PLoS ONE: April inducerer tumorigenese og Metastase af tyk- og endetarmskræft Cells via Aktivering af PI3K /Akt Pathway

Abstrakt

En proliferationsinducerende ligand (april) er stærkt udtrykt i kolorektal cancer (CRC) væv og celler linjer. Men de biologiske funktioner og præcise signaler fremkaldt af APRIL i CRC er ikke fuldt forstået. Her brugte vi små interfererende RNA til selektivt nedbryder APRIL og til at bestemme dens tumorfremkaldende virkninger i en CRC-cellelinje SW480 både

in vitro

in vivo

. Knockdown af april SW480 celler var forbundet med modulering af celledeling samt reduktion af celle migration og invasion

in vitro

. Endvidere April-Knockdown SW480 celler udviste markant inhiberede tumorvækst og faldt metastase til leveren i immundefekte mus efter subkutan injektion. Vigtigt er, observerede vi, at nedregulering af APRIL i SW480-celler resulterede i stærkt formindsket aktivitet af phosphoinositid 3-kinase (PI3K) /Akt pathway. Desuden har vi observeret, at rekombinant humant APRIL medieret aktivering af PI3K /Akt pathway i CRC-celler resulterer i induceret ekspression af vigtige cellecyklusproteiner og matrix-metalloproteinaser i et PI3K /Akt afhængig måde. Dette var samtidig med markant cellevækst levedygtighed samt øget cellemigration og invasion. Tilsammen viser disse overbevisende data tyder, at APRIL tumordannelse og metastase af CRC-celler kan opnås ved aktivering af PI3K /Akt pathway. Disse fund kan føre til en bedre forståelse af de biologiske virkninger af april og maj give et fingerpeg til at identificere nye terapeutiske og forebyggende molekylære markører for CRC

Henvisning:. Wang G, Wang F, Ding W, Wang J, Jing R, Li H, et al. (2013) APRIL inducerer tumorigenese og Metastase af tyk- og endetarmskræft Cells via Aktivering af PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 8 (1): e55298. doi: 10,1371 /journal.pone.0055298

Redaktør: Claudio M. Costa-Neto, University of São Paulo, Brasilien

Modtaget: September 19, 2012; Accepteret: December 20, 2012; Udgivet: 29 Jan 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tal 81201351 og 81201350). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er et stort problem for folkesundheden i USA og globalt. I USA er det den tredje mest almindelige kræftform, og den tredje hyppigste årsag til dødelighed af kræft, hvis mænd og kvinder behandles særskilt [1]. Forekomst af metastaser grund tumorprogression er årsag til hovedparten af ​​cancer-relaterede dødsfald. Trods store fremskridt i diagnostisk og terapeutisk metode, prognosen for CRC patienter forbliver fattige. For nylig har fremskridt inden for molekylærbiologi ført til en øget viden om mekanismerne bag CRC udvikling. Seneste storstilet sekventering og andre genomiske analyser af humane kolorektale tumorer viser, at der er op til 80 nonsilent mutationer i hver tumor, og at de enkelte tumorer har forskellige mutationer. Selvom mutationerne er mange og varierede, klassificering af almindelige og sjældne mutationer viste, at 38 veje er afbrudt med bestemt frekvens, og mange af disse veje krydser phosphoinositid 3-kinase (PI3K) signalering [2]. PI3K signalvej spiller en væsentlig rolle i cancercelleproliferation, overlevelse, metabolisme, motilitet og invasion. Det er ofte dereguleret i CRC celler, hvilket gør det til et attraktivt terapeutisk mål [2], [3], [4]. Opreguleres cytokiner, vækstfaktorer og deres receptorer iagttaget i CRC celler via PI3K repræsenterer sandsynligvis en principal bidrag til tumorigenese.

