PLoS ONE: neuregulin-1 Regulerer Cell Vedhæftning via en ErbB2 /phosphoinositid-3-kinase /Akt-afhængige vej: Potentielle Betydning for skizofreni og Cancer

Abstrakt

Baggrund

neuregulin-1 ( NRG1) er et formodet skizofreni modtagelighed gen involveret i udstrakt grad i centralnervesystemet udvikling samt kræft invasion og metastase. Ved hjælp af en B lymfoblast celle model, vi tidligere vist værdiforringelse i NRG1α-medieret migration i celler fra patienter med skizofreni samt effekter af risikofaktorer alleler i NRG1 og catechol-O-methyltransferase (COMT), et andet gen impliceret i både skizofreni modtagelighed og i kræft.

Metodologi /vigtigste resultater

Her undersøger vi celleadhæsion, en vigtig bestanddel proces med celle motilitet, ved hjælp af en integrin-medieret celleadhæsionsassayet baseret på en vekselvirkning mellem ICAM 1 og CD11a /CD18 integrin heterodimer udtrykt på lymfoblaster. I vores assay NRG1α inducerer lymfoblaster at antage varierende niveauer af adhæsion karakteriseret ved tidsafhængige udsving i fasthed bindingspunktet. Den maksimale rækkevidde af variation i vedhæftning over tres minutter korrelerer stærkt med NRG1α-induceret migration (r

2 = 0,61). NRG1α-induceret adhæsion variation bliver blokeret af erbB2, PI3K, og AKT inhibitorer, men ikke af PLC, ROCK, MLCK eller MEK-inhibitorer, implicerer erbB2 /PI3K /Akt1 signalvejen i NRG1-stimuleret, integrin-medieret celleadhæsion. I cellelinjer fra 20 patienter med skizofreni og 20 normale kontroller, celler fra patienter viser en betydelig mangel i intervallet NRG1α-induceret vedhæftning (p = 0,0002). I modsætning hertil respons patient-afledte celler phorbolmyristatacetat er usvækket. Den COMT Val108 /158Met genotype viser en stærk tendens til at forudsige rækkevidde NRG1α-inducerede vedhæftning reaktion med risiko homozygote har nedsat variation i celleadhæsion selv i normale individer (p = 0,063).

Konklusion /Betydning

Vores resultater tyder på, at en mekanisme af NRG1 genetiske association med skizofreni kan indebære molekylærbiologi celleadhæsion

Henvisning:. Kanakry CG, Li Z, Nakai Y, Sei Y, Weinberger DR ( 2007) neuregulin-1 Regulerer Cell Vedhæftning via en ErbB2 /phosphoinositid-3-kinase /Akt-afhængige vej: Potentielle Betydning for skizofreni og kræft. PLoS ONE 2 (12): e1369. doi: 10,1371 /journal.pone.0001369

Academic Redaktør: Schahram Akbarian, University of Massachusetts Medical School, USA

Modtaget: November 12, 2007; Accepteret: December 5, 2007; Udgivet: 26 December, 2007

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

finansiering:. det Intramural Research Program for National Institute of Mental Health, NIH, forudsat størstedelen af ​​midlerne samt laboratoriet rum, hvor blev udført disse eksperimenter. Howard Hughes Medical Institute-NIH Research Scholars Program også finansiering, der støttede dette forskningsprojekt. Hverken sponsor var involveret i design eller udførelse af selve forskningen, indsamling, analyse eller fortolkning af data, eller i udarbejdelse eller revision af den resulterende manuskript

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

den fremherskende aktuelle visning af patogenesen af ​​skizofreni nævner, at det er en neurologisk lidelse relateret til genetiske faktorer har indflydelse på hjernens udvikling og plasticitet. [1] Blandt de stadigt stigende antal formodede skizofreni modtagelighed gener er neuregulin-1 (NRG1), som først blev fundet at være forbundet med øget risiko for skizofreni i en islandske befolkning [2] og senere bekræftet i flere undersøgelser af andre befolkningsgrupper. [3] eksisterer NRG1 i flere isoformer, som alle indeholder en epidermal vækstfaktor (EGF) -lignende domæne, der kan signalere gennem erbB2, erbB3 eller erbB4 receptorer. [4] de fleste NRG1 isoformer eksistere som transmembrane proteiner, der menes at være proteolytisk spaltet, tillader ekstracellulært, EGF-lignende domæne til at binde til erbB-receptorer. [5] NRG1 er involveret i mange vigtige neurologiske funktioner, herunder neuronal migration, synaptisk modulation, og oligodendrocyt udvikling. [4], [6] Da der i det mindste teoretisk relateret til skizofreni s formodede neurologisk oprindelse disse funktioner og andre, der reguleres af NRG1, NRG1 er en biologisk plausibel skizofreni modtagelighed gen. Alligevel er den specifikke biologiske mekanisme af deres genetiske association med skizofreni og dens rolle i sygdom patogenese er ukendt.

