PLoS ONE: Hepatocyt Nuclear Factor 1A (HNF1A) som en mulig tumorsuppressor i pancreas Cancer

Abstrakt

Baggrund

HNF1A (Hepatocyt nuklear faktor 1 alfa) er en transskription faktor, der er kendt at regulere pankreatisk differentiering og opretholde homøostase af endokrine pancreas. For nylig har genom-dækkende associationsstudier impliceret

HNF1A

som modtagelighed gen for kræft i bugspytkirtlen. Men den funktionelle betydning og molekylære mekanisme af

HNF1A

i bugspytkirtlen carcinogenese fortsat uklart.

Metoder

Brug RT-PCR, Western blot og immunhistokemi metoder, vi undersøgte

HNF1A

genekspression i otte pancreas carcinoma cellelinier og i parrede tumorvæv og normalt vævsprøver fra patienter med opereret pancreas duktalt adenokarcinom. Vi bankede ned

HNF1A

genekspression i to cancer cellelinjer bruger tre siRNA-sekvenser. Virkningerne på celleproliferation, apoptose, og cellecyklus samt phosphorylering af Akt signalering transduktion proteiner blev undersøgt ved hjælp af ATP assay, flowcytometri og Western blot.

Resultater

HNF1A

blev udtrykt i tre ud af otte pancreas adenocarcinom cellelinjer og niveauet af

HNF1A

mRNA og proteinekspression var signifikant lavere i tumorer end i normale tilgrænsende væv ved både RT-PCR og Western blot-analyser. Immunhistokemi viste, at niveauet af

HNF1A

ekspression var signifikant lavere i tumorvæv end i ikke-tumorvæv. Selektiv blokering af

HNF1A

ved specifik siRNA tillægges en 2-fold højere celleproliferation, 20% øget S-fasen og G2 fase celler, og 30-40% reduceret apoptose i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Vi yderligere vist, at

HNF1A

knockdown aktiveret Akt og dens nedstrøms mål, pattedyr mål for rapamycin (mTOR) i bugspytkirtelkræftceller.

Konklusion

Disse observationer giver eksperimentelle beviser støtte en eventuel tumor suppressor rolle HNF1A i bugspytkirtelkræft

Henvisning:. Luo Z, Li Y, Wang H, Fleming J, Li M, Kang Y et al. (2015) Hepatocyt Nuclear Factor 1A (HNF1A) som en mulig tumorsuppressor i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 10 (3): e0121082. doi: 10,1371 /journal.pone.0121082

Academic Redaktør: Jose G. Trevino, University of Florida, USA

Modtaget: August 20, 2014 Accepteret: 28 januar 2015; Udgivet: 20 Marts 2015

Copyright: © 2015 Luo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. GS Hogan forskningsmidler og Sheikh Ahmed center for bugspytkirtelkræft forskningsmidler. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Seneste indlæg GWAS (genom-dækkende forening undersøgelse) dataanalyser har vist, at

HNF1A

(

Hepatocyt nuklear faktor 1

) genvarianter er forbundet med risiko for kræft i bugspytkirtlen [ ,,,0],1-3]. Men den funktionelle betydning og molekylære mekanismer af HNF1A-medieret pancreas carcinogenese forbliver uklar.

HNF1A tilhører homeobox proteinfamilien og er en væsentlig transkriptionsfaktor for mange hepatiske gener involveret i afgiftning, homeostase og stofskifte af glukose, lipid, et steroid og aminosyre [4]. Desuden HNF1A er en vigtig del af de transkriptionelle netværk for embryonale bugspytkirtlen udvikling og differentiering [5], [6]. samt at opretholde væksten og funktionen af ​​ø-p-celler i voksne [7]. Kimcellelinje heterozygote mutationer af

HNF1A

er blevet fundet ansvarlig for type 3 MODY (modenhed-debut diabetes af den unge) [8]. Mutationer eller almindelige varianter af

HNF1A

genet har også været forbundet med risiko for type II diabetes [9-11].