April (en proliferationsinducerende ligand, også kendt som TRDL-1, TALL-2, og TNFSF13 ), er et medlem af tumornekrosefaktor (TNF) superfamilien, med homolog struktur og funktion til adskillige andre cytokiner i denne familie. Det blev opdaget som et cytokin overudtrykt af transformerede celler og kan stimulere celleproliferation [5], [6]. APRIL udtrykkes overvejende af tumorvæv, såsom colon carcinom, pancreascancer, mavecancer, og ved normale immunceller såsom B-celler, monocytter, makrofager, dendritiske celler, neutrofiler, epitelceller, T-celler og visse ikke-immune celler såsom osteoklaster. Nylige undersøgelser har analyseret tumorfremmende rolle i april i patienter med hæmatologiske maligniteter eller med faste tumorer. Afvigende ekspression af APRIL og den efterfølgende aktivering af pro-overlevelse veje kan tillade overlevelse af flere blodkræftsygdomme [6], [7], [8], [9]. I solide tumorceller, har undersøgelserne været begrænset til spredning eller overlevelse aktivitet impliceret i den naturlige vækst af tumorer, hvilket er i overensstemmelse med den nuværende koncept, inflammatoriske reaktioner udgør en vigtig del af tumor udvikling [5], [10], [11 ]. Der er forskellige meninger om sekretionen APRIL produceret af tumorceller eller tumor-infiltrerende celler. Mhawech-Fauceglia et al [10] viste, at tumor-infiltrerende neutrofiler til stede i stomien snarere end tumorcellerne, var den største kilde til APRIL. Dette er i modsætning til en nylig undersøgelse foretaget af V Lascano et al [12], som påviste, at april efter produceret af både tumor- og ikke-tumorceller havde en klar tumorfremmende virkning i colorektal tumorigenese. Men nedstrøms signalering kaskader aktiveres af APRIL der kan være involveret i dannelse af tumorer er endnu ikke karakteriseret. Vi har for nylig bekræftet, at APRIL er overudtrykt i fordøjelsessystemet karcinomer, specifikt i tyktarmen og bugspytkirtel [13], [14], [15]. APRIL er mere stærkt udtrykt i tumorer end i normal colon, og APRIL-knockdown hæmmede migration og invasion af kolorektal cancer celler in vitro [16]. Endvidere serum APRIL niveauer målt ved ELISA i patienter med kræft i bugspytkirtlen foreslog, at april, som er en positiv diagnose og prognose værdi for pancreascancer [15]. Disse foreløbige undersøgelser viser, at APRIL kan have en vigtig rolle i carcinogenese og tumor progression.

Den foreliggende undersøgelse undersøgte rolle APRIL i kolorektal carcinogenese og karakteriseret APRIL-medieret signaltransduktion. Humane CRC cellelinjer og immundefekte mus blev anvendt til at vurdere virkningerne af knockdown af APRIL om centrale elementer i den kræftfremkaldende og metastatisk proces. Vi vurderede rolle april celleproliferation, cellecyklus, migration og invasion i CRC-cellelinjer og identificeret de relaterede molekylære og cellulære komponenter. Ved hjælp af disse CRC celler og xenograft model væv, foreslår vi, at APRIL kunne relateres til tumorgenese og metastase. Desuden har vi observeret, at APRIL stimulation medieret PI3K /Akt pathway signaler involveret i reguleringen af ​​cellecyklus og invasion af carcinomaceller.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsesprotokoller blev godkendt af Animal Care og forskning Etisk Udvalg, College of Medicine, Nantong Universitet. Alt dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer (Kontrakt 2010-0089). Alle patienter gav deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen.

Patienter og vævsprøver

CRC væv blev indsamlet fra kirurgisk resektion prøver af otte patienter, som ikke havde gennemgået strålebehandling eller kemoterapi i tilknyttede Hospital i Nantong University mellem april 2008 og maj 2009. Deres aldre lå fra 45 til 71 år, med en gennemsnitsalder på 56,9 år. Hannen: kvinde-forholdet var 5: 3. Diagnosen blev bekræftet histologisk i alle tilfælde. Vævsprøver blev straks behandlet efter kirurgisk fjernelse. Protein blev analyseret i otte snap-frosne tumorform og tilstødende nontumorous vævsprøver, der blev opbevaret ved -80 ° C.