Anvendelse af B-lymfoblaster som en celle model til at studere grundlæggende molekylære mekanismer og genetiske sammenslutninger af en række humane sygdomme , herunder neuropsykiatriske lidelser, bliver mere og mere udbredt. [7], [8], [9] anvendelsen af ​​denne model til at udforske celle migration synes særligt hensigtsmæssigt i betragtning, at neuronale og immunceller deler mange fælles molekylære og cellulære funktioner er vigtige for celle motilitet . [10], [11], [12] således kan molekylær karakterisering og genetiske sammenslutninger af celle motilitet i celler af hæmatopoietisk oprindelse give indsigt i neuronale cellulære processer. I nyere arbejde ved hjælp af en B lymfoblast celle model, viste vi, at B-lymfoblaster udtrykker erbB2 og ErbB3 receptorer, og at NRG1α signaler gennem disse receptorer via PI3K /Akt og PLC veje for at fremme kemotaktisk migration. [7] Vi fandt også, at genetisk variation både i NRG1 og COMT tidligere var forbundet med skizofreni forudsagde den vandrende respons af disse celler til NRG1, hvilket tyder på en potentiel cellulære mekanisme for den genetiske association til uorden. I denne undersøgelse undersøger vi celleadhæsion en grundlæggende komponent proces involveret i cellemotilitet. For at gøre dette, har vi udviklet en integrin-medieret celleadhæsion assay i 96-brønds plader baseret på et samspil mellem rekombinant humant ICAM-1 og dets CD11a /CD18 integrin heterodimer receptor udtrykkes på lymfoblaster.

Integriner er en klasse af celleoverfladereceptorer, der spiller vigtige roller i en bred vifte af cellulære og fysiologiske processer, der spænder fra fosterudviklingen til immunitet over for tumormetastase. [13], [14] Integriner danner heterodimere, transmembrane receptorer, der består af en α-underenhed ikke- kovalent forbundet med en β-underenhed. Integriner medierer signalering tovejs, med til at integrere intracellulære processer med det ekstracellulære miljø. Fastgørelse af integriner til ekstracellulære matrixproteiner eller counterreceptors stede på andre celler aktiverer såkaldt “outside-in” signalering, der fremmer en række cellulære processer, herunder reguleringen af ​​celleoverlevelse, proliferation og differentiering. [15] I mellemtiden, kemokin og anden kemisk stimulering af celler kan modulere klæbeevne integriner, fremme såkaldt “inside-out” signalering. [16], [17], [18], [19]

integriner er også blevet impliceret som spiller nøglefunktioner i mediere neuronal migration [20] og synapse dannelse og vedligeholdelse. De spiller kritiske roller i et væld af neurologiske processer, herunder neuronal forløber celleadhæsion, kæde migration, differentiering og spredning; [21], [22] regulering af neurale-radial glial interaktioner og fremme af ordentlig kortikale laminar organisation gennem interaktioner med Reelin [23] korrekt migration af optiske tectal neuroblasts i specifikke lagene; [24] ordentlig neural crest udvikling [25] neurale kegle vækst filopodial graduering [26] oligodendrocyt overlevelse [27] og retning af den neuromuskulære synaptogenese og migration af Schwann celler til periferien. [28] Blandt deres andre roller i synapse biologi er fremme af synaptisk modning, [29] mægling af synaptisk plasticitet, [30], [31] og afgørende engagement i LTP induktion [32] og stabilisering [33], [34] samt rumlig hukommelse. [32]