Som en transkriptionel faktor, HNF1A har også vist sig at påvirke intestinal epitelcelle vækst og cellelinier differentiering [12], [13] og regulere ekspressionen af ​​microRNA-194 [14]. Tidligere undersøgelser i andre menneskelige kræftformer har foreslået en tumor suppressor rolle

HNF1A

gen. For eksempel biallele somatiske ændringer af

HNF1A

var til stede i 60% af hepatocellulære adenomer og i sjældne tilfælde af hepatocellulære karcinomer i ikke-syge lever [15].

HNF1A

silencing af siRNA i hepatocellulære carcinomceller induceret overekspression af flere gener, der koder vækstfaktorreceptorer, komponenter af den translationelle maskineri, cellecyklus, og angiogenese regulatorer [16]. Mutationer af

HNF1A

gen blev også påvist i kolorektal cancer med mikrosatellit ustabilitet [17] og i endometriecancer [18]. Polymorfe varianter af

HNF1A

gen har været forbundet med cirkulerende niveau af C-reaktivt protein (CRP), en biomarkør for inflammation [19], [20]. En nylig GWAS undersøgelse af human N-glycome identificerer HNF1A som en mester regulator af plasmaprotein fucosylering [21]. Dette tyder på, at HNF1A kunne spille en rolle i udviklingen af ​​kræft gennem regulering af immunitet, inflammatorisk respons, og proteinfoldning, samt cellevækst og differentiering. Men er der endnu ingen oplysninger om udtrykket eller mutation status og potentielle rolle

HNF1A

i human bugspytkirtelkræft.

I denne undersøgelse, vi sigter mod at demonstrere udtryk for

HNF1A

gen i human bugspytkirtelkræft og virkningen af ​​

HNF1A

deregulering på celleproliferation, cellecyklus, apoptose og signaler transduktion i bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og Metoder

cellelinier og humane væv Salg

Humane pancreas adenocarcinom cellelinier aspC-1, Panc-1, MiaPaCa-2, Hs766T, og BxPC-3-celler blev erhvervet fra American Type Culture Collection og dyrket som beskrevet i deres produkt faktablade. Panc-28, Colo357 og den hurtigt voksende (FG) underlinie, samt den immortaliserede normal human pancreas ductal epitel (HDPE) cellelinie var gaver fra Drs. Craig D. Logsdon (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX) [22], [23]. Alle cellelinjer er blevet autentificeret ved at teste 14 polymorfe markører. Cancerceller blev dyrket i RPMI 1640 medium eller Dulbeccos modificerede Eagles medium tilsat 10% føtalt bovint serum. HDPE celle blev opretholdt i keratinocyt serumfrit medium suppleret med epidermal vækstfaktor og oksehypofyseekstrakt.

Formalin paraffinindlejrede (FFPE) sektioner og frosne prøver fra 48 par af kirurgisk resektion pancreas tumorvæv og deres tilstødende ikke-tumorvæv blev opnået fra MD Anderson Tissue Bank. FFPE blev anvendt til immunhistokemi. Frosne væv blev anvendt til RNA og protein ekstraktion. Alle vævsprøver anvendt i denne undersøgelse var resterende kirurgiske prøver fra patienter, der undergår tumorresektion uden præoperativ behandling ved MD Anderson Cancer Center med et skriftligt informeret samtykke underskrevet af hver patient. Alle vævsprøver blev evalueret af en patolog (Dr. Wang) for at sikre cellularitet af tumorvæv og renheden af ​​normale tilstødende væv. Undersøgelsen og samtykkeerklæringen blev godkendt af MD Anderson Institutional Review Board.

