test blev anvendt til bestemmelse statistisk signifikans mellem flere grupper. Analyser blev udført med Prism-version 4.02.

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle kvantitative metabolomiske datasæt blev inkluderet i specialbyggede metaboliske flux analysatorer og data grænseflader og præsenteres som metaboliske varme kort [23].

Data fra in vivo-undersøgelse blev modelleret til at vurdere den terapeutiske fordel af at tilføje everolimus til irinotecan. Den anvendte model var ligner en tidligere publiceret model for vurdering kombinationsbehandling [24]. Nogle ændringer blev foretaget, og oplysninger om den model kan findes i tillæg S1 (afsnit SA.3.) Og Supplement S2. Alle modellering blev udført på data tumor volumen individuelle dyr og modelleret med SAAM II version 2.1.

Resultater

In vitro aktivitet

De synergistiske virkninger af everolimus (RAD) og SN38 blev vurderet i CRC-cellelinjer, HT29 (

BRAF

mt

PIK3CA

mt; p53 mt), HCT116 (

KRAS

mt,

PIK3CA

mt ), HCT8 (

KRAS

mt) og LS180 (

KRAS

mt

PIK3CA

mt). For alle

in vitro

eksperimenter SN38 blev anvendt i stedet for irinotecan siden SN38 er den aktive metabolit af irinotecan. HT29-celler var de mest følsomme over for SN38 og everolimus og tilsætningen af ​​everolimus til SN38 generelt tilvejebragt en stærkt synergistisk virkning i HT29, HCT8 og HCT116-celler med Cl-værdier i området fra 1,2 betragtes antagonistisk, 1,2 CI 0,8 er additive, og CI 0,8 er synergistiske. Bemærk, at SN38 anvendes i

in vitro Salg assays stedet for irinotecan, da det er den aktive metabolit.

Akt, p-Akt, PARP, spaltet PARP, total ribosomal S6 kinase ( S6), ribosomalt phospho-S6 kinase (PS6), ERK, p-ERK, p21 og α-tubulin blev målt i alle linjer efter 24 timers behandling med RAD (20 nM), SN38 (4 nM) eller kombinationen af to. Molekylvægte er vist ud for protein navn i parentes. Bemærk, at SN38 bruges i

in vitro

analyser i stedet for irinotecan, da det er den aktive metabolit.

Farmakokinetiske-Directed Dosering af Everolimus og irinotecan

For

in vivo

undersøgelser, vi etablerede doser af everolimus og irinotecan at administrere til mus, der ville give eksponering på eller under klinisk opnåelige niveauer. Menneskelig farmakokinetiske oplysninger om everolimus [25], [26] og irinotecan /SN38 [27] – [30]. Blev indsamlet fra litteraturen og er præsenteret i tabel 1 og 2 henholdsvis

for at bestemme den passende dosis af everolimus hos mus, vi foretaget en farmakokinetisk undersøgelse af everolimus i HT29 tumor bærende mus. Steady-state plasma og tumor koncentration-tid-profiler er vist i tillæg S3 Tal SC.2. A B og ikke-kompartment farmakokinetiske parametre vist i tabel 1 og tabel C.1 i tillæg S3. Dataene viste, at en dosis på 10 mg /kg i mus resulterer i steady-state free plasma (AUC

ss, fri = 116 ng * t /ml), som er i området, der blev observeret hos mennesker ved den klinisk brugte doser på 5 til 10 mg /kg per dag (AUC

ss, fri = 60-178 ng * t /ml). Plasmaproteinbinding værdier på 99% og 75% blev anvendt til at beregne frie plasmakoncentrationer i mus og mennesker henholdsvis [31], [32]. For de in vivo effektivitetsundersøgelser, valgte vi dog at bruge en dosis på 5 mg /kg (AUC

ss, gratis = 37 ng * h /ml) er forsigtig med at opnå for meget enkeltstof aktivitet, som kunne gøre det vanskeligt at vurdere kombinationseffekter. Tidligere undersøgelser af everolimus i mus med HCT116 tumorxenoplantater demonstreret enkelt middel aktivitet (45-55% tumorvækst hæmning) af everolimus ved 10-12 mg /kg [33], [34].