Fordi NRG1 og integriner konvergere på forskellige udviklingsprocesser knyttet til neuronal migration og synapse biologi og givet vores tidligere fund relateret til NRG1-medieret celle migration, vi udforskede virkningerne af NRG1 aktivering af lymfoblaster på integrin-medieret celleadhæsion. Vi rapporterer, at NRG1α inducerer varierende niveauer af celleadhæsion karakteriseret ved tidsafhængige udsving i fastheden af ​​binding som målt med et hidtil ukendt adhæsion assay. Den maksimale rækkevidde af denne variation i adhæsion over tid (i det følgende forkortet som MRVA) korrelerer stærkt med effektiviteten af ​​NRG1α-induceret cellemigration, hvilket indikerer, at MRVA foranstaltning har biologiske relevans i det mindste i disse celler. NRG1α-induceret MRVA er afhængig af erbB2 /PI3K /Akt signalering. Endvidere MRVA induceret af NRG1α er betydeligt lavere i B lymfoblaster afledt fra patienter med skizofreni sammenlignet med dem, der stammer fra normale kontroller. Endelig et enkelt nukleotid polymorfisme inden COMT, et gen involveret i modtagelighed både skizofreni og metastatisk cancer, viser en stærk tendens til at forudsige MRVA af en given cellelinje, selv hos normale forsøgspersoner. Samlet set vores undersøgelser viser, at NRG1 signalering aktiverer adhæsion maskiner i en proces, der er nedsat i celler afledt fra patienter med skizofreni. Hvis disse fund i immunceller er bevaret i neuronal celle processer, ville de hævde, at en mekanisme af NRG1 genetiske association med skizofreni indebærer molekylærbiologi celleadhæsion.

Resultater

lymfoblaster udtrykke integriner homogent

Lymfocytter overvejende udtrykker CD11a /CD18 integrin heterodimer (α

L /β

2, som også er kendt som leukocyt funktion antigen-1 eller LFA-1). [35] Vi brugte flowcytometri til analyse baseline integrin udtryk og sammenligne udtryk mellem cellelinjer afledt fra patienter med skizofreni versus normale kontroller. Alle testede cellelinier udtrykte CD11a (korrigeret median fluorescens, 14,018 ± 0,968) og CD18 (14,336 ± 1,019), undtagen for en patient-afledt cellelinie. Denne cellelinje blev udelukket fra alle yderligere forsøg og statistiske sammenligninger. Der var ingen signifikant forskel mellem cellelinjer afledt fra patienter eller kontroller i ekspressionen af ​​enten CD11a (patienter (n = 23), 13.479 ± 1.364; kontroller (n = 35), 14.790 ± 1,303; p = 0,5046) eller CD18 (patienter (n = 23), 14.215 ± 1,633; kontroller (n = 35), 14,832 ± 1.291; p = 0,7667). Korrelation af CD11a med CD18-ekspression (lineær regression (n = 58), r = 0,806; Fishers r til z, p 0,0001) var i overensstemmelse med den konklusion, at CD11a og CD18 hovedsagelig var at danne heterodimerer med hinanden. Således viser disse data, at vores lymfoblast cellelinjer udtrykker CD11a /CD18 integriner og at forskellen baseline udtryk for disse integriner er ikke en væsentlig faktor i forskelle i migration [7] eller vedhæftning (se nedenfor) af patient-afledte lymfoblaster.

NRG1α inducerer tidsligt varierende celleadhæsion

Indledende forsøg med vores vedhæftning assay foreslog, at vedhæftningen havde en tid afhængighed. Så blev udført Tidsforløb forsøg, hvor lymfoblaster blev udsat for NRG1α eller phorbolmyristatacetat (PMA) i ICAM-coatede plader til enten 15, 30, 45, eller 60 minutter, og derefter blev pladerne vasket for at fjerne celler, der ikke var fast vedhængende. PMA blev anvendt som en positiv kontrol, da det fremmer cellebinding ved direkte at aktivere PKC. For hver cellelinie blev celler udsat for den samme tid udsættelse for ICAM-overtrukne plader i fravær af NRG1α eller PMA. Variation i de rå NRG1 vedhæftede data (figur S1) og i NRG /bærestof-forholdet med tiden (figur 1, figur S1, figur S2, og fig S3) indikerede, at NRG1α-stimulerede celler som en population var svingende mellem tilstande af relativt fastere og svagere tilknytning i forhold til baseline kontrol vedhæftning. For at kvantificere den observerede variation i celleadhæsion, defineret vi NRG1-inducerede maksimale rækkevidde af varierende adhæsion (MRVA) som den maksimale NRG /bærestof-forholdet minus den minimale NRG /bærestof-forholdet af de fire tidspunkter (figur 1).

