PLoS ONE: En histondeacetylaseinhibitor Undertrykker Epithelial-Mesenchymale Overgang og Dæmper kemoresistens i galdevejene Cancer

Abstrakte

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er involveret i de særlige kendetegn ved malignitet, såsom invasion, metastase, og kemoresistens. I galdevejene cancer (BTC), er EMT induceret af transformerende vækstfaktor-beta 1 (TGF-β1). EMT er reversibel; derfor er det tænkeligt, at det kunne være relateret til nogle epigenetiske ændringer. Vi fokuserede på histon deacetylase (HDAC) hæmmere som regulatorer af TGF-β1 signalering, og undersøgte deres effekt på EMT og kemoresistens. Vi anvendte fire BTC cellelinier (MzChA-1, gemcitabin-resistent MzChA-1, TFK-1, og gemcitabin-resistent TFK-1) og anvendt vorinostat som HDAC inhibitor. Den relative mRNA-ekspression af en epitelial markør (CDH1) og mesenchymale markører (CDH2, vimentin, SNAI1) blev målt ved QRT-PCR for at evaluere faktorer i forbindelse med EMT. MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) assay blev udført for at evaluere kemoresistens af hver cellelinie. Desuden blev NOD /SCID-mus anvendes til at evaluere effekten af ​​vorinostat

in vivo

. I den forælder MzChA-1 og TFK-1 cellelinjer, TGF-β1 inducerede EMT og kemoresistens; mens vorinostat inhiberede EMT og kemoresistens induceret af TGF-β1. I gemcitabin resistente cellelinier, højt udtrykte TGF-β1, vorinostat inhiberede EMT og svækkede kemoresistens. Vi viste, at vorinostat inhiberer nuklear translokation af Smad4 som er en signalering faktor TGF-β1, og dette er en af ​​de mekanismer, hvormed vorinostat regulerer EMT. Vi viste også, at vorinostat dæmper bindingsaffiniteten af ​​Smad4 til CDH1-relaterede transskription faktorer SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, og TWIST. Endvidere kombinationsterapi med vorinostat og gemcitabin forbedret overlevelsestid i musene xenotransplanteret med gemcitabin resistent MzChA-1-celler. Afslutningsvis vorinostat reguleret TGF-β1-inducerede EMT og kemoresistens gennem hæmning af Smad4 cellekernetranslokering

Henvisning:. Sakamoto T, Kobayashi S, Yamada D, Nagano H, Tomokuni A, Tomimaru Y, et al. (2016) En Histondeacetylaseinhibitor Undertrykker Epithelial-Mesenchymale Overgang og Dæmper kemoresistens i galdevejene Cancer. PLoS ONE 11 (1): e0145985. doi: 10,1371 /journal.pone.0145985

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES

Modtaget: Juni 25, 2015; Accepteret: 7 okt 2015; Udgivet: 4 januar 2016

Copyright: © 2016 Sakamoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning af JSP’er ((C) 24.592.024), og Grand-i-Aid for Unge Forskere i JSP’er ((B) 26.861.069)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

galdevejene kræft (BTC), som har en stigende forekomst på verdensplan, har en dårlig prognose, fordi det er vanskeligt at diagnosticere i de tidlige stadier. Det 5-års overlevelse er mindre end 30% [1-3]. Ved diagnose Mange patienter har inoperabel BTC grundet lokal sygdom spredes og /eller metastaser. Gemcitabin (GEM) -baseret kemoterapi anvendes ofte; imidlertid antitumorvirkningen er utilstrækkelig, og den mediane overlevelsestid er begrænset til ca. 10 måneder [4,5]. At forbedre prognosen for BTC patienter, har den molekylære biologi af sygdommen blevet undersøgt, herunder de inflammatoriske cytokiner, epithelial-mesenchymal overgang (EMT), DNA-reparation systemet, cellesignalering, og apoptose [6-9]. Vi har tidligere vist, at EMT blev observeret ved invasionen foran og i regionale lymfeknudemetastaser med inflammatorisk cytokin-ekspression i BTC [10]. Flere typer af cytokiner sigende inducerer EMT, som er relateret til maligne processer såsom invasion, metastase, og kemoresistens (S1 Table) [11-15]. Transformerende vækstfaktor-beta 1 (TGF-β1) inducerer EMT og kemoresistens, og kemoterapi BTC celler producerer IL-6 og TGF-β1 [10]; derfor, vi mente, at disse cytokiner kan spille en vigtig rolle i at fremme EMT i BTC.