I vivo

SN38 data blev vurderet til at definere dosis af irinotecan, der skal anvendes, da det er den aktive metabolit af irinotecan og carboxylesterase omdannelse af irinotecan til SN38 varierer mellem mus og mennesker. Baseret på de menneskelige og mus farmakokinetiske data indsamlet fra litteraturdata [27] – [30], [35] – [40], valgte vi en dosis på 10 mg /kg af irinotecan skal indgives intravenøst ​​én gang om ugen (tabel 2). En 10 mg /kg iv dosis skøn at give en gratis eksponering af SN38 i intervallet, der blev observeret hos mennesker (mus: AUC

fri = 7,5-25,8 ng * t /ml; mennesker: AUC

fri = 4,4-18,6 ng * t /ml for doser fra 125-350 mg /m

2). SN38 plasmaproteinbinding værdier på 96,6-98,6% for mus og 98% for mennesker blev brugt til at beregne frie fraktion fra totale koncentrationer [37].

Tumor xenograft Reaktion på Everolimus og irinotecan Terapi

effekten af ​​everolimus, irinotecan og kombination af de to blev bestemt i HT29 og HCT116 tumorxenoplantater. Figur 3A viser tumorvæksten profiler af alle behandlingsgrupper for begge tumortyper. Everolimus forårsagede lignende og statistisk signifikant (p 0,05 over for kontrol) vækstinhibering i begge HT29 (gennemsnitlig tumorvækstinhibering, TGI = 40%) og HCT116 (gennemsnitlig TGI = 44%) tumorer henviser irinotecan forårsagede betydelig vækstinhibering på kun HT29 tumorer (gennemsnitlig TGI = 39%; p 0,05). Tilsætningen af ​​everolimus irinotecan betydeligt reduceret mængden af ​​HT29 (gennemsnitlig TGI = 64%) og HCT116 (gennemsnitlig TGI = 61%) tumorxenotransplantater (P 0,05 versus kontrol).

(A) HT29 og HCT116 tumor xenograft vækstkurver. Dyrene blev behandlet i 28 dage med køretøjer, RAD, IRI, eller kombinationen af ​​RAD + IRI. Dataene repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM af 9-12 tumorer per gruppe.

* P 0,05 versus køretøj. (B) Farmakokinetisk-farmakodynamiske modellering blev udført på for kvantitativt at vurdere intensiteten af ​​RAD + IRI kombination i HT29 og HCT116 tumorxenoplantater. Dette er en grafisk repræsentation af interaktionen (ψ) for RAD + IRI kombination. Hver søjle repræsenterer ψ for et enkelt tumor. y-værdier 1.3 er synergistisk, 1.3 ψ 0,7 er additive, 0,7 ψ 0 er mindre end additiv, og ψ 0 antagonistisk

Modellering af tumorvæksten profiler og virkningen af ​​behandling afslørede, at kombinationen af ​​everolimus og irinotecan var i gennemsnit additiv (gennemsnitlig ψ =. 0,9) i HT29 tumorer (figur 3B). Hver tumor blev modelleret individuelt og af de 10 HT29 tumorer, 1 udviste en synergistisk respons, 8 viste en additiv respons og 1 var mindre end additiv, men ikke antagonistisk. ψ repræsenterer betegnelsen i den matematiske model til at beskrive den kombinatoriske effekt, hvor ψ 1.3 er synergistisk; 1.3 ψ 0,7 betegner en additiv vekselvirkning, 0,7 ψ 0 er en mindre end additiv virkning og ψ 0 er antagonistisk. Nærmere oplysninger om modellering og individuelle tumor data og passer findes i Supplement S1, afsnit SA.3., Og Supplement S2. Vækst- profiler af HCT116 xenotransplantater var meget mere variable end de HT29 tumorer. Selv om den gennemsnitlige tumorvækst hæmning af kombinationsbehandlingen vises ens i de to tumorer (TGI = 64% vs. 61%), i HCT116 tumorer fordelen var i gennemsnit mindre end additiv (gennemsnitlig ψ = 0,5). Igen blev hver tumorvækst profil modelleret individuelt og 3 tumorer viste en additiv virkning, 5 var mindre end additiv og 2 var antagonistiske.