som svar på NRG1α stimulering over tid, celler af en given cellelinje som en befolkning svinger mellem tilstande af relativ løsrivelse og stater i relativ vedhæftet fil. For at teste pålideligheden af ​​disse mønstre blev ti cellelinier på to separate dage testet ved hjælp af vores adhæsion assay. To repræsentative eksempler er vist. Mens timingen af ​​toppe og dale varierede mellem kørsler, den maksimale rækkevidde af varierende friktion (MRVA) var bemærkelsesværdigt konsekvent (p = 0,016). Beregning af MRVA for hver kørsel af hver cellelinie er vist.

Den maksimale rækkevidde af varierende friktion (MRVA) vises karakteristiske for hver cellelinje

For yderligere at tage fat pålideligheden af disse mønstre, udførte vi gentaget adhæsionsassays på ti cellelinier på to separate dage. Disse ti linjer blev udvalgt til at give et spektrum af MRVA værdier i både patient og kontrol cellelinjer, herunder høj, midten, og lave niveauer af variation. Klare mønstre af varierende vedhæftning over tid blev set på begge dage, og selvom det faktiske mønster varierede mellem gentagne kørsler i forhold til de specifikke tidspunkter, der definerede rækken af ​​friktion, rækken af ​​vedhæftning reaktioner observeret (dvs. MRVA foranstaltning) var meget reproducerbar (Spearman rank korrelation (n = 10), rho = 0,806, p = 0,016) (Figur 1).

Den MRVA af NRG1α-induceret celleadhæsion forudsiger NRG1α-induceret migration

MRVA korrelerede positivt og stærkt signifikant med graden af ​​kemotaktiske migration som respons på NRG1α (lineær regression (n = 37), r

2 = 0,6065; Fishers r til z, p 0,0001) (figur 2), under anvendelse af data migration vi har tidligere rapporteret i de samme cellelinier. [7] (Tre cellelinier, der blev anvendt til de vedhæftning studier manglede migrationsdata og så blev ikke medtaget i denne sammenligning.) Disse data tyder på, at MRVA foranstaltning har bredere biologisk betydning, i det mindste til disse celler. Selvom sammenhængen ikke indikerer årsagssammenhæng, et varierende klæbende tilstand er en biologisk plausibel og nødvendig mekanisme til celle migration.

Adhæsionstests data blev sammenlignet med tilgængelige data indsamlet et år siden af ​​NRG1α migration forårsaget af de samme cellelinjer.

Definition af resultatmål

i betragtning af pålideligheden af ​​MRVA i en celle linje og dens tilsyneladende biologisk betydning blev MRVA etableret på dette tidspunkt som det primære afhængige måling for alle fremtidige vedhæftning eksperimenter. Desuden blev flere andre afhængige foranstaltninger defineres og anvendes til undersøgelse af virkningerne af signalering pathway hæmmere. To andre range foranstaltninger blev defineret som følger: 1) ICAM-only MRVA, som beregnes fra kontrol celler alene (maksimal minus minimum af de fire tidspunkter) og repræsenterer effekten af ​​endogen signalering og /eller tilstedeværelsen af ​​ICAM selv i modulering varierende adhæsion over tid, og 2) PMA /bærestof MRVA, som beregnes analogt med NRG /bærestof MRVA og repræsenterer variationen i celleadhæsion over tid som respons på PMA-stimulering. Et mål for netto baseline vedhæftning også blev defineret som følger: betyder ICAM effekt, som er gennemsnittet af de fire ICAM fluorescens værdier og repræsenterer den samlede “klæbrighed” eller relative vedhæftning tilstand kontrol celler ved baseline. I situationer, hvor en inhibitor udøves virkninger på både baseline og kemisk induceret vedhæftning blev den gennemsnitlige NRG og betyde PMA fluorescens værdier analyseret for at skelne mellem effekter på tælleren versus nævneren i den gennemsnitlige NRG /køretøj eller betyde PMA /køretøj nøgletal.