Immunhistokemi (IHC) og Western Blotting

Efter afparaffinering blev vævssnit udsat for antigen hentning og endogen peroxidase aktivitet blokering. Det primære antistof blev anvendt, var kanin HNF1A antistof fra EPITOMICS (Burlingame, CA) ved en fortynding på 1: 200. Efter behandling med det biotinylerede sekundære antistof blev antistof-kompleks påvises ved anvendelse af et avidin-biotin-peroxidase-kompleks opløsning og fremkaldes med 3,3′-diaminobenzidin (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA). En negativ kontrol blev inkluderet i hvert forsøg ved at udelade primært antistof. Billeder blev evalueret af en erfaren patolog for farvningsmønstre i forskellige typer af pancreasceller, forskellige cellulære bestanddele, samt i tumor og normale væv. Snit fra det samme væv blokken blev også farvet for phosphorylerede AKT og mTOR anvendelse af anti-phospho-AKT (Ser473) og anti-phospho-mTOR (Ser2448) antistoffer. Den farvningsintensitet blev scoret som 0 for negativ, 1 for svag, 2 for mellemliggende og 3 for stærk farvning. Procentdelen af ​​celler med positiv farvning blev bedømt som 0 for ingen, 1 for 1-50%, og 2 for 50%. Det endelige farvning score var produktet af intensitet og procentvise scoringer. Forskellen i farvende snesevis af de ikke-tumor og tumorform væv blev sammenlignet ved parret t-test.

Proteinekspression blev også evalueret i proteinprøver udvundet af cellelinjer og frosne vævsprøver ved hjælp af Western blotting. Protein blev ekstraheret fra hel-celle-proteinlysater og koncentration bestemt ved anvendelse af Bradford farvning metode. Proteinekstrakter blev fraktioneret ved polyacrylamidgelelektroforese og overført til en Mini PVDF-membran under anvendelse af en Trans-Blot Turbo overføringssystem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). De primære antistoffer anvendes, indbefatter: HNF1A fra BD Biosciences (San Jose, CA) ved 1: 1000 fortynding; samlede AKT, phospho-AKT (Ser473), og phospho-AKT (Thr308) ved 1: 2000 fortynding; og total mTOR og phospho-mTOR (Ser2448) ved 1: 1000 fortynding fra Cell Signaling (Danvers, MA). Beta-actin ved 1: 3000 fortyndinger blev anvendt som indlæsning kontrol. Efter inkubering med passende sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase, blev membranerne eksponeret for ECL Western Blotting påvisningsreagens. Membraner blev strippet i 30 minutter ved 55 ° C i en puffer indeholdende 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH6.7), og 100 mM 2-mercaptoethanol i farvning af multiple proteiner. Farvningsintensiteter blev kvantificeret ved densitometrisk analyse.

mRNA-ekspression

Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler samt fra 27 par af pancreas tumor og deres tilgrænsende ikke-tumorvæv ved hjælp Trizol reagens ifølge producentens protokol (Life Technologies, Grand Island, NY). Komplementært DNA blev syntetiseret fra 1,0 pg totalt RNA ved anvendelse af cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) blev udført i tredobbelte prøver ved hjælp forhåndsudformede primere og probe sæt (Hs00167041-m1, Life Technologies, Grand Island, NY). RT-PCR-resultater blev først normaliseret til tærskelværdien cyklus (Ct) af GAPDH, benævnt ACt. Den gange ændring i ekspression af gener i tumoren gruppe sammenlignet med den i den normale gruppe blev udtrykt som 2

-ΔΔCt, i hvilken-ΔΔCt lig med ACt af tumoren gruppe minus ACt af den normale gruppe, som var normaliseret til 1. Salg

siRNA blokering

Små interfererende RNA (siRNA) transfektioner blev udført under anvendelse af transfektion reagens ifølge producentens protokol (Life Technologies, Grand Island, NY). Tre forskellige siRNA-duplexer målretning

HNF1A

gen (NM_000545) blev testet. Sekvenserne af siRNA’er er som følger: 5′-CAGUGAGACUGCAGAAGUAtt-3 ‘(