Virkningerne af everolimus, irinotecan og kombinationen af ​​de to på tumorens metabolisme blev målt i en undergruppe af dyr ved afslutningen af ​​undersøgelsen. Metaboliske profiler blev bestemt ved

1 H-,

13C- og

31P- NMR. Figur 4 viser metaboliske varme-kort til at skildre metaboliske ændringer blandt behandlingsgrupper i forhold til kontrolgruppen i HT29 og HCT116 implanteret. Virkningerne af everolimus på glukosemetabolismen, fald i laktat og glykolyse, var ens i HT29 og HCT116 tumorer, i overensstemmelse med den tumorvækst respons observeret i de to tumorer. HT29 tumorer viste en dybere respons på behandling med irinotecan, som er hovedsagelig relateret til akkumulering af lipider, især poly-umættet og phospholipider, som kan være relateret til øget cellulær nedbrydning og nekrose. Igen, dette er i overensstemmelse med tumor vækst profiler af HT29 og HCT116 tumorer, som viste, at HT29 tumorer reagerede på irinotecan behandling, mens HCT116 tumorer ikke gjorde. Kombinationen af ​​everolimus med irinotecan var forbundet med øget lipidakkumulering, membran nedbrydning (øget GPC og faldt PC /GPC) og i nogen grad faldt glycolyse i HT29 tumorer. Den samme reaktion blev ikke observeret i HCT116 tumorer, på trods af den gennemsnitlige tumorvækst inhibering af kombinationsbehandlingen gav omtrent samme resultat. Samlet set HT29 tumorer var mere metabolisk lydhøre over for alle behandling end HCT116 tumorer.

1 H-,

13C-, og

31P-NMR-data er repræsenteret som middelværdi ± SEM af 3- 6 målinger. De metabolitter, blev deres nøgletal og metaboliske fluxe grupperet ud fra deres biokemiske relevans. For kontrolgruppen, er alle intracellulære metabolitter givet som umol per gram celle vådvægt og metabolit forhold er uden enhed. Metaboliske veje, som blev uforstyrret ved behandling præsenteres som gule kort. Et fald i metabolisk endepunkt er angivet med rødt, mens en stigning af grønne pletter. Statistisk signifikans for metabolit ændringer baseres på multivariat analyse af metaboliske flux med p 0,02. Den interaktive metaboliske profil array databasen var custom-baserede [23].

Diskussion

Udviklingen af ​​nye lægemidler og terapeutiske strategier kræver brug af prækliniske modeller. Ofte betyder det imponerende prækliniske aktivitet af nye lovende midler og kombinationer af agenter ikke oversætte til levedygtige kliniske behandlinger. Rationel studiedesign med kvantitative endpoints er afgørende for effektiv oversættelse af kombination strategier og biomarkører for effekt [6], [41]. Det overordnede mål med undersøgelsen er beskrevet heri var at kvantitativt etablere kombinatoriske effekt af everolimus og irinotecan i murine modeller af CRC, husly svære at behandle genotyper, udnytte farmakokinetiske-styrede doseringsregimer. Baseret på mennesker og mus farmakokinetiske oplysninger, vi etablerede doser af everolimus og irinotecan til at blive brugt i prækliniske

in vivo

undersøgelser, der giver eksponeringer i intervallet dem observeret hos mennesker. Det er vigtigt at bemærke, at vi korrigerede totale koncentrationer for den frie eller ubundne fraktioner, når de foretager sammenligninger af farmakokinetiske data mellem mus og mennesker. Dette er kritisk, da det plasmaproteinbinding ofte varierer mellem arterne og i teorien kun den ubundne fraktion af lægemidlet er tilgængelig for interaktion med målet af interesse.