NRG1α medierer dens virkninger på celleadhæsion gennem erbB2 signalering

Vi har tidligere vist, at NRG1α-medieret migration af lymfoblaster var afhængig af erbB2 signalering; derfor, vi testede, om erbB2 stimulation var involveret i mekanismen for NRG1α-induceret celleadhæsion ved at behandle celler med den selektive erbB2 inhibitor AG825. AG825 udviste et signifikant dosisafhængig effekt på dæmper MRVA af NRG1α-induceret vedhæftning (ANOVA, F (3,4) = 23,358, p 0,0001). (Tal 3)

Administration af AG825 i DMSO køretøj (n = 5) forårsagede en robust, dosisafhængigt fald i MRVA induceret af NRG1α. Sammenlignet med kontrolgruppen køretøj, ** repræsenterer p 0,01 og **** repræsenterer p 0,0001. Sammenlignet med den lave dosis, + repræsenterer p 0,05 og +++ repræsenterer p. 0,001

PI3K signalering er afgørende for at mediere NRG1α-induceret varierende celleadhæsion

For at løse rolle PI3K signalering i NRG1α-induceret vedhæftning effekt, vi studerede den irreversible PI3K inhibitor wortmannin. De anvendte doser var alle godt under koncentrationer, som wortmannin krydsreagerer med MAPK, myosin let kæde-kinase (MLCK), eller phosphoinositid-4-kinase signalering i et forsøg på at specifikt at målrette PI3K signalering. Wortmannin udviste et signifikant, dosisafhængig, afdæmpende effekt på NRG /køretøj MRVA (ANOVA, F (3,4) = 17,208, p 0,0001). (Figur 4) med ingen effekt på baseline eller PMA-induceret vedhæftning

Wortmannin i DMSO køretøj (n = 5) viste en stærk, dosisafhængig, afdæmpende effekt på NRG /køretøj MRVA foranstaltning. Sammenlignet med kontrolgruppen køretøj, * repræsenterer p 0,05, ** repræsenterer p 0,01, og **** repræsenterer p 0,0001. Sammenlignet med den lave dosis, + repræsenterer p 0,05 og ++ repræsenterer p. 0,01

Akt hæmning efterligner PI3K hæmning og dæmper NRG1α-inducerede vedhæftning effekt

Akt Inhibitor X selektivt inhiberer phosphorylering af Akt med minimale virkninger på PI3K, PDK1, eller SGK1 signalering. Virkningerne af dette stof spejlet resultaterne af PI3K inhibering med en dosisafhængig, signifikant reduktion i NRG /bærestof MRVA (ANOVA, F (3,4) = 4,709, p = 0,0214) (figur 5a) og ingen effekt på ICAM alene eller PMA /køretøj MRVA. I modsætning til PI3K inhibering blev Akt inhibering forbundet med en signifikant reduktion i middel ICAM-alone fastgørelse (ANOVA, F (3,4) = 6,711, p = 0,0086) (figur 5b). Men denne reduktion kun set ved den højeste dosis (p = 0,0033). Denne samme virkning også blev set i en markant nedsættelse af rå NRG fluorescens værdier ved den høje dosis kun (ANOVA, F (3,4) = 11,639, p = 0,0007) uden nogen klar tendens på andre doser. I betragtning af denne fælles effekt på middel ICAM-alone og betyder NRG fastgørelse udelukkende ved den høje dosis, kan det udgøre en krydsreaktion af inhibitoren ved høje koncentrationer med en anden signalvej vigtig for opretholdelse en klæbende tilstand.

Administration af Akt Inhibitor X i vand køretøj (n = 5) forårsagede en dosisafhængig fald i NRG /bærestof MRVA (a). I modsætning PI3K inhibering blev Akt inhibering forbundet med en statistisk signifikant reduktion i middel ICAM (B) og gennemsnitlig NRG (ikke vist) rå fluorescens værdierne ved den høje dosis uden tendens ved lavere doser. Sammenlignet med kontrolgruppen køretøj, * repræsenterer p 0,05 og ** repræsenterer p 0,01. Sammenlignet med den lave dosis, + repræsenterer p 0,05 og ++ repræsenterer p. 0,01

Rho-kinase er ikke afgørende for NRG1- eller PMA-inducerede adhæsion effekter

Siden Rho også er nedstrøms for PI3K og er blevet impliceret i celle adhæsionsmekanismer, [36], [37] var det vigtigt at undersøge, om Rho spiller en rolle i NRG1-induceret celleadhæsion. Der er imidlertid ingen celle-permeable, specifikke Rho inhibitorer tilgængelige, så Rho-associerede protein kinase (ROCK) inhibitor Rho Kinase Inhibitor IV blev anvendt. Denne ROCK inhibitor havde nogen væsentlig indvirkning på nogen af ​​friktion parametre undersøgt, og så ROCK signalering ikke synes at spille nogen afgørende rolle i modulerende baseline, NRG1-induceret eller PMA-induceret varierende vedhæftning.

