PLoS ONE: Tumor endotel Inflammation forudser Klinisk Outcome i menneskets forskellige Cancers

Abstrakt

Baggrund

Vaskulære endotelceller bidrager til patogenesen af ​​talrige humane sygdomme ved aktivt at regulere stromale inflammatoriske respons; imidlertid ringe viden om den rolle, endotel inflammation i væksten af ​​humane tumorer og dens indflydelse på prognosen af ​​humane cancere.

Metoder

Brug en eksperimentel model af tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) -medieret inflammation, kendetegnet vi inflammatorisk genekspression i immunorenset tumorassocierede endotelceller. Disse gener dannede grundlag for en multivariat molekylær indikator for den samlede overlevelse, som blev uddannet og valideret i fire typer af human cancer.

Resultater

Vi rapporterer, at ekspressionen af ​​eksperimentelt afledt tumor endotel gener adskiller patologiske vævsprøver fra normale kontroller i flere humane sygdomme associeret med kronisk inflammation. Vi trænede disse gener i humane cancer datasæt og defineret en seks-gen inflammatorisk signatur, forudsagt væsentligt reduceret samlet overlevelse i brystkræft, tyktarmskræft, lungekræft, og gliom. Dette endotel-afledt signatur forventede resultat uafhængigt af, men kooperativt med, standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer. I overensstemmelse med disse resultater, konditionerede kulturmedier fra humane endotelceller stimuleret af pro-inflammatoriske cytokiner accelereret vækst af human colon og brysttumorer i immundefekte mus sammenlignet med konditioneret medie fra ubehandlede endotelceller.

Konklusioner

Denne undersøgelse giver den første prognostiske cancer gen signatur afledt af en eksperimentel model for tumorassocieret endotel inflammation. Disse resultater støtter den opfattelse, at aktiveringen af ​​inflammatoriske pathways i ikke-maligne tumor-infiltrerende endotelceller bidrager til tumorvækst og progression i flere humane cancere. Vigtigt er det, disse resultater identificerer endotel-afledte faktorer, der kan tjene som potentielle mål for terapi i menneskets forskellige kræftformer

Henvisning:. Pitroda SP, Zhou T, Sweis RF, Filippo M, Labay E, Beckett MA, et al . (2012) Tumor endotel Inflammation forudser Klinisk Outcome i menneskets forskellige kræftformer. PLoS ONE 7 (10): e46104. doi: 10,1371 /journal.pone.0046104

Redaktør: Sharon A. Glynn, National University of Ireland Galway, Irland

Modtaget: 14. marts 2012; Accepteret: August 28, 2012; Udgivet: 4 oktober 2012

Copyright: © Pitroda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet af midler fra Virginia og DK Ludwig Fund for Cancer Research (RRW), Lung Cancer Research Foundation (RRW), Chicago Tumor Institute (RRW), og Brain Tumor Program Project (PA1 CA 07.193.312) (RRW), i tillæg til , United States National Institutes of Health giver HL58064 (JGNG), HL98050 (JGNG), og HL105371 (JGNG) og en generøs gave fra Foglia familien (RRW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i det seneste årti, vores forståelse af tumor biologi har udvidet til at omfatte værten stromale elementer som vigtige determinanter i malign transformation og progression [1]. Behandlinger rettet mod stromaceller har til dels skyldtes den molekylære karakterisering af tumor-stromale interaktioner. Der er betydelig dokumentation for, at stromale betændelse bidrager til spredning og overlevelse af maligne celler, letter genomisk ustabilitet, stimulerer angiogenese og metastase, og ændrer reaktion på anti-cancer behandlinger [2], [3]. Når kronisk produceret i tumormikromiljøet, TNF-α er et stort mediator af stromal inflammation [3]. TNF-α er vigtig i tidlige hændelser i tumorigenese, kontrollerer en kaskade af cytokiner, kemokiner, adhæsionsmolekyler og pro-angiogene aktiviteter [2], [3]. De mest velkarakteriserede handlinger malign celle-afledt TNF-α er på vaskulære endotelceller. Vaskulære endotelceller deltaget aktivt i og regulere den inflammatoriske reaktion i både normale og syge væv [4], og nye data antyder, at endotelceller direkte indflydelse tumor adfærd [5] – [7]. Alligevel lidt er kendt om den rolle, endotel inflammation i at fremme tumorvækst og dens indflydelse på prognosen af ​​humane cancere.

genekspressionsprofilering af kliniske tumorer har ført til opdagelsen af ​​talrige molekylære signaturer. En begrænsning ved nuværende genekspressionsprofilering undersøgelser er en mangel på validering i uafhængige kliniske datasæt [8], [9]. Vigtigere er det, mange empirisk afledte kliniske signaturer er specifikke for en enkelt kræft type og ofte ikke giver indsigt i relevante biologiske veje, der påvirker kræft prognose. Vi udnyttet en eksperimentel model af TNF-α-medieret inflammation at karakterisere inflammatorisk genekspression i tumorassocierede endotelceller. I denne undersøgelse viser vi, at induktionen af ​​inflammatorisk genekspression i tumorassocierede endotelceller signifikant accelererer væksten af ​​humane tumorer. Især vi udlede den første kræft gen signatur associeret med endotel betændelse, der forudsiger kliniske resultat i fire typer af humane kræftformer uafhængigt af standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer. Vores resultater giver en ny biologisk afledt metode for kræft prognosticering og foreslå potentielle veje til udvikling af anti-cancer behandlinger rettet mod tumor stroma.

Metoder

De bruges til kultur cellelinjer metoder og etablere tumorer i mus er beskrevet i detaljer i tillægget S1, som er tilgængelig med den fulde ordlyd af denne artikel på www.plosone.org. Tumorassocierede endotelceller blev isoleret ved anvendelse af en trinvis immunrensning af tumorvæv (tillæg S1 for detaljer). I korte træk blev dette udført ved clearance af hæmatopoietiske celler fra homogeniseret tumorvæv ved inkubation med biotin-mærket anti-CD19, anti-CD45 og anti-F4 /80, som var blevet adskilt på forhånd bundet til streptavidin-koblede Dynabeads (Dynal; Lake Success, NY), efterfulgt af fjernelse af vulsten-bundne celler med en Dynal-50 magnet. Fc-Block (anti-CD16 /32-antistoffer) blev tilsat til cellesuspensionen for at forhindre ikke-specifik binding af Fc-receptor indeholdende celler i den positive selektion. Efterfølgende anti-VE cadherin og anti-CD105-antistoffer blev tilsat for at binde endotelceller, som blev efterfulgt af tilsætning af streptavidin-koblede Dynabeads og fange med Dynal-50 magnet indtil kun perle-bundne celler forblev i opløsning. De anvendes til RNA-ekstraktion, microarray dataindsamling og -analyse, og kvantitativ real-time polymerasekædereaktion fremgangsmåder er også beskrevet i tillægget S1. Microarray data er tilgængelige på Gene Expression Omnibus (GEO) [tiltrædelse nummer: GSE33253] (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=dfyldgammaawwjw acc=GSE33253).

Patient Sample data

Patientinformation, herunder både kliniske data og genekspression data blev indhentet fra flere uafhængige kilder. Genekspression datasæt repræsenterer inflammatorisk tarmsygdom (GSE13367), leddegigt (GSE12021), og skrumpelever (GSE14323) blev hentet fra GEO. Disse datasæt blev valgt baseret på tilgængeligheden af ​​både syge og normale vævsprøver, samt at have et stort antal prøver til rådighed på tidspunktet for analysen. Genekspression datasæt, der repræsenterer menneskelig brystkræft, tyktarmskræft, lungekræft, og gliom blev hentet fra offentligt tilgængelige arkiver. Disse datasæt blev valgt på grundlag af det store antal prøver, tilgængeligheden af ​​kliniske outcome data, og mangfoldigheden af ​​tumortyper. For hver tumortype, blev uddannelse og validering kohorter konstrueret. I brystkræft [10] (n = 295; Holland Cancer Institute, https://bioinformatics.nki.nl/data.php) og tyktarmskræft [11] (n = 232; Vanderbilt Medical Center (VMC, Nashville, TN) og H. Lee Moffitt Cancer center (MCC, Tampa, FL); GSE17538 [177 fra MCC, 55 fra VMC]) blev tumor prøver tilfældigt opdelt i to dele (2/3 til træning og 1/3 til validering) ved hjælp af computergenererede tilfældige tal til at tildele prøver til uddannelse eller validering kohorter. For gliom, adskilte datasæt [12], [13] blev anvendt til uddannelse (n = 77; University of California i San Francisco og MD Anderson Cancer Center, GSE4271) og validering (n = 50; canadisk Brain Tumor Tissue Bank (London, Ontario, Canada), Massachusetts General Hospital (Boston, MA), Brigham og kvinders Hospital (Boston, MA), og Charite ‘Hospital (Berlin, Tyskland)); https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi). Endelig for lungekræft [14], fire datasæt (n = 441), blev tilgængelige fra en enkelt undersøgelse og opdelt i uddannelse (n = 257) og validering kohorter (n = 184) som blev beskrevet i den oprindelige udgivelse. Disse datasæt blev opnået fra University of Michigan Cancer Center, Moffitt Cancer Center, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center og Dana-Farber Cancer Institute (findes på https://caarraydb.nci.nih.gov/caarray/publicExperimentDetailAction.do? expId1 /41015945236141280. Kliniske karakteristika for de patienter, der anvendes til uddannelse og validering er anført i tabel S1.

Statistisk analyse

Affymetrix NetAffx Analyse center blev anvendt til at identificere probe sæt svarer til menneskelige ortologer af eksperimentelt afledte murine gener. Ingen specifikke data forbehandling blev udført før betydning Analyse af microarrays (SAM) [15] blev anvendt til at sammenligne ekspression af de humane ortologer i syge og normale vævsprøver. Differentiel ekspression blev defineret som en falsk opdagelse sats (FDR) -adjusted p-værdi mindre end 0,05 og fold-skifte over 1,5. Gener udtrykkes differentielt i mindst to af de tre testede datasæt blev defineret som gensidigt dysreguleret. Hierarkisk klyngedannelse via Wards sammenkædning regel med euklidiske afstand metrisk hjælp JMP 7,1 (SAS Institute Inc .; Cary, NC) blev anvendt til at visualisere genekspression forskelle.

I hvert cancer træning datasæt blev univariate Cox proportional hazard regression anvendes at evaluere associationen mellem overlevelse og niveauet af ekspression af gener afledt i den eksperimentelle microarray analyse, der blev differentielt udtrykt i datasæt af humane sygdomme associeret med kronisk inflammation. Seks af disse niogfyrre gener havde overensstemmende regressionskoefficienter på tværs af alle fire tumortyper. Ekspression af hvert enkelt gen var forbundet med en øget risiko for død. For disse seks gener, blev en lineær kombination af genekspressionen værdier vægtes med de regressionskoefficienter anvendes til at beregne en risiko score for hver patient. Modellerne og deres tilknyttede skalering koefficienter fastsat, baseret på uddannelsesmæssige grupper, og derefter evalueret i validerings- grupper (tabel S2). Lade e

ki betegne ekspressionsniveauet af gen i for patienten k, og lade w

i betegne vægten til gen-I, det gen score for patient k er s

k = Σw

i ( e

ki-μ

i) /τ

i, hvor μ

jeg og τ

jeg er gennemsnittet og standardafvigelsen af ​​genekspression værdier for gen i tværs af alle prøver i validering datasæt. Patienterne blev klassificeret som havende en høj-risiko-gen signatur eller et gen signatur lav risiko, med medianen af ​​partituret risiko som tærskelværdien. En høj score indikerer en dårligt resultat. For hver univariate Cox analyse blev kliniske og patologiske faktorer forbundet med dårlig samlet overlevelse identificeret blandt de tilgængelige faktorer, der er fastsat i datasættet. Faktorer signifikante på univariat analyse blev indgået multivariat Cox-analyse. Samlet overlevelse blev analyseret og sammenlignet ved Kaplan-Meier-metoden. Forskelle i overlevelse blev testet for statistisk signifikans ved log-rank test. P-værdier på mindre end 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans. To-tailed P-værdier blev beregnet for uddannelse datasæt, mens ensidet P-værdier blev beregnet til test datasæt. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af JMP 7.1.

Resultater

Karakterisering af inflammatorisk genekspression i tumor-associerede endotel

For at undersøge, hvilken rolle af TNF-α-medieret stromale inflammation i tumorvækst, vi anvendte en syngen tumormodel af B16-F1 murine melanom etableret i vildtype (WT) mus og mus med immun dysfunktion som følge af kimcellelinje deletioner af begge TNF-α-receptorer (TNFR 1, 2 – /- , heri benævnt knockout [KO]). Afbrydelse af stromal TNF-α signalering væsentligt forringet vækst af tumorer i KO-mus sammenlignet med den i WT-mus (relative volumen (V /V

0) [middelværdi ± SEM] KO: 9,0 ± 0,9; WT: 21 ± 2,5; p = 0,0033;. figur 1A), hvilket understøtter en rolle for stromal TNF-α-signalering i tumorvækst. I tilknytning til disse data, fandt vi en forøget ekspression af den pro-inflammatoriske enzym, COX2, i tumorinfiltrerende fartøjer fra WT mus sammenlignet med KO-mus som målt ved procentdelen af ​​COX2-positive vaskulære endotelceller (WT: 65 ± 4,9%; KO: 9,3 ± 5,1%; p = 0,0014; fig 1B og C).. I en gengivelse eksperiment, vi oprenset endotelceller fra udskårne WT og KO tumorer af tilsvarende volumen og udført genekspression profilering af isolerede tumorassocierede endotelceller (TAEC’er). Vi identificerede differentieret udtryk af 993 probe sæt svarende til 808 gener. WT TAEC’er udstillet forøget ekspression af 686 probe sæt og nedsat udtryk for 307 sonde sætter i forhold til KO TAEC’er (tabel S3). Disse gener koder enzymer (104), transkriptionelle regulatorer (66), kinaser (35), transportører (20) og kemokiner /cytokiner (7). Vi udnyttede Ingenuity Pathway Analysis (IPA) til at klassificere de differentielt udtrykte gener og identificeret “inflammatorisk respons” som den mest markant beriget sæt funktioner overudtrykt i WT TAEC’er. Som målt ved Fishers eksakte test, forekomsten af ​​gener involveret i inflammatoriske responsfunktioner var stærkt signifikant med p-værdier i området fra 2,4 x 10

-11 til 7,4 × 10

-3. IPA-analyse viste en signifikant binding af dette gen indstillet til kendte TNF-a-relaterede inflammatoriske pathways medieret af NF-KB og interferoner (p = 10

-38;. Figur 1D). Disse resultater viste, at stromal TNF-α signalering bidrager til accelereret tumorvækst og inflammatorisk genekspression i tumorassocieret endotel

(A) B16-F1 melanom tumorvækst blev markant undertrykt i TNFR 1, 2 -. /- mus (KO) med afbrudt stromal TNF-α-signalering sammenlignet med den i vildtypemus (WT). Tumorvolumen blev målt i forhold til dag 0 volumen, som var lig i WT og KO-mus (p = 0,19; 2-halede t-test). Dag 7, p = 0,002. Data er gennemsnit ± SEM. (B) Tumor-associerede endotelceller (TAEC’er) i KO-mus har reduceret ekspression af pro-inflammatoriske enzym COX2. Repræsentative billeder af immunhistokemi for COX2 udført på B16-F1 tumorer (dag 7) og (C) kvantificering af COX2-positive TAEC’er. Scale bar, 20 pm. Data er gennemsnit ± SEM. P = 0,0014 (2-tailed t-test). (D) WT TAEC’er overudtrykke en særdeles signifikant “inflammatorisk respons” gen netværk (p = 10

-38; Fishers eksakte test). Fuldt optrukne linier repræsenterer direkte forbindelser, mens punkterede linier repræsenterer indirekte relationer. Rød farve indikerer overekspression i WT TAEC’er. (E) Stimulering af humane umbilical vene endotelceller (HUVEC’er) med en kombination af de pro-inflammatoriske cytokiner TNF-α, IFNp og IFNy inducerede ekspression af begge eksperimentelt afledte endotelceller inflammatoriske gener (sorte søjler), såvel som, kendte markører for endothelial inflammation (hvide søjler). Totalt RNA blev analyseret ved kvantitativ RT-PCR. Dataene er gennemsnitlig fold-ændring ± SEM i forhold til kontrol-behandlede HUVEC’er. P 0,01 tværs gener (2-tailed t-test). (F) Konditioneret dyrkningsmedier fra behandlet HUVEC’er accelereret vækst af humane colontumorer xenotransplanterede i athymiske mus. Pre-behandlede indikerer forudgående inkubering af tumorceller med konditioneret dyrkningsmedium fra stimulerede HUVEC’er, mens kontrol indikerer inkubering med konditioneret medium fra mock-behandlede HUVEC’er. Tumorvolumen blev målt i forhold til dag 0 volumen (8 dage efter injektion). Data er gennemsnit ± SEM. Dag 18, p = 0,0009 (2-halet t-test).

Vi direkte vurderet endotel genekspression som respons på proinflammatoriske signaler ved at stimulere dyrkede humane navleveneendotelceller (HUVEC’er) med en kombination af TNF-α og interferoner (IFN) β og γ. Som bestemt ved kvantitativ RT-PCR, udtryk for

VCAM1

(vaskulær celleadhæsionsmolekyle 1),

ICAM1

(inter-cellulære adhæsionsmolekyle 1), og

SELE

( E-selectin), som er markører for aktiveret endotel [4], blev induceret 1.8- til 2,6 gange henholdsvis (fig. 1E). I samråd med disse resultater, inflammatoriske markørgener overudtrykt i WT TAEC’er, herunder

STAT1

(signal transducer og aktivator af transkription 1),

TAP1

(transporter, ATP-bindende kassette, hovedhistokompatibilitetskompleks 1),

IRF7

(interferon regulatorisk faktor 7),

IFI44

(interferon-induceret protein 44), og

CXCL10

(chemokin, CXC motiv, ligand 10), blev overudtrykt 1.9- til 17,4 gange efter behandling (fig. 1E). Vi yderligere testet den hypotese, at aktiverede endotelceller øger væksten af ​​humane tumorer ved at inkubere dyrkede tumorceller med konditioneret dyrkningsmedium fra enten TNF-α /IFN-behandlede eller kontrol-behandlede HUVEC’er. Konditionerede medier fra TNF-α /IFN-behandlede HUVEC’er steget markant væksten af ​​humane colon tumorxenoplantater i atymiske mus 2,3 gange i forhold til konditioneret medie fra kontrol-behandlede HUVEC’er (p = 0,0009;. Figur 1F). I humane brysttumorer, observerede vi en lignende 3,0-fold stigning i tumorvækst (p = 0,02) (data ikke vist). Disse resultater viste, at endotel genekspression som respons på proinflammatoriske signaler er associeret med forøget human tumorvækst.

Ekspression af tumorendotelceller-afledte inflammatoriske gener i humane sygdomme associeret med kronisk inflammation

endothelial inflammation er involveret i patogenesen af ​​mange humane sygdomme [16] – [18]. For at bestemme om eksperimentelt afledte inflammatoriske gener var relevante for humane sygdomme, målt vi ekspressionen af ​​554 forskellige humane ortologer af tumor endotelafledt gener i datasæt af humane sygdomme associeret med kronisk inflammation. Disse gener betydeligt fremtrædende patologiske vævsprøver af cirrose (153 gener), inflammatorisk tarmsygdom (140 gener), og rheumatoid arthritis (106 gener) fra normale væv kontroller (fig 2A-C;. Tabel S4). Især følsomheder og særlige for disse gen-sæt varierede fra 88 til 100% og 90-100% (tabel S5). En niogfyrre-genet delmængde blev gensidigt dysreguleret i de testede og overensstemmende i ekspression med den eksperimentelle model (fig. 2D) datasæt. Som forventet blev disse gener betydeligt beriget af involverede veje i “inflammatoriske respons” (p-værdi: 1,4 × 10

-12-1.7 × 10

-2), herunder antigen præsentation, interferon signalering, TNFR 1 og 2 signalering, og NF-KB-signalering (fig. 2E). Disse resultater viste, at en inflammatorisk genekspression profil overudtrykt i WT TAEC’er differentielt udtrykkes i flere humane inflammatoriske sygdomme.

ekspressionel klyngedannelse af humane ortologer af tumor endotelafledt gener i patientens vævsprøver af (A) cirrose ( 153 gener), (B) inflammatorisk tarmsygdom (IBD) (140 gener), og (C) reumatoid arthritis (RA) (106 gener) sammenlignet med normale kontroller væv. Inden for klyngen diagram, hver kolonne repræsenterer en patientprøve og hver række repræsenterer et differentielt udtrykt gen. Sygdomsramte prøver er angivet med sorte luger. Expression er afbildet som middelværdi-normaliseret, log2-transformerede værdier. (D) Niogfyrre gener blev gensidigt dysreguleret i de testede og overensstemmende i ekspression med den eksperimentelle model datasæt. (E) Pathway analyse af 49-genet sæt demonstrerer betydelig overrepræsentation af flere inflammationsrelaterede veje. P-værdier blev beregnet under anvendelse af Fishers eksakte test. Rød linje angiver p = 0,05.

Udvikling af en prognostisk molekylær klassifikatør

Vi næste hypotese, at endotel-afledt inflammatoriske genekspression er prædiktiv for tumor resultat i kræftpatienter. Vi brugte Cox proportional hazard regression over niogfyrre-gen sæt til at identificere seks gener forbundet med nedsat samlet overlevelse i hver af fire uddannelse datasæt repræsenterer lungekræft (n = 257), brystkræft (n = 197), tyktarmskræft (n = 154), og gliom (n = 77). Vi har udpeget denne seks-gen indstillet som Inflammation-relaterede Endotel-afledte Gene (IREG) underskrift, som omfatter generne

IFI44

,

TAP1

,

SPP1

(udskilt phosphoprotein 1, også kendt som osteopontin),

ANXA3

(annexin A3),

RGS2

(regulator af G-protein signalering 2), og

PDK1

(pyruvat dehydrogenase kinase, isoenzym 1). Vi bygget en seks-gen IREG score, der kombineret genekspression med risiko for død i uddannelse datasæt (fig. S1). IREG + patienter blev defineret som dem, der har en seks-gen score større end eller lig med gruppen median score. I uafhængige patientkohorter, testede vi evnen af ​​seks-gen-score til at klassificere patienter til prognostiske grupper baseret på genekspression. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse sammenligne patientgrupper viste en signifikant reduceret samlet overlevelse for IREG + patienter i selvstændige kohorter af brystkræft (n = 98; p = 0,0008), tyktarmskræft (n = 78; p = 0,0013), gliom (n = 50 ; p = 0,017), og lungecancer (n = 184;. p = 0,026) (fig 3A-D). Denne forening mellem IREG status og overlevelse blev bekræftet ved univariate Cox proportional hazard analyse af den samlede overlevelse. IREG + patienter havde en øget risiko for død af 2,72-fold i colon cancer (p = 0,0027), 3,21-fold i brystcancer (p = 0,0015), 1,66-fold i lungecancer (p = 0,052), og 2,12 gange hos gliom (p = 0,034) (tabel 1). Især på tværs af cancertyper IREG + status var signifikant forbundet med større primære tumorer i højere histologisk bedømmelse (tabel 2). Endvidere i hver tumor testet datasæt, fandt vi en signifikant positiv sammenhæng mellem

VCAM1

genekspression og IREG score (fig. 3E-H). Disse resultater samlet angivet, at IREG signatur er prædiktiv for samlet overlevelse i flere humane cancere. Desuden

VCAM1

, en markør for cytokin-aktiveret endotel, co-udtrykkes med IREG signatur.

IREG ekspression er associeret med dårlig prognose i (A) brystcancer (n = 98 ), (B) coloncancer (n = 78), (C) gliom (n = 50), og (D) lungecancer (n = 184). Kaplan-Meier overlevelse kurverne for patientgrupper identificeret af IREG score. P-værdier angiver signifikante forskelle i samlet overlevelse som målt ved log-rank test. Rød = IREG +, blå = IREG-. (E-H) Ekspression af seks-gen IREG score var positivt korreleret med VCAM1 genekspression i hver tumortype. Vist er Pearson korrelationskoefficient. Vejviser

Multivariat analyse med standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer

I multivariate analyser ved hjælp kovarianter rådighed for hver datasæt, IREG + status forblev en signifikante variabel i brystcancer, lungecancer og coloncancer i forhold til standard kliniske og patologiske faktorer forbundet med dårlig prognose (tabel S6, S7, S8 og S9). I disse kræftformer, der ikke var væsentlige multivariate interaktioner mellem IREG + status og de andre kovariater. Disse resultater viste, at den prognostiske virkning af IREG score ikke var afhængig af specifikke værdier af de respektive kovariater. I brystkræft med dårlig prognose (alder 40 eller tumorstørrelse ≥T2), vi udvidet denne analyse ved yderligere lagdeling patienter ved hjælp af IREG score (Fig S2.). Vi bestemt, at for hver respektive faktor forbundet med dårlig prognose, havde IREG + patienter en 2.4- til 2,8 gange signifikant forhøjet risiko for død sammenlignet med IREG- patienter. En lignende analyse af lungecancerpatienter med dårlig prognose (alder ≥65 eller lymfekirtelinvolvering) viste en signifikant 1,4 til 2,0 gange større risiko for død i IREG + patienter (Fig. S3). For patienter med stadium 3 eller 4 coloncancer, IREG + patienter havde en 1,9 gange så stor risiko for død sammenlignet med IREG- patienter (fig. S4). Endelig for gliom patienter har større risiko (alder 55), IREG + patienter havde en signifikant øget risiko for død på 2,4 gange henholdsvis (fig S5, tabel S10.). Taget sammen med de tidligere data, disse resultater bekræftede, at IREG + status øger identifikationen af ​​kræftpatienter har større risiko for død.

Diskussion

Disse resultater tyder på, at endotel inflammation er en mediator af tumorvækst og progression. Til støtte for denne hypotese, vi viser, at afbrydelse af stromale TNF-α-signalering undertrykker inflammatoriske genekspression i tumorassocierede endotelceller og i væsentlig grad hæmmer tumorvækst. Vi viser desuden, at konditionerede kulturmedier fra humane endotelceller aktiveres af proinflammatoriske cytokiner accelererer væksten af ​​humane tumorer i immunsvækkede mus. Endelig har vi udlede en molekylær signatur afspejler tumor endotel inflammatoriske genekspression, der er yderst prædiktive af dårlig klinisk resultat i fire typer af human cancer. Overensstemmende med vores eksperimentelle model, patienter med tumorer, der udtrykte disse inflammatoriske gener havde signifikant større primære tumorer i højere histologisk bedømmelse.

Molekylære signaturer opdaget via genekspression profilering er blevet vist at tilføje prognostisk værdi til kliniske og patologiske fund i adskillige humane cancere. Identifikation prognostiske variabler, der arbejder kooperativt med kendte faktorer kan forbedre identifikationen af ​​patienter med højere risiko for tilbagefald og død. For nylig har flere undersøgelser identificeret vært stromale underskrifter, enten i oprensede stromaceller eller af hele tumorprøver, som signifikante prognostiske faktorer på flere typer af human cancer, herunder brystcancer, lungecancer, mavecancer, prostatacancer, og lymfomer [19] – [26]. Finak et al [19] anvendte laser capture mikrodissektion (LCM) af primære brysttumorer at konstruere et stroma-afledt prognostiske signatur, forudsagde dårligt resultat i hele tumor-afledte udtryk datasæt. Forfatterne fandt, at dårligt resultat var stærkt knyttet til ekspression af talrige endotel-afledte gener, og at patientprøver i dårligt resultat gruppe havde en signifikant større endotel indhold end dem i godt resultat gruppen. Endvidere Lenz et al [25] profileret genekspression i biopsiprøver fra patienter med diffust storcellet B-celle lymfom og identificeret en yderst prognostisk stromal signatur i patienter med komplikationer, som stort set bestod af velkendte endotheliale markører. Samt, Saadi et al [21] viste, at progressionen fra præ-malign sygdom til esophageal adenocarcinom var associeret med en markant ekspression af inflammatoriske mediatorer i LCM stromaceller kompromitteret, delvis ved endotelceller. Disse undersøgelser fremhæve den rolle, ikke-maligne tumor-infiltrerende stromaceller i prognosen af ​​humane cancere. I denne henseende fleste tumorbiopsier indeholder en betydelig del af stromale celler (op til 50% [10]). Derfor underskrifter fremstillet af hele tumor prøver afspejler både tumor og stromale ekspressionsmønstre. Ikke desto mindre har nogle undersøgelser til dato identificeret prognostiske molekylære signaturer relevante for flere humane cancere, og hvoraf ingen blev afledt fra tumorassocierede endotelceller. Salg

Endotelceller spille en aktiv rolle i en række inflammatoriske funktioner, der fører til øget blodgennemstrømning, vaskulær lækage af plasmaproteiner, og leukocytrekruttering. Mange succesrige behandlingsformer rettet mod kronisk inflammation direkte ændre endotel genekspression [4]. Specifikke eksempler indbefatter TNF-α inhibitorer i rheumatoid arthritis og inflammatorisk tarmsygdom og statiner i hjertekarsygdomme [4]. Der er stadig flere tegn på, at mange maligniteter er forbundet med sygdomme i kronisk inflammation. En mekanisme, ved hvilken dette sker, er gennem induktionen og akkumuleringen af ​​DNA-skader i prolifererende celler ved at infiltrere inflammatoriske celler på steder med vedvarende inflammation. Disse ændringer fører til permanente genomiske ændringer, som i sidste ende fremmer malign transformation [2]. Den stærkeste sammenhæng mellem kronisk inflammation og ondartet sygdom er i colon carcinogenese opstår i individer med inflammatoriske tarmsygdomme. Mens det er kendt, at inflammatoriske omsætningsveje i andre stromale celler bidrager også til tumorvækst [2], tyder vore resultater, at tumorassocieret endotel inflammation er en vigtig determinant i tumorudvikling. Til støtte for vores resultater, ny dokumentation viser, at endotelcellespecifikke afledte signaler, herunder inflammatoriske mediatorer, direkte regulere tumor progression gennem “angiocrine” mekanismer uafhængige af angiogenese [27]. Ikke desto mindre er der behov for yderligere undersøgelser for at karakterisere de mekanismer, som betændt tumor endotelceller fremmer tumorvækst.

Vores resultater adskiller sig fra mange empirisk afledte gen signaturer i at vi identificerede en molekylær indikator for overlevelse hos patienter med forskellige menneskelige kræftformer baseret på en eksperimentel model for tumor endotel inflammation, hvilket kan vise sig nyttig biologisk og klinisk. Yderligere prospektiv evaluering af de seks-genet signatur ved hjælp af RT-PCR kan resultere i en nøjagtig og reproducerbar forudsigelse værktøj, der kan støtte i klinisk beslutningstagning på tværs af forskellige menneskelige kræftformer. Fra et terapeutisk perspektiv, den selektive hæmning af endotelceller afledt inflammatoriske faktorer, uden at forstyrre integriteten af ​​blodkarrene, kan stadig blokere tumorvækst og derved undgå potentielle toksiske bivirkninger til normal vaskulatur [6], [7]. Endnu mere, er det kendt, at angiogen aktivitet ikke nødvendigvis korrelerer med tumor prognose [7].