HNF1A

siRNA1), 5′-GGUCUUCACCUCAGACACUtt-3′ (

HNF1A

siRNA2), 5′-CACCUGUCCCAACACCUCAtt- 3 ‘(

HNF1A

siRNA3). En negativ kontrol siRNA eller transfektionsreagens kun blev brugt i mock transfektioner. AspC-1 og BXPC-3 celler blev transficeret og celler blev høstet 24 timer til 96 timer efter transfektion.

cellevækst og proliferation

Celleproliferation blev kvantificeret under anvendelse af et ATP-assay (Promega, Madison , WI). Kort fortalt blev 10.000 celler per brønd i 96-brønds plader transient transficeret med

HNF1A

siRNA eller kontrol siRNA (10 nM). Et tilsvarende volumen af ​​reagens blev tilsat til kulturen 12, 24, 48 og 72 timer efter transfektion for luminescens detektion. Tre uafhængige forsøg blev udført på hvert tidspunkt.

Cell Cycle og apoptose-assay

72h efter transfektion blev cellerne høstet og suspenderet i citrat stabiliserende buffer indeholdende 125 ug /ml propidiumiodid (PI) og RNase A. cellecyklusfordeling blev bestemt ved flowcytometri.

Apoptose blev vurderet ved anvendelse af fluoresceinisothiocyanat (FITC) annexin V og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning metode 72h efter transfektion. Apoptotiske celler blev identificeret ved hjælp af flow-cytometrisk analyse under anvendelse af BD-celle analysator og FCS Express software-Clinical Edition (BD Bioscience, San Jose, CA). Både tidlige og sene apoptotiske celler blev talt for relative apoptotiske ændringer. Alle eksperimenter blev udført i triplikater.

Alle data i replikat eksperimenter blev beskrevet som gennemsnit ± SD. Parret t-test eller studerende t-test (2-halet) blev anvendt med

P

værdi 0,05 som signifikansniveauet.

Resultater

Angivelse af

HNF1A

i bugspytkirtlen karcinom cellelinjer

Brug kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og Western blot-analyser, vi viste, at

HNF1A

blev udtrykt i tre velkarakteriserede bugspytkirtlen karcinom cellelinjer afledt enten fra de primære pancreasadenocarcinom tumorer (BxPC-3) eller metastatiske steder (aSPC-1, Colo357) med højeste niveau detekteres i AsPC-1 (fig. 1A).

HNF1A

udtryk var knap påvises i MiaPaCa-2 celler og ikke påvises i de resterende carcinom cellelinjer og HDPE (fig. 1). Western blot-analyse bekræftede tilstedeværelsen af ​​HNF1A protein i BxPC-3, AsPC-1 og Colo357 celler, det lavere niveau i MiaPaCa-2 og fraværet i Panc-1, FG, Hs766T, Panc-28 og Æske med HDPE-celler (fig. 1B ).

A, mRNA-ekspression niveau i humane bugspytkirtelkræft cellelinier i forhold til at styre cellelinje COLO357 som målt ved QRT-PCR. B, proteinekspression i tilsvarende cellelinjer ved Western blot. C, fold forskelle i mRNA-ekspressionsniveauer af 27 pancreas tumorer i forhold til deres parrede hosliggende ikke-tumorvæv. D og E, Western blots og kvantitativ måling af ekspression af HNF1A protein i otte parrede humane pancreatiske tumorer prøver (T) og deres tilgrænsende ikke-tumor (N) væv. Ekspressionsniveauerne af HNF1A normaliseres til dem af β-actin.

Reduceret udtryk for

HNF1A

i human pancreas adenocarcinom

HNF1A

mRNA-ekspression blev påvist ved QRT-PCR i 27 parrede reseceret pancreasadenocarcinom tumorvæv og deres tilgrænsende ikke-tumorvæv. Niveauet af

HNF1A

udtryk var signifikant lavere i tumor end i ikke-tumorvæv (

s

= 0,005, parret

t

test) (Fig. 1C). Det gennemsnitlige niveau af

HNF1A

mRNA ekspression i tumorvæv blev reduceret til 44,4% af det i ikke-tumorvæv, selv om tre ud af de 27 par viste et højere niveau af

HNF1A

udtryk i tumorerne.