MEK signalering er ikke afgørende for NRG1-induceret celleadhæsion virkning

den selektive MEK-inhibitor PD98059 havde ingen virkning på nogen af ​​adhæsions- parametre til enhver dosis (ikke vist). Dette antyder, at selv var MEK signalering involveret i disse processer, er det ikke afgørende for baseline vedhæftning eller NRG1- eller PMA-medieret adhæsion.

Phospholipase C signalering er nødvendig for at opretholde en klæbende tilstand generelt

Ligesom PI3K, PLC-hæmmeren U73122 forårsagede også en signifikant reduktion i NRG1α-induceret MRVA (ANOVA, F (3,4) = 4,186, p = 0,0304) (figur 6a), men virkningen af ​​denne inhibitor syntes at være en samlet reduktion i celle vedhæftet fil i almindelighed, og ikke en NRG1 /erbB2-afhængig effekt. Både baseline variabilitet (ICAM-alone MRVA) (ANOVA, F (3,4) = 8,883, p = 0,0023) og baseline betyde vedhæftet fil (middel ICAM-alone) (ANOVA, F (3,4) = 4,915, p = 0,0186 ) faldt efter udsættelse for U73122 (figur 6b og c). Men ændringen i den gennemsnitlige ICAM-alone var kun signifikant ved den højeste dosis (p = 0,0155) (figur 6C). Ligeledes de rå gennemsnitlige NRG og PMA fluorescens værdier havde signifikante fald kun ved den højeste dosis (NRG: ANOVA, F (3,4) = 8,672, p = 0,0025; PMA: ANOVA, F (3,4) = 4,736, p = 0,0210). Det er vigtigt at bemærke, at hverken den gennemsnitlige NRG /køretøj (fig 6d) eller den gennemsnitlige PMA /køretøj (fig 6e) nøgletal signifikant forskellige på tværs doser, hvilket indikerer, at PLC-hæmning påvirker fælles cellulær signalering på tværs af disse veje til en tilsvarende grad uafhængig af den stimulerende middel. Selv om den PLC-hæmmeren gjorde udøver en signifikant virkning på at reducere NRG /bærestof MRVA, dette sandsynligvis skyldtes reducere den samlede vedhæftning og indsnævre området af den potentielle reaktion, snarere end til specifik inhibering af en NRG1 /erbB2-afhængige vej.

Mens PLC-hæmmeren U73122 i ethanol køretøj (n = 5) gjorde medføre en betydelig reduktion i NRG /køretøj MRVA (a) og en tendens til reduktion i PMA /køretøj MRVA (ikke vist), det udøvede en meget stærkere virkning på dæmpende baseline MRVA grund af tilstedeværelsen af ​​ICAM og endogen signalering alene (B). Endvidere ved høj dosis, det forårsagede en signifikant reduktion i baseline ICAM fastgørelse (C) og i middel NRG og PMA fastgørelse (rå fluorescensværdier) (ikke vist). Men betyder NRG /køretøj (D) og betyder PMA /køretøj (E), blev ikke ændret sig væsentligt. Sammenlignet med kontrolgruppen køretøj, * repræsenterer p 0,05 og ** repræsenterer p 0,01. Sammenlignet med den lave dosis, ++ repræsenterer p 0,01 og +++ repræsenterer p. 0,001

Myosin let kæde kinase (MLCK) signalering er vigtig for baseline vedhæftning

I betragtning af den kendte betydningen af ​​MLCK at fremme vedhæftning blev MLCK inhibitor ML-7 bruges til at undersøge dens virkninger på vores forskellige vedhæftning parametre. Som forventet, den væsentligste virkning af MLCK inhibering var en dosisafhængig fald i gennemsnitligt ICAM-alone fastgørelse (ANOVA, F (3,4) = 17,601, p 0,0001) (figur 7A). Der var imidlertid ingen ændringer i de rå fluorescensværdier af PMA (ANOVA, F (3,4) = 0,381, p = 0,7686) (figur 7b) eller NRG (ANOVA, F (3,4) = 0,322, p = 0,8095 ) (figur 7c). Ingen signifikante virkninger på nogen af ​​de tre MRVA parametre blev set. Det er også vigtigt at understrege, at de observerede af PLC versus MLCK hæmning effekter ikke var identiske. PLC-hæmning forårsaget fald i de rå NRG og PMA fluorescens værdier, tyder på brede betydning til flere fælles veje for vedhæftning. I modsætning hertil MLCK inhibering syntes at udøve en virkning begrænset til baseline ICAM adhæsion med nogen virkninger på de rå gennemsnitlige NRG eller PMA fluorescensværdier.

Administration af MLCK inhibitoren ML-7 i DMSO vehikel (n = 5) forårsagede en signifikant reduktion i baseline binding ved midten og høje doser (a). Selv om dette var forbundet med stigninger i middel NRG /køretøj og betyde PMA /køretøj (ikke vist), disse effekter blot var en konsekvens af reduktioner i nævneren som både de rå PMA (B) og NRG (C) fluorescens værdier var uændret. Sammenlignet med kontrolgruppen køretøj, ** repræsenterer p 0,01 og *** repræsenterer p 0,001. Sammenlignet med den lave dosis, +++ repræsenterer p 0,001 og ++++ repræsenterer p 0,0001

NRG1α-induceret varierende vedhæftning dæmpes i lymfoblaster afledt af patienter med skizofreni

Da vores forudgående observation, at patient-afledte lymfoblaster viste en mindre robust vandrende reaktion på NRG1α og den nuværende sammenhæng mellem vores migration og vedhæftning foranstaltninger, vi forudsagde, at der også ville være en MRVA forskel mellem patienter og kontroller. Faktisk NRG /bærestof MRVA var signifikant lavere i lymfoblaster afledt fra patienter sammenlignet med dem, der stammer fra normale kontroller (patienter (n = 20), 0,520 ± 0,045; kontroller (n = 20), 0,780 ± 0,044; p = 0,0002) ( Figur 8a og c). I modsætning hertil PMA respons var ens mellem grupperne, hvilket indikerer, at patienten-afledte lymfoblaster stadig bevaret evnen til at formidle robust celleadhæsion, men var ude af stand til at gøre det passende reaktion på NRG1α. En serie af PMA dosis-respons eksperimenter blev udført for at udelukke, at manglen på forskelle mellem grupperne var en dosis-følsom fænomen; disse tests viste næsten identiske bølgeformer i alle fag på alle analyserede koncentrationer (figur S2), hvilket yderligere antyder, at PMA respons var normal i patient-afledte cellelinier. Det er vigtigt at bemærke, at PMA inducerede også varierende niveauer af adhæsion i vores assay, der ligner, men mere ekstreme end NRG1α. Både MRVA foranstaltning af PMA-induceret adhæsion (patienter (n = 20), 1.561 ± 0,217; kontroller (n = 20), 1,356 ± 0,121; p = 0.4124) (figur 8B) og den gennemsnitlige PMA /køretøj (patienter (n = 20), 2,083 ± 0,120; kontroller (n = 20), 1,980 ± 0,085; p = 0,4840) var ikke forskellig mellem patient-afledt og kontrol-afledte celler. Der var ingen forskel i den gennemsnitlige ICAM tilknytning mellem patient-afledt og kontrol-afledte celler i ustimulerede ICAM-alone tilstand.