Cell kultur og reagenser

Alle humane CRC cellelinjer (SW480, HT-29 , Colo-205, HCT-116) blev opnået fra Academy of Life Science, Shanghai, Kina og blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen, San Diego, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone , Logan, USA) og antibiotika (100 mg /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin) ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2. Humane umbilical vene endotelceller (HUVEC) blev opnået fra Fmgbio, Shanghai, Kina og blev opretholdt i DMEM /F12 (Gibco). GM6001, LY294002 blev indkøbt fra Chemicon (Temecula, CA, USA). Rapamycin blev opnået fra Sigma. Rekombinant human APRIL (rhAPRIL) blev købt fra PeproTech Inc. (USA).

enzymmaerket assay (ELISA) til påvisning af udskilte april

CRC cellelinjer blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2 i DMEM med 0,5% FBS i 72 timer. Cellekultursupernatanter blev opsamlet, og koncentrationen af ​​APRIL blev målt under anvendelse af en human APRIL ELISA-kit (R MMP-2, GATGCCGCCTTTAACTGG og TCAGCAGCCTAGCCAGTCG; MMP-9, GCACCACCACAACATCACCTAT og CACAACTCGTCATCGTCGAAA; TIMP-1, CAGAAGTCAACCAGACCACCT og ATTCCTCACAGCCAACAGTG; GAPDH, ACGCATTTGGTCGTATTGGG og TGATTTTGGAGGGATCTCGC. GAPDH blev screenet som kontrol housekeeping-genet. PCR-produkterne blev kørt på en 1,5% agarosegel, farvet med ethidiumbromid og visualiseret ved UV-belysning. Bånd blev kvantificeret ved densitometri under anvendelse ImageJ software (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Celleproliferationsassay

Cell proliferationsassays in vitro blev udført under anvendelse af et Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Donjindo, Japan) ifølge producentens instruktioner. shAPRIL SW480 celler, SW480 shNTC celler og ikke-transficerede SW480-celler blev podet i plader med 96 brønde i DMEM med 0,5% FBS ved en densitet på 4 x 10

3 celler /brønd. APRIL-stimulerede HCT-116-celler blev podet i plader med 96 brønde i DMEM, der indeholdt 0,5% FBS i nærvær af 100 ng /ml rhAPRIL, 400 ng /ml rhAPRIL, 800 ng /ml rhAPRIL eller PBS (kontrolgruppen). Celler i hver gruppe blev udpladet i tre eksemplarer. 24, 48, 72 og 96 timer, den optiske densitet ved 450 nm bølgelængde, som korrelerer til antallet af levedygtige celler blev målt, og resultaterne blev udtrykt som gennemsnit af A450 ± SEM.

Cellecyklusanalyse

cellecyklusanalyse, April-stimulerede celler blev dyrket med rhAPRIL i 24 timer, og shAPRIL celler blev høstet 48 timer efter transfektion. Celler blev derefter vasket med PBS, fikseret i 70% ethanol i en time ved 4 ° C og derefter inkuberet med 1 mg /ml RNase A i 30 min ved 37 ° C. Efterfølgende blev celler farvet med propidiumiodid (PI, 50 ug /ml) (Becton Dickinson, San Jose, CA) i PBS, 0,5% Tween-20, og analyseres med en Becton Dickinson flowcytometer BD FACScan (San Jose, CA) og Cell Quest indsamling og analyse af programmer.

Western blot-analyse

Proteinlysater blev adskilt ved 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev blokeret med TBS indeholdende 0,1% Triton X-100 og 5% fedtfri mælk inkuberet med primære antistoffer. De primære antistoffer var anti-human APRIL (BD, NJ, USA), anti-Pakt, anti-Akt, anti-mTOR, anti-p-mTOR (Cell Signaling), anti-c-myc, anti-cyclin D1, anti -CDK4, anti-p-Rb anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). HRP-konjugeret muse-immunoglobulin anvendtes som det sekundære antistof. Signal detektion blev udført med et ECL-systemet (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Bånd blev kvantificeret ved densitometri under anvendelse ImageJ software. Integrerede densitetsværdier på phosphorylerede proteiner blev normaliseret til totalt protein for hver prøve. Stimulerede eller utransficerede celler fik en værdi på 1,0, og niveauet af phosphorylering i alle andre prøver blev normaliseret til denne værdi.