Dernæst blev Western blot udført i otte par tumor og ikke-tumorvæv for at undersøge HNF1A ekspression på proteinniveauet. Ved Western blot (Fig. 1D), fandt vi et lavere HNF1A protein i 7/8 (87,5%) af tumorerne sammenlignet med deres tilstødende ikke-tumorvæv (fig. 1E). Gennemsnitlig (± SD) intensiteten af ​​HNF1A bandet efter normaliseret til den for β-actin var signifikant lavere i tumor (0,71 ± 0,11) end i ikke-tumorvæv (0,80 ± 0,13) (

s

= 0,005, parret

t

test). IHC eksperimenter afslørede klare forskelle i HNF1A proteinekspression mellem normal (Fig. 2A og 2B) og kræft pancreas (fig. 2C og 2D). HNF1A protein var til stede med en stærk intensitet i normale endokrine og eksokrine pancreas. Ø-celle-og acinar celle viste en stærkere kerner farvning end de duktale celler gjorde. I modsætning hertil i tumorvævet blev HNF1A udtrykt ved moderate niveauer i ø og acinære celler, men på et lavt niveau eller uopdaget i duktale celler. Stromale væv, der omgiver de neoplastiske læsioner viste ikke signifikant farvning for HNF1A. Den gennemsnitlige farvning score (gennemsnit ± SD) var 5,08 ± 2,17 versus 2,27 ± 1,45 i 48 par af ikke-tumor og tumorform væv, henholdsvis (

P

0,001, parret

t

test) (tabel 1).

Billeder (A og B) viser cytoplasmatisk og nuklear ekspression af HNF1A i normalt pancreasvæv. De normale pancreas kanaler er markeret med enkelt pil. Øceller er markeret med dobbelte pile. Pancreasøceller har højere niveau af HNF1A ekspression end acinar og duktale celler. Billeder (C og D) viser ekspressionen af ​​HNF1A i pancreas duktal adenokarcinom (cirkel) og benigne pankreatiske duktale celler og øceller støder op til tumoren (venstre). Panel E-H viser de repræsentative micrographs for p-AKT (E og F) og p-mTOR (G og H) ekspression i normale pancreas væv (E og G) og pancreatisk ductal adenocarcinom (F og H). Forstørrelser: 100X til A, E og G; 400X for B og H, 40X for C, 200X for D og F.

Blokering

HNF1A

ved specifik siRNA

Tre forskellige siRNA’er sekvenser målrettet

HNF1A

exon 4 (siRNA1), exon 1 (siRNA2) eller exon 8-9 krydset (siRNA3) blev transficeret i AsPC-1 og BxPC-3 celler. Kvantitativ PCR-analyse viste, at 48 timer efter behandling, de tre uafhængige siRNA-medieret

HNF1A

knockdowns resulterede i 92%, 80% og 64% udslettelse af

HNF1A

mRNA-ekspression i aspC-1 celler, og 98%, 74% og 65% udryddelse i BxPC-3-celler, (fig. 3A og 3B). Supplering af mRNA data viste Western blot-analyse, at ekspression af HNF1A protein i celler behandlet med specifikke siRNA’er væsentligt reduceret (fig. 3C og 3D). På den anden side blev transkription niveau af

HNF1A

ikke påvirket i vektor kontrollerne. Baseret på disse observationer, vi brugte siRNA1 og siRNA2 i de følgende eksperimenter.

Celler blev transficeret selvstændigt med tre forskellige sekvenser af siRNA rettet mod HNF1A (siRNA1, siRNA2, siRNA3), eller med en kontrol siRNA (kontrol) . Inhiberingseksperimenter effektivitet blev vurderet af qPCR for relative niveauer af HNF1A mRNA på 24 timer til 96 timer efter transfektionerne. Western blot-analyser af AsPC-1 og BxPC-3-celler transficeret med anti-HNF1A siRNAs. Data er vist for 96 timer efter transfektioner. Ekspression af β-actin blev anvendt som en intern kontrol.