Vi testede everolimus og irinotecan kombination

in vivo

i to cellelinie xenograftmodeller af CRC, HT29 og HCT116. Kombinationen var veltolereret som væsentlige kropsvægt ændringerne ikke blev observeret (Supplement S3 Figur SC.2.). Evaluering af afslutningen af ​​studiet tumor data fra hver tumortype viser, at behandling med everolimus og irinotecan fører til statistisk signifikant tumor væksthæmning og graden af ​​respons synes ens i de to typer. Men her viser vi, at ved at evaluere hver tumor vækst profil, volumen som funktion af tiden, er vi i stand til at belyse forskelle i vækst og reaktion mellem de to tumortyper. Gennem matematisk modellering af kontrollen, arme enkeltstof og kombination af undersøgelsen var vi i stand til kvantitativt at vurdere samspillet mellem de to forbindelser og fandt, at i HT29 tumorer,

BRAF

PIK3CA

mutant, kombinationen var additive og i HCT116 tumorer,

KRAS

PIK3CA

mutant, kombinationen var ganske variabel, men mindre end additiv i gennemsnit. Ud over at vurdere tumorvækst vi kvantitativt vurderet virkningerne af de behandlinger på tumor metabolisme ved hjælp af NMR-baserede metabolomics.

Metabolisk, HT29 xenografter var mere lydhør end HCT116 implanteret. HT29 tumorer, men ikke HCT116 tumorer, i irinotecan gruppe viste en typisk metabolisk signatur for cytotoksisk terapi, akkumulering af lipider og phospholipider, en angivelse af cytotoksicitet /nekrose [42]. Dette resultat er i overensstemmelse med tumorvæksten profiler, som viser HT29 tumorer reagerer på behandling med irinotecan (TGI = 39%, p 0,05), men ikke HCT116 tumorer (TGI = 17%). Disse resultater er også enig med de

in vitro

data, som viser HT29-celler (IC50 = 3 Nm) er mere følsomme end HCT116 celler (IC50 300 nM) til SN38 behandling. Ifølge vores simulationer (Supplement S2), de frie koncentrationer af SN38 i plasmaet varierede fra 1300 til 7.25e-4 nM i en 24 timers periode med en gennemsnitlig koncentration på 4-18 nM, hvilket er langt under den estimerede IC50 for HCT116 celler. Trods ligheden i tumorvækstinhibering profiler af everolimus behandlet HT29 tumorer og HCT116 tumorer (TGI = 41% vs 44%, henholdsvis), HT29 tumorer optrådte lidt mere metabolisk responsiv end HCT116 tumorer. Vist fald glycolysens blev målt i både HT29 og HCT116 tumorer, men en stigning i GPC og nogle lipidakkumulering blev også observeret i HT29 tumorer. In vitro HT29-celler var mere følsomme over for everolimus behandling end HCT116 celler som IC50 for proliferation var lavere (1,2 nM vs. 25 nM) og blev observeret større p-S6RP inhibering ved 20 nM.

In vivo,

lignende reaktioner i hæmning af p-S6RP og cyklin D1 blev observeret i HT29 og HCT116 tumorer (Supplement S3 Figur Sc3 og sc4); dog kan foranstaltninger af p-S6RP ikke være en nyttig foranstaltning til at vurdere effekten. En tidligere offentliggjort undersøgelse viste, at everolimus behandlingen i begge følsomme og resistente linjer kan resultere i samlede dephosphorylering af S6K1 og S6 [33].

Vi spekulere, at noget af effekten af ​​everolimus observeret i HCT116 tumorer kan være relateret til antiangiogene virkninger af everolimus. Antiangiogene effekter af everolimus er tidligere blevet rapporteret [33], [43] og antiangiogene virkninger ville være meget sværere at påvise ved hele tumor metabolomics, som udføres her, da den del af endotelceller forhold til den samlede tumorvæv er ganske lille. Yderligere beviser for denne kan afledes af everolimus farmakokinetiske data. De frie plasmakoncentrationer produceret ved 5 mg /kg dosis i vores dyr varierede fra 0,2 til 6 Nm (C

min til C

max) med en gennemsnitlig frie koncentration (C

ss, gns) på ca. 1.5 nM, hvilket ville være tilstrækkelig til at inhibere HT29 vækst, men ikke HCT116 og rapporterer tidligere data potent anti-proliferative aktivitet af everolimus mod VEGF og bFGF stimulerede endotelceller (HUVEC’er) med IC50 værdier fra 0.1-0.8 nM [33].