Invasion og migration analyser

Tumorcelleinvasion blev målt ved at undersøge celle invasion gennem Matrigel (BD, USA) overtrukne polycarbonatfiltre (8 um porestørrelse) ved hjælp Transwell invasion kamre (Costar, VWR Albertslaund, Danmark). Kort fortalt, efter 48 timers transfektion, SW480 celler, herunder shAPRIL transficerede celler og shNTC transficerede celler blev trypsinbehandlet, og 10

5 celler suspenderet i 100 pi DMEM med 0,5% FBS blev udpladet i det øvre kammer. På April-stimulerede HCT-116 celleinvasion assay blev udført parallelle forsøg i nærvær af rhAPRIL i en koncentration på 100 ng /ml i 0,5% FBS medier i det øvre kammer. Det nedre kammer indeholdt 600 pi DMEM medium med 10% FBS. Efter inkubation ved 37 ° C i 5% CO

2 inkubator i 72 timer blev celler på den øvre overflade af filteret fjernes ved aftørring med en vatpind. Migration assays med 10

6 celler pr inkuberet i 48 timer blev udført under anvendelse af samme procedure, men med ikke-coatede polycarbonatfiltre. Hvor det er angivet, blev cellerne udpladet på indsatsene med GM6001, eller det samme volumen af ​​DMSO (Sigma). GM6001 ved en koncentration på 10 pM i 0,5% FBS medier opløst i DMSO blev tilsat til medierne til at hæmme MMP’er i celleinvasion assays. Celler bundet til den nedre overflade af membranen blev farvet med 0,1% krystalviolet og derefter talt under mikroskop. Celler blev undersøgt, talt og fotograferet ved 100 × forstørrelse under et omvendt mikroskop. Fem forskellige felter blev talt pr filter i hver gruppe og hvert eksperiment blev gentaget tre gange. Midlerne til fem individuelle felter tilfældigt udvalgte blev opnået for hver brønd.

Måling af MMP-2 og MMP-9 produktion

MMP-2 og MMP-9 aktiviteter blev bestemt ved hjælp af en kvantitativ sandwich enzymimmunassay-teknik. CRC-celler blev podet i plader med 96 brønde i en koncentration på 4 x 10

3 celler per brønd i DMEM med 0,5% FBS i tre dage. Niveauerne af udskilt MMP-2 og MMP-9 i kultursupernatanterne blev bestemt ved ELISA. Analysen blev udført ved hjælp af Quantikine MMP-2 og MMP-9 kit (R 0,05

Resultater

Angivelse af April er opreguleret i CRC væv og cellelinjer

Vi undersøgte hvorvidt APRIL ekspression blev opreguleret i væv ved at undersøge prøver fra otte CRC cancerpatienter anvendelse af Western blot analyse. APRIL ekspression på proteinniveauet var stærkt forhøjet i alle testede forhold til tilgrænsende normale væv (fig. 1A) CRC væv. Dette tyder på en mulig rolle for april i udvikling af kræft eller progression i tyktarmen. APRIL-mRNA blev påvist ved relativt højere niveauer i en række humane CRC cellelinjer sammenlignet med humane navleveneendotelceller, skønt niveauerne for APRIL afveg. APRIL blev påvist ved relativt højere niveauer i SW480 og HT-29-celler og blev intermediært udtrykt i Colo-205-celler. APRIL ekspression blev svagt påvist i HCT 116-celler (fig. 1B). De humane coloncancer-cellelinjer HCT-116 og SW480 blev valgt som et modelsystem for vores forskning. For at reducere APRIL ekspression, udviklede vi to korte hairpin RNA’er (shRNA) betegnes sh637 og sh1750 [17], som var rettet mod det humane APRIL gen (shAPRIL) og forårsagede signifikant reduktion af APRIL-ekspression sammenlignet med nontargeting kontrol transficeret (shNTC) og ikke-transficerede celler . Efter shRNA transfektion blev væsentlig knockdown af april transkriptet observeret i SW480-celler ved både mRNA (fig. 1C) og protein (Fig. 1D) niveauer. APRIL ekspression målt ved ELISA i CRC cellekultursupernatanter viste, at cellelinierne udskilte forskellige niveauer af opløselig APRIL som bekræftede, at April er et udskilt protein (fig. 1 E).