Konsekutive runder af EMT og mesenkymale-epitelial overgang (MET) forekomme under tumor udvikling, hvilket antyder, at EMT kunne være reversibel og er forbundet med epigenetiske ændringer [16]. Vi fokuserede på histon deacetylase (HDAC) som en faktor i forbindelse med epigenetiske ændringer. I vores microarray data, mRNA niveauer af klasse I HDAC’er (HDAC1, HDAC2, HDAC3, og HDAC8) blev forhøjet i GEM-resistente BTC celler. Desuden blev HDAC-aktivitet steg med eksponering for TGF-β1. Disse resultater antyder, at HDAC kunne være forbundet med EMT, og hæmning af HDAC’er kan undertrykke EMT gennem virkninger på TGF-β1 signalering. Vi har også undersøgt Smad4, nøglen signalering faktor TGF-β1 til EMT, og fandt det var direkte stimuleret af TGF-β1 signalering, med translokation ind i kernen, hvor det opregulerer EMT-relaterede transkriptionsfaktorer, såsom SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2 , og TWIST [17-21]. Derudover er der i normale hepatocytter og mesotelceller, inhibering af HDAC svækkede den nukleare translokation af Smad4 [22,23]. I denne undersøgelse har vi den hypotese, at HDAC-hæmmere kan regulere EMT gennem TGF-β1 signalvejen i BTC-celler.

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge virkningen af ​​HDAC inhibitor vorinostat på TGF-β1 signalering vej og kemoresistens, som er relateret til EMT i BTC celler. Først undersøgte vi effekten af ​​vorinostat på TGF-β1-inducerede EMT. Derefter undersøgte vi virkningen af ​​vorinostat på kemoterapi BTC celler. Efterfølgende viste vi indflydelsen af ​​vorinostat på Smad4 nuklear translokation i BTC-celler. Endelig har vi vurderet effekten af ​​vorinostat kombineret med GEM for BTC med hjælp mus xenotransplanteret med MzChA-1 eller GEM-resistente MzChA-1 celler. Disse resultater viste effektiviteten af ​​en HDAC-hæmmer i reguleringen EMT og kemoresistens

in vitro

in vivo

. Vi identificerede også en af ​​de mekanismer, som en HDAC-hæmmer undertrykker EMT og dæmper kemoresistens.

Materialer og Metoder

cellelinjer, kulturer, og narkotika

Vi brugte den menneskelige BTC cellelinier MzChA-1 og TFK-1. De MzChA-1 celler blev venligst stillet til rådighed af professor Gregory J. Gores af Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, USA (USA) [24-27]. De MzChA-1-celler blev opformeret i Dulbeccos modificerede Eagles medium.

TFK-1-cellelinien blev opnået fra Riken Bioresource Center i Japan. Disse celler blev opformeret i RPMI 1640 medium. Hvert medium blev suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Alle cellelinier blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2.

Alle cellelinjer blev behandlet med 5 ng /ml af rekombinant human TGF-β1 (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ, USA), 100 nM (MzChA-1 og GEM-resistent MzChA-1) eller 300 nM (TFK-1 og GEM-resistent TFK-1) af histondeacetylaseinhibitoren vorinostat (Selleckchem, Houston, TX, USA), eller dimethylsulfoxid (som en kontrol) i 72 timer. I eksperimentet med TGF-β1, blev hver mediet skiftet til serum-frit medium 24 timer efter passage til hinder indflydelse af TGF-β1 i serum. TGF-β1 og vorinostat blev tilsat til hver cellelinje efter skift af medium. Beskrevet i S2 tabel antistoffer blev anvendt til Western blot analyse, immunhistokemi og immuncytokemi.

Etablering af GEM-resistent MzChA-1 (MzChA-1_GR) og TFK-1 (TFK-1_GR) kloner

De GEM-resistente MzChA-1 og TFK-1 cellelinjer blev etableret gennem eksponering for stigende koncentrationer af GEM (fra 0,2 ng /ul til 80 ng /ul for MzChA-1, og fra 0,2 ng /pi til 40 ng /ul for TFK-1) mere end 3 måneder. Efter bekræftelse af, at disse cellelinjer opnået mere modstand til GEM end forælder cellelinjer blev MzChA-1_GR og TFK-1_GR celle kloner etableret ved at begrænse fortynding.

Analyse af HDAC-aktivitet

MzChA-1-celler blev dyrket med eller uden 5 ng /ml TGF-β1 og 300 nM vorinostat i 72 timer. Derefter blev kerneproteiner ekstraheret med kerneekstrakt Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Efterfølgende blev aktiviteten af ​​HDAC målt med HDAC aktivitet assaykit (BioVision, Palo Alto, USA). I dette eksperiment brugte vi HeLa kerneekstrakt som en positiv kontrol og destilleret vand som en negativ kontrol. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med producentens anbefalinger.

Immuncytokemi

Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur, permeabiliseret med 0,1% Triton X-100, og blokeret med 1 % BSA i 10 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev cellerne farvet med de angivne antistoffer.

Kvantitativ revers transskription-polymerasekædereaktion

Totalt RNA blev isoleret fra dyrkede celler under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Komplementært DNA blev syntetiseret fra 3,0 ug totalt RNA med SuperScript første-streng syntese systemet (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Kvantitative realtid polymerasekædereaktioner (QRT-PCR’er) blev udført med LightCycler-Fast-Start DNA Master SYBR Green I kittet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) med genspecifikke oligonukleotidprimere, som vist i S3 Table . Amplifikationer blev udført tredobbelt under anvendelse af LightCycler System (Roche Applied Science) i overensstemmelse med producentens protokol. En smeltekurveanalyse blev udført for at skelne specifikke produkter fra ikke-specifikke produkter og primerdimerer. Den relative ekspression blev beregnet som forholdet mellem specifikke mRNA til endogen β-actin (ACTB) mRNA i hver prøve. Alle QRT-PCR’er blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse.

væksthæmning analyser med GEM terapi

Hver cellelinje (5 × 10

3 celler /brønd) blev podet i en 96-brønds plade og inkuberet i 24 timer. Derefter blev mediet ændret til serum-frit medium. Efterfølgende blev cellerne udsat for GEM (1-120ng /ml) med de angivne lægemidler (TGF-β1, vorinostat eller dimethylsulfoxid) i 72 timer. Disse assays blev gentaget mindst tre gange, og lignende resultater blev opnået hver gang. Andelen af ​​MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) -positive celler inkuberet uden stoffer blev defineret som 100% levedygtighed.

Transfektion af små interfererende RNA (siRNA)

Vi anvendte TGF-p siRNA (Invitrogen) og krypterede oligonukleotid siRNA (Sc) som en negativ kontrol. Vi udførte siRNA transfektion med Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens protokoller [28]. Transfektionseffektiviteten blev bekræftet ved QRT-PCR.

Western blot-analyse

Western blot-analyse blev udført som tidligere [28] beskrevne. Kort fortalt blev et helcellelysat ekstraheret fra BTC-celler med RIPA-buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA) og nukleare proteiner blev ekstraheret med EpiQuick Nuclear Extraction Kit I (Epigentek Group Inc., Brooklyn, NY, USA) ifølge producentens protokol. Prøver (12 ug) af total eller nukleare proteiner blev elektroforesebehandlet på natriumdodecylsulfat-polyacrylamid geler indeholdende 10% Tris-HCI (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). De separerede proteiner blev overført til polyvinylidendifluorid membraner (Millipore) og inkuberet med hvert primært antistof natten over ved 4 ° C.

chromatin immunoprecipitation (chip)

Chippen assay blev udført med hjælp af en chip -IT Express Enzymatisk kit (Active Motif) som tidligere beskrevet [29]. Kort fortalt blev 1 × 10

7-celler blev tværbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og standset ved tilsætning af glycin. At høste chromatin-DNA-komplekser, blev cellelysatet behandles med et enzymatisk overklipning kit (Active Motif), ifølge producentens specifikationer. For immunopræcipitation blev 120 ug af kromatin-DNA-komplekser inkuberet med Protein G magnetiske perler knyttet til anti-Smad4-antistof (10 ug, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA), eller anti-IgG-antistof (10 ug, Active Motif) . Eluater anvendt som templates for PCR. Lige store mængder af anti-IgG eller præimmunt chromatin-DNA-kompleks blev anvendt som kontroller. De primersæt anvendt til PCR-amplifikation var: SNAI1: 5′-GCTGTCACACCCGGCACCAAG-3 ‘og 5′-GGCGGCTTGAAATGCCACGG-3′, SNAI2: 5’-ATGCGTGTGAAGTGCTTAGCATAGT-3 ‘og 5′-CACTCAGTGCCCAACAGTGTGT-3′, ZEB1: 5’- TTTCGGGAAGTTAAAATGTTTG-3 ‘og 5′-ATCCTGCTTCATCTGCCTGA-3′, ZEB2: 5’-TACGCCTGCGCTGTGACCTA-3 ‘og 5′-ACTCACTGGACCCGCCTCAG-3′, og sno: 5’-AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG-3 ‘og 5′-CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG-3’.

mus xenograft tumor model

MzChA-1 eller MzChA-1_GR celler (1,0 x 10

6 celler per mus) blev injiceret i det subkutane væv på bagsiden af ​​fem- til seks uger gamle mandlige nøgne mus (CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan), og tumorer fik lov at udvikle sig. Når tumorerne voksede til volumen på 200 mm

3, GEM (125 mg /kg, en gang om ugen) med eller uden vorinostat (60 mg /kg, 5 dage i træk om ugen) blev administreret ved intraperitoneal injektion. For at undersøge virkningen af ​​vorinostat på overlevelsestiden blev behandlingen fortsættes, indtil passende eutanasi. Operativt fjernede eksemplarer af tumorer blev anvendt til immunhistokemi til at undersøge ekspressionen af ​​Smad4.

Immunhistokemi

Immunohistokemiske undersøgelser af 10 resektion tumor prøver fra musene xenotransplanteret med MzChA-1_GR celler. Kort fortalt blev formalinfikserede, paraffinindlejrede væv deparaffineret, kogt i antigen-genvinding, inkuberet med en Smad4 antistof i 1 time ved stuetemperatur, derefter visualiseret med avidin-biotin kompleks reagenser (Vector Laboratory Inc., Burlingame, CA, USA) og diaminobenzidin. Alle snit blev modfarvet med hematoxylin. Alle immunhistokemiske undersøgelser blev evalueret i serielle snit med hvert antistof.

Etiske udsagn

Alle eksperimenter dyr blev udført i nøje overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg på Osaka University (godkendelsesnummer : 20-087), og undersøgelser blev gennemført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. I dyreforsøg blev alle invasive behandlinger såsom xenograft transplantation, sondeernæring, og eutanasi udføres under generel anæstesi med sevofluran. Musene blev aflivet ved starten af ​​kliniske tegn såsom svær kakeksi, signifikant vægttab eller inaktivitet.

Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) fra mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Students t-test eller Fishers eksakte test for kategoriske data. Den uparret t-test blev anvendt til at undersøge forskelle i væksthæmmende effekter

in vitro

.

P

-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Etablering af Mz-cha-1_GR og TFK-1_GR cellelinjer

Vi etablerede GEM-resistente cellelinier, MzChA-1_GR og TFK-1_GR, at undersøge effekten af ​​HDAC-hæmmere på kemoresistens. De MzChA-1_GR celler var resistente over for GEM (IC

50 for GEM 100 ng /ml,

P Salg 0,01 versus den forælder MzChA-1 celler, S1A Fig) og TFK-1_GR celler var resistente over for GEM (IC

50 for GEM 100 ng /ml,

P

0,01 versus den forælder TFK-1 celler, S1B Fig). Disse GEM-resistente celler havde spindel-lignende former.

microarray analyse

En mikroarray-analyse blev udført under anvendelse af TORAY 3D-Gene

® at sammenligne ekspressionsniveauerne profiler af MzChA-1 celler med de MzChA-1_GR celler og undersøge faktorer relateret til epigenetik. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​klasse I HDACs (HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, og HDAC-8) var højere i MzChA-1_GR celler end forælder MzChA-1-celler (tabel 1). Vorinostat hæmmer disse klasse I HDAC, så vi mente, at vorinostat kunne være effektive i kemoterapi BTC celler.

mRNA udtryk for klasse I HDAC’er og HDAC-aktivitet i MzChA-1 og MzChA-1_GR celler

for at validere microarray analyseresultater, QRT-PCR for klasse i HDAC’er blev udført for MzChA-1 og MzChA-1_GR celler. Alle klasse I HDAC viste højere udtryk i MzChA-1_GR celler sammenlignet med MzChA-1 celler (

P

0,05, figur 1A). HDAC-aktivitet var signifikant højere i MzChA-1-celler udsat for TGF-β1 i 72 timer og MzChA-1_GR celler sammenlignet med forælder MzChA-1-celler (

P

0,05, figur 1B). Desuden vorinostat undertrykt HDAC-aktivitet i både MzChA-1 celler udsat for TGF-β1 og MzChA-1_GR celler (

P

0,05, figur 1C).

Værdier repræsenterer middelværdien ± SD *

P

0,05. Alle forsøg blev udført mindst tre gange. (A) Sammenligning af ekspressionen af ​​klasse I HDAC’er i MzChA-1 og MzChA-1_GR celler ved QRT-PCR. (B) Virkningen af ​​TGF-β1 på HDAC-aktivitet i MzChA-1-celler og HDAC-aktivitet i MzChA-1_GR celler, blev aktivitet målt med HDAC aktivitet assaykit. (C) Ændringerne i HDAC-aktivitet i MzChA-1 og MzChA-1_GR celler behandlet med TGF-β1 og vorinostat. I forsøgene til paneler (B) og (C), blev cellerne inkuberet med eller uden 5 ng /ml TGF-β1 eller 100 nM vorinostat i 72 timer.

Forholdet mellem TGF-β1 udtryk og kemoresistens

for at klarlægge betydningen af ​​TGF-β1 i EMT og kemoresistens, undersøgte vi udtryk for TGF-β1 i forælder MzChA-1 og MzChA-1_GR celler. Resultaterne viste, at ekspressionsniveauet af TGF-β1 var signifikant højere i MzChA-1_GR celler end forælder MzChA-1-celler (fig 2A). Så vi transficeret med si

TGF-β

at undersøge, om EMT og kemoresistens kunne undertrykkes ved TGF-B banke ned i MzChA-1_GR celler. Resultatet viste, at MzChA-1_GR celler transficeret med si

TGF-β

havde øget mRNA ekspression af CDH1 og faldt mRNA ekspression af CDH2, vimentin, og SNAI1 (Fig 2B). Desuden transfektion med si

TGF-β

svækket kemoresistens i MzChA-1_GR celler (Fig 2C). Disse resultater tydede betydningen af ​​TGF-β i EMT og kemoresistens i BTC.

MzChA-1_GR celler blev transficeret med scrambled oligonukleotid siRNA (negativ kontrol) eller TGF-β1 siRNA. Alle forsøg blev udført mindst tre gange. Værdier repræsenterer middel ± S.D. *

P

0,05. (A) Sammenligning af ekspressionen af ​​TGF-β1 i MzChA-1 og MzChA-1_GR celler. (B) Ændringerne i EMT-relaterede mRNA-ekspression som følge af TGF-p siRNA transfektion i MzChA-1_GR celler. (C) Virkningen af ​​TGF-p siRNA transfektion på kemoresistens i MzChA-1_GR celler. Væksthæmning blev udført for transfekterede og ikke-transfekterede celler behandlet med GEM.

Effekten af ​​vorinostat på TGF-β1-induceret EMT og kemoresistens

Vi undersøgte effekten af ​​vorinostat på TGF-β1-inducerede EMT og kemoresistens i BTC celler. I MzChA-1-celler, TGF-β1 forårsaget morfologiske ændringer af cellerne fra valvate-lignende former til spindlen-lignende former. Desuden TGF-β1 nedregulerer ekspressionen af ​​CDH1 som bestemt ved immunofluorescens-farvning (Fig 3A). I modsætning hertil vorinostat forhindret disse ændringer forårsaget af TGF-β1 (Fig 3A). Endvidere TGF-β1 faldt mRNA ekspression af CDH1 og forøget mRNA ekspression af CDH2, vimentin (VIM), og SNAI1. I modsætning hertil vorinostat inhiberede ændringerne i mRNA-ekspression forårsaget af TGF-β1 (

P

0,05, figur 3B). Derudover vorinostat svækket GEM modstand induceret af TGF-β1 (

P

0,05, figur 3C). I TFK-1-celler, vorinostat forhindrede morfologiske ændringer og nedregulering af CDH1 forårsaget af TGF-β1 (fig 3D). Vorinostat hæmmede også ændringerne i mRNA-ekspression relateret til EMT (

P

0,05, figur 3E), og svækket kemoresistens til GEM forårsaget af TGF-β1 (

P

0,05, Fig 3F). Således vorinostat undertrykt EMT og svækkede kemoresistens forårsaget af TGF-β1.

I hvert forsøg blev cellerne inkuberet med eller uden 5 ng /ml TGF-β1 og 100 nM vorinostat for MzChA-1 celler og 300 nM af vorinostat for TFK-1-celler i 72 timer. Værdier repræsenterer middel ± S.D. *

P

0,05. Scale barer: 100 um. Alle forsøg blev udført mindst tre gange. (A) Repræsentative celle morfologiske ændringer induceret af TGF-β og vorinostat i MzChA-1-celler. Immunofluorescens for CDH1 (rød) blev udført i MzChA-1-celler. Nuklear farvning (blå) blev udført med Hoechst. (B) Virkningen af ​​vorinostat på EMT-relaterede mRNA’er ekspression i MzChA-1-celler. (C) Virkningen af ​​vorinostat på kemoresistens induceret af TGF-β1 eksponering i MzChA-1-celler. Vækstinhiberingen assays blev udført for MzChA-1-celler behandlet med GEM. (D) Repræsentative celle morfologiske ændringer induceret af TGF-β og vorinostat i TFK-1-celler. Immunofluorescens for CDH1 (rød) blev udført i TFK-1-celler. Nuklear farvning (blå) blev udført med Hoechst. (E) Virkningen af ​​vorinostat på EMT-relaterede mRNA’er ekspression i TFK-1-celler. (F) Virkningen af ​​vorinostat på kemoresistens induceret af TGF-β1 eksponering i TFK-1-celler. Væksthæmning blev udført for TFK-1 celler behandlet med GEM.

indflydelse vorinostat på MzChA-1_GR og TFK-1_GR celler

I MzChA-1_GR celler, vorinostat ændret morfologi fra spindel-lignende figurer til valvate-lignende former og forbedret farvningen af ​​CDH1, bestemt ved immunfluorescensfarvning (fig 4A). Den CDH1 mRNA-ekspression tendens til at stige, og CDH2, VIM, og SNAI1 blev signifikant reduceret ved vorinostat (

P

0,05, figur 4B). Desuden vorinostat svækket GEM kemoresistens i MzChA-1_GR celler (

P

0,05, figur 4C).

I hvert forsøg blev MzChA-1_GR celler inkuberet med eller uden 100 nM vorinostat og TFK-1_GR celler med eller uden 300 nM vorinostat i 72 timer. Værdier repræsenterer middel ± S.D. *

P

0,05. Scale barer: 100 um. Alle forsøg blev udført mindst tre gange. (A) Repræsentant morfologisk ændring induceret af vorinostat i MzChA-1_GR celler. Immunofluorescens for CDH1 (rød) blev udført i MzChA-1-celler. Nuklear farvning (blå) blev udført med Hoechst. (B) Effekten af ​​vorinostat på EMT-relaterede mRNA ekspression i MzChA-1_GR celler. (C) Effekten af ​​vorinostat på kemoresistens i MzChA-1_GRcells. Væksthæmning blev udført for MzChA-1_GR celler behandlet med GEM. (D) Repræsentative morfologiske forandringer som følge af vorinostat i TFK-1_GR celler. Immunofluorescens for CDH1 (rød) blev udført i TFK-1_GR celler. Nuklear farvning (blå) blev udført med Hoechst. (E) Virkningen af ​​vorinostat på EMT-relaterede mRNA’er ekspression i TFK-1_GR celler. (F) Effekten af ​​vorinostat på kemoresistens i TFK-1_GR celler. Væksthæmning blev udført for TFK-1_GR celler behandlet med GEM.

I TFK-1_GR celler, vorinostat ændret morfologi og forbedret farvningen af ​​CDH1, som målt ved immunfluorescensfarvning ligner MzChA-1_GR celler (fig 4D). Desuden vorinostat øgede ekspression af CDH1 mRNA og reducerede mRNA ekspression af CDH2, VIM, og SNAI1 (

P

0,05, figur 4E). GEM modstand blev også svækket ved vorinostat i TFK-1_GR celler (

P

0,05, figur 4F). Disse resultater antydede, at vorinostat undertrykte EMT og svækket kemoresistens i GEM resistente BTC celler.

Effekten af ​​vorinostat på Smad4 nukleare translokation i MzChA-1 celler

I vores tidligere undersøgelse, Smad4 var nøglen molekyle som regulerer TGF-β1-inducerede EMT [10]. Derfor undersøgte vi effekten af ​​vorinostat på ekspressionen af ​​Smad4 ved Western blot analyse. I helcellelysater, var der ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​Smad4-protein mellem TGF-β1 gruppen og TGF-β1 plus vorinostat gruppe (fig 5A, venstre). Imidlertid TGF-β1 opreguleres ekspressionen af ​​Smad4 nukleoprotein sammenlignet med kontrollen, og vorinostat inhiberede denne opregulering af Smad4 nukleoprotein forårsaget af TGF-β1 (Fig 5A, højre). Desuden brugte vi chippen metode til at analysere den molekylære mekanisme Smad4. Mens TGF-β1 forøgede bindingsaffinitet af Smad4 til CDH1-relaterede transkriptionelle faktorer SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, og vride, vorinostat inhiberede TGF-β1-forstærket bindingsaffinitet Smad4 til disse transkriptionelle faktorer (figur 5B).

i hvert forsøg blev cellerne inkuberet med eller uden 5 ng /ml TGF-β1 og 100 nM vorinostat i 72 timer. Scale barer: 100 um. Alle forsøg blev udført mindst tre gange. (A) Ændringen i Smad4 ekspression i helcellelysater (venstre felt) og i kernen (højre panel) forårsaget af TGF-β og vorinostat. (B) chip assay viser udtryk for SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, og TWIST, som er regulatoriske elementer af CDH1. (C) Immunofluorescens af Smad4 (grøn) blev udført i MzChA-1-celler. Virkningen af ​​TGF-β1 og vorinostat på Smad4 nuklear translokation blev undersøgt. Nuklear farvning (blå) blev udført med Hoechst.

Immuncytokemi viste, at Smad4 farves kraftigt i kerner efter behandling med TGF-β1 (Fig 5C). I modsætning hertil blev Smad4 svagt farvet i kernerne efter behandling med TGF-β1 plus vorinostat (Fig 5C). Baseret på disse resultater, vorinostat reguleret EMT gennem hæmning af Smad4 cellekernetranslokering.

Virkningen af ​​vorinostat på TGF-p signalering faktorer, Smad2, SMAD3, og Jun N-terminal kinase (JNK)

Vi undersøgte også effekten af ​​vorinostat på SMAD2 og SMAD3 fordi de er tæt knyttet til Smad4 nukleare translokation i TGF-β-signalering. Vi fandt TGF-β1 inducerede SMAD2 og SMAD3 phosphorylering i både hele cellelysater og kerneproteiner (Fig 6). Desuden vorinostat inhiberede TGF-β1-inducerede nuklear translokation af phosphoryleret SMAD2 (p-SMAD2) og SMAD3 (p-SMAD3); mens, vorinostat havde ingen effekt på den nukleare translokation af SMAD2 og SMAD3 (figur 6). Disse resultater antyder, at vorinostat kan inhibere nuklear translokation af p-SMAD2, p-SMAD3, og Smad4 samtidig. Vi undersøgte også aktiveringen af ​​JNK fordi nylige rapporter viste, at JNK-aktivering spiller en central rolle i TGF-β-medieret EMT. Resultatet viste TGF-β1 opreguleres ekspressionen af ​​phosphoryleret JNK; dog vorinostat havde ingen virkning på JNK (figur 6). Følgelig virkningen af ​​vorinostat på EMT synes at være uafhængig af JNK-vejen i BTC.

I hvert forsøg blev celler inkuberet med eller uden 5 ng /ml TGF-β1 og 100 nM vorinostat i 72 h. Alle forsøg blev udført mindst tre gange. Ændringerne i SMAD2, p-SMAD2, SMAD3, og p-SMAD3 udtryk i helcellelysater (venstre panel) og i kernen (højre panel) er vist. Udtrykket af JNK og p-JNK i helcellelysater er også vist (venstre panel).

Effekten af ​​vorinostat på musen xenotransplanteret tumor model

For at bekræfte

in vitro

resultater, vi evaluerede effekten af ​​vorinostat på mus xenotransplanteret med MzChA-1 eller MzChA-1_GR celler. I musene xenotransplanteret med MzChA-1 celler, kombinationsbehandling med vorinostat og GEM ikke forbedre overlevelsestiden sammenlignet med en enkelt administration af GEM (Fig 7A). I modsætning hertil kombinationsbehandling med vorinostat og GEM forbedret overlevelsestiden sammenlignet med en enkelt administration af GEM i musene xenotransplanteret med MzChA-1_GR celler (log-rank test,

P

0,01, figur 7B).

NOD /SCID-mus xenotransplanteret med MzChA-1 og MzChA-1_GR celler blev ansat som

in vivo

modeller. Når tumorvolumen var over 200 mm

3, blev musene behandlet med de angivne lægemidler (GEM [125 mg /kg, en gang om ugen] og /eller vorinostat [60 mg /kg, 5 på hinanden følgende dage om ugen]) . Den prognostiske værdi blev evalueret af Kaplan-Meier-metoden og en log-rank test. (A) Overlevelse kurve for mus xenotransplanteret med MzChA-1 celler. (B) Overlevelse kurve for mus xenotransplanteret med MzChA-1_GR celler. (C) Immunhistokemi for Smad4 på resektion tumor prøver på de mus xenotransplanteret med MzChA-1_GR celler.

Efterfølgende udførte vi immunhistokemi på resektion tumor eksemplarer af mus for at evaluere udtrykket af Smad4

in vivo

. Resultatet viste, at Smad4 var stærkt farvet i kernerne i tumorceller når musene blev behandlet med en enkelt indgivelse af GEM. I modsætning hertil blev Smad4 svagt farvet i kernerne i tumorceller når musene blev behandlet med GEM og vorinostat (Fig 7C). Disse resultater var den samme i både primære og metastatiske steder (lunge). Således vorinostat forbedret overlevelsestid i mus xenotransplanteret med kemoterapi celler, når de blev behandlet med GEM.

Diskussion

I mange kræftformer er flere gener relateret til tumorigenese og tumor progression opreguleres, og gener relateret til tumor suppression nedjusteres. En af de faktorer, der regulerer dette genekspression er posttranslationelle modifikation af histonerne. Methylering og acetylering af histoner er velkendte post-translationelle modifikationer [30-32]. For nylig har megen opmærksomhed blevet betalt til methylering og acetylering af histoner til behandling af kræft [33,34]. I denne undersøgelse har vi fokuseret på evnen af ​​HDAC-hæmmere til at regulere EMT. Vi brugte vorinostat, som hæmmer klasse I HDAC og er ofte brugt som en HDAC-hæmmer i kræft kliniske forsøg, som vist i S4 Table [35-39]. I flere kræftformer, såsom ikke-småcellet lungekræft og brystkræft, kombinationskemoterapi med vorinostat var sikkert og viste potentiale for at forbedre effektivitet [38,40].

Vi fokuserede på SMADs, især Smad4 som er en signalering faktor TGF-β1, som en af ​​de mekanismer, der regulerer vorinostat EMT. Det er ofte rapporteret, at TGF-β inducerer EMT og kemoresistens [10]. Aktiverede type I TGF-p1-receptorer phosphorylerer SMAD2 og SMAD3, som danner et heteromert kompleks med Smad4 [41,42]. Dette kompleks translokerer til kernen og er rettet mod en række DNA-bindende proteiner til at regulere transkriptionelle responser [41,42]. Således transkriptionelle regulatorer af CDH1, såsom SNAI, ZEB, og TWIST, opreguleres [42]. Derefter CDH1 nedreguleres og EMT forekommer [43,44]. Således inhibering nuklear translokation af SMAD2, SMAD3, og Smad4 komplekser kunne regulere TGF-β1-relateret EMT. Først undersøgte vi, om vorinostat ændrer mRNA ekspressionen af ​​disse SMADs ved QRT-PCR. Ingen ændringer i disse SMADs blev observeret efter udsættelse for vorinostat (S2 Fig). Imidlertid har nogle undersøgelser vist aneffect af HDAC-hæmmere på Smad4 [22,23]. Kaimori et al. *

P

0,05. *

P

0,05.