NRG /køretøj MRVA var signifikant lavere i lymfoblaster afledt af patienter i forhold til dem, der stammer fra normal kontroller (A). PMA /køretøj MRVA var ens mellem patient-afledt og kontrol-afledte cellelinjer (B). Den relative svækkelse i patient-afledte celler synes ikke at være isoleret til fastgørelse eller løsrivelse, men var tegn på en samlet mere trange respons med mindre variation fra baseline vedhæftning som reaktion på NRG1α (C). *** Repræsenterer p. 0,001

COMT genotype forudsiger vifte af variation i NRG1α-induceret vedhæftning

I betragtning af forholdet af enkelte nukleotid polymorfier i COMT (val108 /158met, rs4680 ) og i NRG1 (rs6994992) til NRG1α-induceret cellemigration tidligere konstaterede [7] vi søgt at bestemme, om NRG1α-induceret celleadhæsion viste også sådanne sammenslutninger. Tilstedeværelsen af ​​skizofreni risiko-associerede COMT val allel viste en stærk tendens til at forudsige mindre NRG1α-induceret MRVA i hele prøven med lignende virkninger i begge grupper (uparret t-test, p = 0,0632) (Figur 9a). ANOVA udført med diagnostisk gruppe og genotype som uafhængige faktorer viste ingen genotype ved diagnose interaktioner for enten gen. Derudover var der ingen effekt af COMT genotypen på PMA-induceret MRVA (uparret t-test, p = 0,8727). På grund af den lave mindre allel frekvens på NRG1 rs6994992, vores undersøgelse underdimensioneret for at teste for en forening med denne SNP.

COMT, et formodet modtagelighed gen for både skizofreni og metastatisk cancer, som tidligere blev vist at have genotype virkninger på celle migration med risiko genotypen rs4680 V /V viser mest svækket migration. I vores vedhæftning data (n = 40), var der en stærk tendens (p = 0,0632) mod nedsat NRG1α-induceret MRVA af risikofaktorer homozygoter sammenlignet med ikke-risiko homozygote (ingen heterozygot cellelinier opretholdes).

diskussion

Vi har præsenteret en række undersøgelser, der beviser, at NRG1α aktivering af B-lymfoblaster inducerer en tidsmæssigt varierende celleadhæsion respons, som er medieret af erbB2 /PI3K /Akt1 vej, og som er unormalt i celler stammer fra patienter med skizofreni og påvirkes af COMT val /mødte genotype. Så vidt vi ved, er disse de første data, der viser, at NRG1α inducerer fastgørelse i B lymfoblaster i et assay af celleadhæsion, afslørende tidsafhængig udsving i netto adhæsion. I vores undersøgelser, at MRVA af denne NRG1α-induceret vedhæftning reaktion har tilsyneladende biologisk relevans, idet det forudsiger både graden af ​​cellen migration respons på NRG1α samt forskellene mellem skizofreni sager og normale kontrolpersoner. Til gengæld kan den MRVA selv forudsiges ved et enkelt nukleotid polymorfisme inden COMT, som er også impliceret i metastatisk cancer. Mens exogent NRG1α forøger celleoverfladeekspression af CD18 integrin (fig S4), den stabile natur af denne effekt over tid antyder, at denne øgede overfladeekspression er ikke direkte ansvarlig for at mediere tidsligt varierende vedhæftning respons. Snarere, denne NRG1α-inducerede adhæsion respons afhænger signalering gennem erbB2, PI3K, og AKT pathways. PLC og MLCK signalering spiller også roller i vedhæftning, men ikke udøver NRG1α-specifikke effekter.

Metodiske overvejelser

Som den tidsafhængige variation i celleadhæsion som reaktion på NRG1 er den kritiske fænomen hvorpå arbejdet rapporteres heri er baseret på, er det vigtigt at validere, at denne variation udgør en reel biologisk effekt og er ikke blot “støj.” Ja, det kan hævdes, at da vores mål er baseret på en population af celler, der sandsynligvis er ikke homogen med hensyn til vedhæftede stater, cellecyklusfaser og andre biologiske fænomener, den MRVA er mere sandsynligt tilfældig end ikke. Vi har udført en række detaljerede eksperimenter viser overbevisende og konsekvent, at denne varierende vedhæftning er ikke tilfældig: specifikt, 1) særlige tidsmæssige mønstre af tilknytning og løsrivelse, mens ikke iboende selve den ustimulerede celle, synes at være relativt bevaret, når celler fra samme cellelinje under de samme betingelser på samme tid udsættes for specifikke stimuli, der ændrer deres fastgørelse tilstand (fig S2); 2) MRVA er bemærkelsesværdigt pålidelige inden for en cellelinie undersøgt gentagne gange på forskellige dage (figur 1); 3) MRVA påvirkes på en dosis-afhængig måde ved forskellige relevante signalvej inhibitorer (fig 3-7);