(A) Western blot-analyse af april otte par kolorektale tumorer (T) og tilgrænsende normale væv (N). # 1-8 angiver patienternes numre. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. (B) Semikvantitativ RT-PCR-analyse af APRIL-ekspression i fire humane CRC cellelinier (SW480, HT-29, Colo-205 og HCT-116). HUVEC’er blev brugt som en negativ kontrol og GAPDH var en intern kontrol. (C) SW480-celler blev transficeret med shRNA rettet mod nontargeting kontrol (shNTC) eller human APRIL gen (sh637, sh1750), og efter 48 timer, var April mRNA-niveauet bestemmes ved semikvantitativ RT-PCR. GAPDH var en intern kontrol. (D) SW480-celler blev transficeret med shNTC eller shAPRIL, og efter 48 timer blev APRIL proteinniveauer bestemt ved Western-blot. β-actin var en intern kontrol. (E) CRC cellelinjer og shAPRIL-transfekterede SW480-celler blev dyrket i 72 timer, og supernatanter blev opsamlet og vurderet for udskilt April af ELISA.

Den biologiske virkning af april om kolorektal cancer celler

for at analysere aktiviteterne i april på CRC, vi undersøgt virkningerne af aPRIL knockdown og aPRIL stimulation på celleproliferation, migration og invasion i de humane CRC cellelinjer HCT-116 og SW480. CCK-8 assay levedygtighed cellevækst blev bestemt 24, 48, 72 og 96 timer efter transfektion og APRIL stimulering. Vi observerede et signifikant fald i cellevæksten levedygtighed i sh637 transficerede SW480 celler (

P

0,05;. Figur 2A), og en signifikant øget cellevækst levedygtighed i rhAPRIL (400 ng /ml, 800 ng /ml ) stimulerede HCT-116 celler (

P

0,05;. figur 2B) sammenlignet med de respektive kontroller. At udforske rolle april CRC celle invasion og metastase, vi udførte celle migration og invasion assays, som blev anset for vigtige

in vitro

egenskaber knyttet til malignitet af celler. CRC-celler transficeret med sh637 eller stimuleret med rhAPRIL (100 ng /ml) påvirkede signifikant antal trækkende og invaderende celler bundet til den nedre overflade af membranen, sammenlignet med kontrolceller (

P

0,05; fig . 2D og E). Knockdown af APRIL resulterede i signifikant undertrykkelse af cellemigrering og celleinvasion af en rekonstitueret basalmembran (Matrigel), mens rhAPRIL (100 ng /ml) behandling dramatisk forøget CRC cellemigration og invasion. Vores MTT-assays viste, at behandling med 100 ng /ml rhAPRIL ikke mærkbart øge spredningen af ​​HCT-116-celler (fig. 2C), hvilket antyder, at APRIL induceret cellemigration ikke var forbundet med øget celleproliferation. Spredning og invasion assays blev ligeledes udført i sh1750 transficerede SW480-celler, og resultaterne var i overensstemmelse med sh637 transficerede celler (data ikke vist). Taget sammen viser disse resultater antyder kraftigt, at APRIL spiller en vigtig rolle i tumorgenese og metastase af CRC-celler.

(A) shAPRIL transfektion signifikant reduceret cellelevedygtighed analyseret ved CCK-8 i SW480-celler i forhold til den transficerede og shNTC transficerede kontroller. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SEM; *

P

0,05 sammenlignet med shNTC. (B) rhAPRIL (400 ng /ml eller 800 ng /ml) stimulation signifikant forøget cellelevedygtighed i HCT-116-celler sammenlignet med ikke-stimulerede celler; *

P

0,05. (C) Behandling med 100 ng /ml rhAPRIL ikke øge udbredelsen af ​​HCT-116 celler. (D og E) Cellemotilitet gennem ikke-coatede filtre (migration) og gennem Matrigelcoatede filtre (invasion) i shAPRIL-transficerede SW480-celler, rhAPRIL-stimuleret HCT-116-celler og deres respektive kontroller. Celler blev farvet med krystalviolet, visualiseret med mikroskopi og talt. (D) Antallet af celler, som havde invaderet blev talt i fem repræsentative lav effekt (× 100) felter (LPFs) pr Transwell indsætte. Alle bestemmelser blev udført mindst tre gange i tre uafhængige forsøg. Numre repræsenterer middelværdier ± SEM. *

P

0,05 versus kontroller. (E) Repræsentant eksempel på D. Scale bar, 40 um.