Virkningen af ​​

HNF1A

knockdown på cellevækst og apoptose

Brug siRNA1 og siRNA2 som et effektivt redskab til tavshed

HNF1A

gen, fandt vi, at

HNF1A

knockdown tillagt en 2-fold øget spredning af AsPC-1 (fig. 4A) og BxPC-3 (fig. 4B) celler. Især blev cellevækst ikke påvirket af transfektion af vektor kontrol. Konsekvent, observerede vi, at

HNF1A

knockdown føre til en 20% reduceret G0 /G1 befolkning og en 20% øget S /G2 fase befolkningen i de to testede cellelinier (fig. 4c og 4d). Desuden sammenligne til vektorkontrol, transfektion med

HNF1A Salg siRNA’er faldt betydeligt procentdelen af ​​apoptotiske celler. Annexin-positive celler (gennemsnit ± SD) blev reduceret fra 44,57 ± 11,57 til 13,37 ± 1,51 i aspC-1-celler, og fra 54,37 ± 7,58 til 12,6 ± 2,19 i BxPC-3-celler (fig. 5).

bugspytkirtelkræft cellelinjer blev transficeret med en af ​​de to HNF1A siRNA’er eller en kontrol siRNA. Proliferationshastigheden af ​​siRNA-transficerede celler blev vurderet ved CellTiter-Glo assay på AsPC-1 (A) og BxPC-3 (B) celler 12 timer til 72 timer efter transfektion. Cellecyklusfordeling blev bestemt ved fluorescens-aktiveret cellesortering analyse i AsPC-1 (C) og BxPC-3 (D) celler. Celler blev farvet med PI, og analyseret for DNA-indhold ved hjælp af flowcytometri 72H følgende transfektioner. De populationer af celler i G1, S og G2 faserne er karakteriseret ved forskellige intensiteter af PI-fluorescens og er angivet. Data er vist i forhold til kontrollen. * P. 0,05 sammenlignet med hver tilsvarende kontrol

72 timer efter transfektion med anti-

HNF1A

siRNA’er, aspC-1 og BxPC-3 celler blev farvet med FITC konjugeret Annexin -V /PI. Procentdel af Annexin-V /PI-farvede celler blev bestemt ved flowcytometri. Dot plot blev opdelt i en kvadrant: (1) nekrotiske celler, (2) sent apoptotiske celler, (3) levende celler, og (4) tidligt apoptotiske celler. Søjlediagram viser procentdelen af ​​apoptotiske celler. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD fra tre forskellige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen

Tab af

HNF1A

Actives den AKT /mTOR signalvejen

AKT /mTOR signalvejen er afgørende for mange aspekter af cellevækst, overlevelse og apoptose [24]. Den konstitutive aktivering af AKT /mTOR har været involveret i patogenesen og progression af kræft i bugspytkirtlen [25]. For at belyse de molekylære mekanismer moduleret af

HNF1A

inaktivering i bugspytkirtelkræftceller, undersøgte vi virkningen af ​​

HNF1A

knockdown på AKT /mTOR signalvejen. Ved hjælp af Western blotting, fandt vi, at onkogen signalering fosfor-AKT og dens downstream fosfor tilsam- mTOR var opreguleret efter transfektion med

HNF1A

siRNA’er i både AsPC-1 og BxPC-3-celler (Fig. 6). Følgelig er de niveauer af phosphorylering af AKT på Ser473 og Thr308 var signifikant øget sammenlignet med deres tilsvarende kontrol. Samtidigt blev grader af mTOR Ser2448 fosforylering bemærkelsesværdigt forbedret. Ingen virkning blev observeret på total AKT og mTOR udtryk. IHC analyser i parret tumor og normale pancreas væv fandt også signifikant højere niveauer af phosphoryleret AKT og mTOR i tumorer end i normale væv (fig. 2, tabel 1).

AsPC-1 og BxPC-3-celler blev transficeret med kontrol siRNA og to forskellige

HNF1A

siRNAs som angivet. 96h efter transfektion blev cellelysater immunoblottedes med anti HNF1A antistof, anti-phospho-AKT Ser473-antistof, anti-phospho-AKT Thr308-antistof og anti-phospho-mTOR Ser2448 antistof. Membraner blev strippet og re-undersøgt med anti-AKT-antistof, anti-mTOR-antistof og anti-β-actin-antistof. De fold forskelle i protein ekspressionsniveauer af celler transficeret med

HNF1A

siRNA og styrer siRNA blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg.

Diskussion

I denne undersøgelse, har vi givet nogle eksperimentelle beviser for, at

HNF1A

gen kan fungere som en tumor suppressor i bugspytkirtelkræft. Først reduceret ekspression af

HNF1A

blev påvist i human pancreas adenocarcinom både mRNA og protein niveauer. For det andet,

HNF1A

knockdown i bugspytkirtelkræftceller føre til øget celledeling og reduceret apoptose. For det tredje, hæmning af

HNF1A

forbedret aktiveringen af ​​AKT-mTOR-signalvejen. Disse data er i overensstemmelse med tidligere rapporterede observationer i leverkræft undersøgelser [15], [16]. støtte en tumor suppressor rolle

HNF1A

i udviklingen af ​​menneskelige kræftformer.

HNF1A

genekspression blev oprindeligt opdaget i leveren, efterfølgende vist sig at blive udtrykt i epitel af adskillige organer, herunder pancreas, nyre og tarm [13].

HNF1A

deficiente mus (

HNF1A

– /-

) er født normalt, men lider af lever-, pancreas og nyre funktionelle defekter [26-28] . Hos mennesker, patienter, der bærer mono-allele mutationer i

HNF1A

lider type 3 MODY med renal dysfunktioner [8]. Somatiske mutationer af

HNF1A

gen er blevet rapporteret i hepatoma, tyktarmskræft og endometriecancer [16-18]. Nylige GWAS undersøgelser har antydet, at

HNF1A

genet er forbundet med risiko for kræft i bugspytkirtlen [1-3], som fik den nuværende undersøgelse på den funktionelle betydning af dette gen i bugspytkirtelkræft.

I denne undersøgelse, IHC analyse af humane pancreas væv har vist, at HNF1A protein blev udtrykt på et højere niveau i øceller og acinære celler sammenlignet med den i duktale epitelceller, hvilket er i overensstemmelse med den funktionelle betydning af dette gen i at bevare homeostase af endokrine pancreas. På den anden side, mRNA og protein ekspressionsniveauet af HNF1A (både IHC og Western blot-analyser) var signifikant lavere i pancreas tumorer end i de omgivende ikke-tumorvæv, hvilket er konsistent med en potentiel tumor suppressor rolle af dette gen i kræft i bugspytkirtlen.

tumor suppressor rolle HNF1A understøttes også af resultaterne fra gen knockdown eksperimenter. Vi har observeret, at inhibering af

HNF1A

af siRNA’er i pancreas carcinomceller resulterede i en signifikant øget celleproliferation. Lignende resultater er tidligere blevet rapporteret af Molero X et al, at HNF1A

– /- mus viser forøget acinar celleproliferation i basale betingelser og efter pancreatitis induktion [29]. For bedre at forstå den mekanisme af

HNF1A

-inactivation induceret cellevækst, vi har endvidere vist, at nedregulering af

HNF1A

resulterede i et fald G0 /G1 fasen, en øget S fasen, og en let forhøjelse af G2 /M-fase-fraktionen. En tidligere undersøgelse med hepatoma cellelinier har fundet forhøjet niveau af cyclin D1 som reaktion på

HNF1A

inaktivering [16]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at påvise hvilke cellecyklus regulator modulerer

HNF1A

siRNA-medieret proliferation i bugspytkirtelkræft cellelinjer.

Vi næste viste en reduceret apoptose sats i

HNF1A

-inactivated pancreas carcinomceller. Denne effekt synes i modstrid med bemærkningerne i humane bugspytkirtlens beta-celler. Adskillige tidligere studier har vist, at overekspression af en dominant negativ mutant af

HNF1A

(DN-HNF1A) resulterede i nedsat phosphoinositid-3-kinase (PI-3K) /Akt aktivitet, hvorved svækkende cellevækst og proliferation og sensibiliserende betaceller til apoptose [28], [30-32]. Denne uoverensstemmelse kan skyldes forskel i celle og patologisk proces, og vise den komplekse effekt af

HNF1A

i forskellige typer af celler og patologiske processer.

Vi belyst downstream signalveje yderligere at HNF1A øver sin tumorsuppressorfunktion i bugspytkirtelkræft og fandt, at

HNF1A

knockdown aktiveret Akt /mTOR signalvejen. Den PI3K /Akt /mTOR signalering akse spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​celleproliferation, apoptose, angiogenese og metastase, som er central for udvikling og vedligeholdelse af kræftceller. Afvigende PI3K /Akt signalering er almindelig i bugspytkirtelkræft [33], [34]. Vores data viser, at

HNF1A

-inactivation signifikant øget niveauerne af Akt Ser473 og Thr308 phosphorylering og mTOR 2248 phosphorylering. Det vides, at phosphorylering af Akt ved Thr 308 kan regulere proteinsyntese og celleproliferation henviser phosphorylering af Akt ved Ser 473 er ​​forbundet med resistens over for apoptose ved at styre subcellulær lokalisering af pro-apoptotiske proteiner [35]. Det er kendt, at mTOR, en serin-threonin-kinase, er reguleret af phosphorylering på Ser2448 som respons på PI3K /Akt onkogen signalering. mTOR regulerer cellevækst, celleproliferation, cellemotilitet, celleoverlevelse, proteinsyntese, og transkription. Derfor er det muligt, at virkningen af ​​

HNF1A

-inactivation på cellevækst og apoptose er, i det mindste delvist, via mekanismen for aktivering af AKT /mTOR signalvejen.

Kronisk pancreatitis er en kendt risikofaktor for kræft i bugspytkirtlen. Gener regulerer bugspytkirtlen regenerering kan også være involveret i udviklingen af ​​kronisk pancreatitis, og bugspytkirtlen carcinogenese. En nylig undersøgelse foretaget i en pancreatitis dyremodel har vist en skade-responsive nedreguleret udtryk for

HNF1A

i acinære celler [29], der var relateret til en øget acinar celledeling og reducerede fordøjelsesenzymer. HNF1A styrer Tilsyneladende vævsspecifikke transkriptionelle programmer, fordi det øger cellevækst i Langerhanske øer, men undertrykker celleproliferation i hepatocytter [36]. Inhiberingen af ​​celleproliferation i acinære celler og duktale epitelceller kunne være en af ​​de vigtigste mekanismer, der forbinder HNF1A i pancreas carcinogenese. En anden nylig undersøgelse har også vist, at overekspression af

HNF1A

gen i bugspytkirtelkræft cellelinjer hæmmet cellevækst, induceret G

0 /G

1 anholdelse og apoptose [37]. Disse virkninger korrelerede med HNF1A-induceret nedregulering af cellecyklus gener og nedsat ekspression af anti-apoptotiske gener [37].

Som konklusion har vi vist, at

HNF1A

ekspression er faldet betydeligt i humane pancreas adenocarcinom-tumorer. Selektiv blokering af

HNF1A

ved specifik siRNA væsentligt fremmet bugspytkirtelkræft celledeling og hæmmede apoptose in vitro. Vi har endvidere vist, at

HNF1A

knockdown aktiverer Akt /mTOR signalvejen i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Disse resultater understøtter en potentiel tumor suppressor rolle

HNF1A

i kræft i bugspytkirtlen.