April-knockdown hæmmer tumorvækst og metastase af SW480 celler in vivo

som i april påvirkede tumorcellevækst og invasion

in vitro

, vi næste undersøgt, om APRIL påvirket adfærd tumorer

in vivo

i nøgne mus BALB /c, som er immundefekte og modtagelige for tumordannelse og metastase. Mus blev injiceret subkutant i højre flanke med ikke transficeret SW480, shAPRIL (sh637) transficeret SW480 eller shNTC transficerede SW480 celler. Tumorvækst blev reduceret betydeligt i mus injiceret med April-knockdown (shAPRIL) SW480 celler (

P

0,05) sammenlignet med mus injiceret med siRNA-kontrol (shNTC) og ikke-transficeret (kontrol) celler (Fig. 3A, B og C). Total antal metastatiske leverknuder ( 0,5 mm) i individuelle mus blev talt under et kirurgisk teleskop. Samlede antal metastatiske knuder er vist i tabel 1. Metastatisk leverknuder blev bekræftet histologisk og repræsentative hematoxylin og eosin farvede billeder er vist i fig. 3D. Ingen lungemetastaser blev fundet i nogen af ​​de tre grupper. Sammenlignet med transficerede og shNTC transficerede SW480-celler, APRIL-knockdown SW480-celler viste reduceret metastase til leveren i nøgne mus (tabel 1, fig. 3D). Lever metastatiske knuder blev observeret i transficerede SW480 (n = 89) og shNTC SW480 (n = 78), mens tre knuder blev fundet i APRIL-knockdown SW480 gruppe (

P

0,05) ( tabel 1). Selvom shNTC gruppe dannet færre metastatiske knuder end transficerede gruppe, dette ikke var statistisk signifikant (

P

0,05). Disse resultater tyder på, at APRIL spiller en central rolle i den kræftfremkaldende og metastatisk proces med SW480 celler

in vivo

.

(A) Nøgne mus blev subkutant injiceret i højre flanke med kontrol celler, shNTC transficerede celler og shAPRIL (sh637) transficerede celler. (B) En prøve tumor fra hver gruppe er vist. (C) tendens af tumorvækst efter injektion i nøgne mus i forskellige grupper. Tumorvolumen blev målt ved skydelære i cm

3. (D) Total antal metastatiske leverknuder ( 0,5 mm) i individuelle mus blev talt under et kirurgisk teleskop. Repræsentative hematoxylin og eosin-farvning af 4-um sektioner af levere fra shAPRIL og shNTC grupper er vist. Pilen angiver tumorknuder. Scale bar, 100 pm. (E) Western blot og immunhistokemi af APRIL i tumorer i nøgne mus fra hver gruppe. (F) Immunohistokemisk analyse af p-Akt, p-mTOR, Ki-67, cyclin D1, CDK4, p-Rb, MMP-2 og MMP-9 i tumorer fra nøgne mus injiceret med shNTC eller shAPRIL SW480-celler. Scale bar, 40 um.

APRIL stimulerer PI3K /Akt pathway i CRC celler

PI3K /Akt pathway er blevet rapporteret til at spille en afgørende rolle i celledeling , migration og invasion af forskellige cancertyper. Endvidere TNF superfamiliemedlemmerne april og B-celle-aktiverende faktor (BAFF), ved indgreb med deres receptorer, er for nylig blevet vist at aktivere PI3K /Akt pathway i maligne B-celler [18], [19]. Således har vi fastslået, om den PI3K /Akt pathway var involveret i April-medierede cellulære respons i solide tumorceller. Akt er et substrat for P 3K, og den mammalian target of rapamycin (mTOR) er en større nedstrøms effektor af Akt. Vi evaluerede effekten af ​​APRIL-knockdown på PI3K /Akt pathway i SW480 celler ved at måle fosforylering profil Akt og mTOR. April-knockdown reducerede phosphorylering af Akt og mTOR i SW480-celler ved Western blot (fig. 4A). Vi undersøgte også, om APRIL påvirket Akt og mTOR fosforylering

in vivo

. I mus tumorvæv med APRIL banke ned, faldt p-Akt og p-mTOR proteinindhold blev observeret ved immunhistokemi (fig. 3F, øverste panel). Derefter undersøgte vi virkningen af ​​April stimulation på PI3K /Akt pathway i HCT-116-celler. Stigende koncentrationer af rhAPRIL i HCT-116-celler stimuleret phosphorylering af Akt og mTOR, detekteret 3 timer efter april stimulering på en dosis-afhængig måde (Fig. 4B). Efterfølgende forbehandling med LY294002, en syntetisk inhibitor af p110 katalytiske subunit af PI3K, blev brugt til at undersøge den mulige inddragelse af PI3K i APRIL-medieret Akt og mTOR fosforylering i CRC celler. Forbehandling af HCT-116 celler med LY294002 signifikant hæmmet APRIL-induceret Akt og mTOR aktivitet, hvilket tyder på, at Akt og mTOR fosforylering reaktion på APRIL var PI3K afhængig (fig. 4C).

(A) SW480 celler blev transficeret med shAPRIL (sh637) og shNTC i 48 timer og analyseret for Akt og m-TOR phosphorylering ved western blot. (B) HCT-116-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af rhAPRIL i tre timer og blev analyseret for ekspression af phosphorylering af Akt og mTOR. (C) HCT-116-celler blev behandlet med de angivne doser af LY294002 i 24 timer og derefter stimuleret med rhAPRIL (400 ng /ml) i tre timer, og analyseret for Akt og mTOR phosphorylering. Phosphoryleringen af ​​Akt og mTOR blev bestemt ved SDS-PAGE og western blotting. Densitometriske værdier er angivet nedenfor hvert blot.

April medieret celleproliferation af CRC celler ved at inducere Akt og mTOR aktivering gennem PI3K /Akt pathway

Da spredningen af ​​kræftceller er reguleret af cellecyklussen, vi næste afgøres, hvilken fase af cellecyklussen blev ændret i april-knockdown celler ved flowcytometri med PI-farvning. Som vist i fig. 5A, blev April-Knockdown SW480-celler standset i G1-fasen 48 timer efter transfektion og procentdelen af ​​G0 /Gl-fase celler væsentligt forøget, hvilket antyder, at April-knockdown forhindret indtastning af celler fra G1 til S-fasen af ​​cellens cyklus. For yderligere at forstå, hvordan April-knockdown forhindrede indtrængen af ​​celler S-fasen, vi undersøgte effekten af ​​shAPRIL transfektion på ekspressionen af ​​c-myc, cyklin D1, CDK4 (kritiske regulatorer af G1 /S overgang) og p-Rb. Vi observerede en reduktion af c-myc, cyklin D1, CDK4 og p-Rb ved knockdown af APRIL (fig. 5C), der foreslog, at disse faktorer kan være involveret i APRIL regulering af celledeling. I mus tumorer med banke ned april, vi observeret nedsat APRIL proteinindhold ved immunhistokemi og Western blot (fig. 3E) og fald i celleproliferation (cyclin D1, CDK4, p-Rb og Ki-67) (fig. 3F, lavere panel), hvilket antyder, at en reduceret tumorvækst observeres inden april knockdown kunne være resultatet aPRIL regulering af celleproliferation. Fordi PI3K /Akt aktivering i G1 fasen er nødvendig for c-myc stabilisering og S-fasen indtastning af celler [20], bestemte vi, om April-medieret regulering af celle-regulerende proteiner var PI3K og Akt afhængige. Vi bekræftede rhAPRIL kunne inducere cellecyklusprogression ved væsentligt at øge andelen af ​​celler i S, G2M fase og ekspressionen af ​​c-myc, cyclin D1, CDK4, p-Rb-proteiner i sammenligning med ubehandlede celler (fig. 5B og D) . Samtidig undersøgte vi virkningen af ​​PI3K /Akt-inhibering på APRIL-induceret cellecyklusprogression af SW480-celler, der blev forbehandlet med PI3K-inhibitoren, LY294002, før APRIL stimulering. Vi fandt, at aktivering af p-Akt og p-mTOR af APRIL blev fuldstændigt blokeret af PI3K-inhibitoren LY294002, ledsaget af signifikant inhibering af c-myc, cyklin D1, CDK4 og p-Rb ekspression (fig. 5E). Dette antyder, at April-induceret Akt og mTOR aktivitet er direkte reguleret gennem PI3K /Akt vej. Fig. Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig.