PLoS ONE: PET /CT Imaging af c-myc transgene mus Identificerer Genotoksisk N-nitroso-Diethylamin som Kræftfremkaldende i en kortsigtet Cancer bioassay

Abstrakt

Baggrund

Mere end 100.000 kemikalier er i brug, men er ikke blevet testet for deres sikkerhed. For at overvinde begrænsningerne i kræft bioassay flere alternative teststrategier er udforsket. Den manglende evne til at overvåge ikke-invasivt indtræden og progression af sygdomstilstande grænser imidlertid værdien af ​​den eksisterende teststrategier. Her rapporterer vi anvendelsen af ​​

in vivo

billedbehandling til en c-myc transgene mus model af leverkræft for udviklingen af ​​en kortsigtet kræft bioassay.

Metode /vigtigste resultater

μCT og

18F-FDG μPET blev anvendt til at detektere og kvantificere tumor læsioner efter behandling med genotoksisk carcinogen NDEA, tumoren fremme agent BHT eller HEPATOTOXIN paracetamol. Tumorvækst blev undersøgt i alderen 4 til 8,5 måneder og kontrast-forstærket μCT imaging detekteret leverlæsioner samt metastatisk spredning med høj følsomhed og nøjagtighed som bekræftet ved histopatologi. Der blev observeret signifikante forskelle i starten af ​​tumorvækst, belastning og glucosemetabolisme når NDEA behandlingsgruppen blev sammenlignet med nogen af ​​de andre behandlingsgrupper. NDEA behandling af c-myc transgene mus accelereret betydeligt tumorvækst og forårsagede metastatisk spredning af HCC i at lunge, men denne behandling inducerede også primær lungecancer vækst. I modsætning hertil BHT og paracetamol ikke fremmer hepatocarcinogenese.

Konklusioner /Betydning

Den foreliggende undersøgelse dokumenterer nøjagtigheden af ​​

in vivo

imaging definere tumorvækst, belastning, læsion nummer og metastatisk spredning. Derfor anvendelsen af ​​

in vivo

billeddiagnostiske teknikker til transgene dyremodeller kan muligvis muliggør kortsigtede kræft bioassays til markant at forbedre fareidentifikation og opfølgning undersøgelser af forskellige organer af ikke-invasive metoder.

Henvisning: Hueper K, Elalfy M, Laenger F, Halter R, Rodt T, Galanski M, et al. (2012) PET /CT Imaging af c-myc transgene mus Identificerer Genotoksisk N-nitroso-Diethylamin som Kræftfremkaldende i en kortsigtet Cancer bioassay. PLoS ONE 7 (2): e30432. doi: 10,1371 /journal.pone.0030432

Redaktør: Martin W. Brechbiel, National Institute of Health, USA

Modtaget: Juli 17, 2011; Accepteret: December 20, 2011; Publiceret: 2 Feb 2012

Copyright: © 2012 Hueper et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dele af det arbejde blev finansieret af Ministeriet for Videnskab og Kultur, Niedersachsen, Tyskland; tilskud nummer: 25A.5-76251-99-3 /00 til Juergen Borlak, en PHD-stipendium af den egyptiske ministeriet for højere uddannelse til Mahmoud Elalfy, en GE Healthcare forskningsbevilling givet til Fraunhofer Institut for Toksikologi og Eksperimentel Medicin, Hannover , Tyskland og den tyske Research Foundation (DFG) til at dække omkostningerne til offentliggørelse. Især de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er ofte observeret i kræft bioassays som følge af livslang udsættelse for enten eksperimentelle lægemidler eller en bred vifte af kemikalier. Specifikt kan carcinogener adskiller sig ved deres virkningsmåde hvoraf nogle udøver aktivitet enten gennem DNA-skader og dermed er defineret som genotoksiske carcinogener, såsom N-nitrosodiethylamin (NDEA), mens andre ikke skader DNA, men forårsage forstyrrelser i biologisk proces, der til sidst fører til ukontrolleret vækst og kaldes ikke-genotoksiske kræftfremkaldende stoffer. Sidstnævnte gruppe af kræftfremkaldende stoffer er i sagens natur sværere at forudsige. Endvidere kan stoffer og kemikalier ikke være sig selv tumorigen men fremme tumorvækst.

Desuden mens processen med at evaluere sikkerheden af ​​kemikalier er internationalt harmoniseret, er det stadig dyrt og tidskrævende. For at reducere den nødvendige tid til en evaluering af den kræftfremkaldende risiko ved medicin og kemikalier, har nye transgene dyremodeller blevet udviklet og biologiske læse outs fra sådanne modeller er i forhold til den etablerede kræft bioassay. De fælles kræft bioassays kræver en observationsperiode på 2 år og udnytte et stort antal dyr, som efterfølgende udsættes for histopatologi undersøgelser [1].

For at overvinde begrænsninger i kræft bioassay flere alternative teststrategier er ved at blive udforsket, enten med genetisk modificerede dyr,

in vitro

cellebaserede assays eller computerstyrede modeller [2] – [7]. I denne henseende kan genetisk modificerede forsøgsdyr vise sig værdifulde i tidlig påvisning af leveren kræftfremkaldende stoffer, og dermed kan gøre det muligt kortvarige karcinogenicitet. Hidtil har flere knock-out modeller samt transgene musemodeller for hepatocellulært carcinom blevet rapporteret [8]. For eksempel reaktion på genotoksisk carcinogen NDEA blev evalueret i et p53-deficient [9] samt i rasH2 transgene model [10] – [12]. Desværre, begge modeller har undladt at identificere NDEA som en lever kræftfremkaldende i de korte kræft bioassays rendering denne strategi mindre robust til påvisning af orgel specifikke kræftfremkaldende stoffer med disse to genetiske modeller.

Derudover standard gnaver carcinogenicitetsstudierne er ude af stand til at overvåge ikke-invasivt indtræden og progression af sygdommen. Derfor kan billeddiagnostiske teknikker som mikro computertomografi (μCT) og micro positronemissionstomografi (μPET) bliver en metode til valg i prækliniske undersøgelser for at opdage

in vivo

tumor læsioner og kvantificere tumor belastning.

In vivo

imaging vil således bidrage til forfinelse af kræft bioassays og tilbyde yderligere oplysninger, såsom en identifikation af metastatisk spredning og sekundær tumorvækst i tide [13].

Faktisk den seneste avancement i små dyr imaging teknologier tilskyndet os til at undersøge nytten af ​​μCT og μPET til påvisning af tumor læsioner i en transgen musemodel for leverkræft. Med sådanne støtteteknologier μCT leverer en opløsning på anatomiske strukturer på omkring 50 pm, derfor giver betydelig morfologiske oplysninger. Dette kræver imidlertid, at anvendelsen af ​​en organspecifik kontrastmiddel tillade billeddannelse af parenkymvævet morfologi. Især c-myc transgene musemodel effektivt udvikler levercancer i en kort periode. I denne genetiske model, er c-Myc målrettet mod leveren ved anvendelse af α1-antitrypsin-promotoren, som udelukkende aktiveres i leveren. Denne model blev oprindeligt udviklet af Dalemans et al. [14], men er ikke blevet udforsket til dens nytte i korte kræft bioassays, som endnu. Især humane molekylære patologi studier identificeret c-Myc som hyperaktive og overudtrykkes i de fleste humane hepatocellulært carcinom [15] derfor giver en rationel for en evaluering af denne sygdomsmodel.

Mens nogle få rapporter beskriver anvendelsen af anatomiske og metabolisk billeddannelse af primære lever maligniteter hos gnavere [16] – [19], er formålet med denne undersøgelse var for det første at udvikle strategier og definere parametre til påvisning og kvantificering af leveren læsioner af

in vivo

kontrast-forstærket μCT og

18F-FDG μPET metaboliske billeddannelse af glukoseoptagelse og for det andet, at vurdere nøjagtigheden af ​​disse metoder sammenlignet med histopatologi og for det tredje, at bestemme anvendeligheden af ​​c-myc transgene mus model i præcist at forudsige den lever kræftfremkaldende NDEA på kort sigt bioassay og dermed at vurdere, om en kombination af

in vivo

billeddiagnostiske modaliteter og brugen af ​​genetiske musemodeller kan bidrage til at udvikle kortsigtede kræft bioassays for tidlig påvisning af farlige stoffer, og kemikalier.

Materialer og metoder

Transgene tumor model

Alt animalsk arbejde følges nøje Public Health service Policy på human måde og anvendelse af forsøgsdyr. Tilladelse til at udføre undersøgelsen blev opnået ved dyrevelfærd etiske udvalg af byen Hannover, Tyskland (Tierversuchsvorhaben 33.9-42502-04-08 /1619).

c-myc transgene mus var den slags gave Dalemans et al. [14]. Dyrene blev opretholdt som homozygoter i C57 /BL6 baggrund og denne baggrund er meget udbredt i transgene sygdomsmodeller såsom rasH2 og p53 deficient model. Navnlig transgenet (se figur S1) består af c-myc åbne læseramme og regulatoriske sekvenser af α1-antitrypsin-promotoren for at tillade leveren specifik genekspression af c-Myc. Denne genetiske sygdom model har en incidens for leverkræft på 100%

Transgenet blev påvist ved PCR under anvendelse af fremadrettet primer:. 5′-CACTGCGAGGGGTTCTGGAGAGGC-3 ‘og revers primer: 5′-ATCGTCGTGGCTGTCTGCTGG-3’ . Følgende PCR-assay blev anvendt: 15 min., 95 ° C, 1 min 60 ° C, 1 min 70 ° C, 1 min 95 ° C, 31 cyklusser Salg

I alt 120 c-myc transgene mus var undersøgt af

in vivo

billeddannelse og /eller histopatologi, mens de ikke-transgene kontroller blev undersøgt ved kun histopatologi, da disse dyr ikke har tumorer. Mus blev holdt som grupper af dyr med 1 til 4 mus pr bur på savsmuld i en 12 timers lys-mørke-cyklus, og 50% relativ fugtighed og en omgivende temperatur på 22 ° C. Dyrene fik standardiseret chow og drikkevand ad libitum (Zucht, ssniff M- /, 10 mm, komplet kost for mus, ssniff Specifikationer GmbH, DE-59494, www.ssniff.de).

Undersøgelse design og behandling af dyr med NDEA, butyleret hydroxytoluen (BHT) og paracetamol

dyrene blev inddelt i 7 grupper på 24 dyr hver og bestod af n = 12 hanner og n = 12 hunner. Behandling af transgene mus med intraperitoneal injektion af NDEA, BHT eller paracetemol (Sigma Aldrich, Tyskland med en renhed på 99%), blev startet i en alder af 2 måneder. Den transgene og ikke-transgene kontroldyr blev også behandlet med kun køretøjet, dvs. majsolie eller fysiologisk saltvand (Sigma Aldrich, Tyskland). NDEA mus blev behandlet en gang om ugen ved injektion af 75 ug /g NDEA i saltvand over en periode på 6 uger, mens dyr, der modtog 300 ug /g BHT i majsolie blev behandlet en gang om ugen i 8 uger. Desuden 100 pg /g paracetamol i saltvand tjente som en ikke-kræftfremkaldende HEPATOTOXIN, og dette stof blev givet én gang dagligt i 5 dage om ugen over en periode på 8 uger (se tabel 1 for dosering regime).

som C57BL /6 mus er resistente over for hepatocarcinogenese induceret af NDEA [9] en ikke-transgen NDEA og BHT behandlingsgruppe ikke var inkluderet i undersøgelsen design det er af stor interesse, at en lignende mangel på sensitivitet blev rapporteret for p53 mangelfuld og for rasH2 /CB6F1 transgene mus, som blev opdrættet i den samme C57BL /6 baggrund [11]. Ligeledes blev det vist tidligere, at BHT forbedrer tumordannelse, hvis administreret efter udsættelse for genotoksisk stof urethan, men har ingen effekt på dens ene [20] eller er endda beskyttende, hvis givet før et kræftfremkaldende stof [21], [22]. Et resumé af behandlingsplan er givet i tabel 1.

Valg af dosis

Baseret på tidligere offentliggjorte data, hvor forskellige doser af NDEA blev undersøgt (dosis interval 75-200 pg /g) til årsag tumordannelse i ikke-transgene gnavere [23], [24], [25], [26], en dosis på 75 ug /g legemsvægt blev udvalgt og givet en gang om ugen i 6 uger ved intraperitoneal indgivelse. I tilfælde af BHT blev administreret en dosis på 300 ug /g legemsvægt. Denne dosis blev rapporteret at forårsage tumor induktion i leveren [20]. Endelig paracetamol tjente som ikke-kræftfremkaldende HEPATOTOXIN og en dosis på 100 ug /g legemsvægt blev givet i.p. én gang dagligt i 5 dage om ugen over en periode på 8 uger

In vivo imaging af transgene dyr ved μCT og μPET

På fire forskellige tidspunkter – dvs. i en alder af fire, 5,5, 7 og 8,5 måneder –

in vivo

μCT og μPET billeddannelse var ansat; dyr blev ofret bagefter for histopatologi.

Alle billeddiagnostiske procedurer blev udført under indånding anæstesi med isofluran (Isoba dyrlæge., Essex Pharma, Tyskland) ved en koncentration på 4% til induktion af anæstesi og 1-2% for vedligeholdelse . Musene blev anbragt i liggende stilling på en temperaturstyret seng ved 39 ° C (T /Pumpe, Gaymar, Orchard Park, NY, USA), der giver ændringer mellem billeddiagnostiske modaliteter uden repositionering og isofluran blev leveret via en næse kegle (Summit Anæstesi Solutions, Bend , OR, USA). Dyret respiration var spontan, og vejrtrækningen blev overvåget kontinuerligt ved hjælp af en lille tryktransducer (Biovet, M2M billedbehandling, Newark, NJ, USA). Vejrtrækning blev holdt ved en hastighed mellem 60 og 100 per minut. Efter overtagelsen billeddata inddrivelse tid af dyr fra anæstesi var normalt mindre end fem minutter. Samlet procedurerne var veltolereret.

Konkret sekventiel μCT og

18F-FDG μPET imaging blev udført med i alt 60 dyr, som vist i tabel 1. Mus blev afbildet i en alder af 4 ( 1st offer), 5.5 (2nd offer), 7 (3 offer) og 8,5 måneder (4th offer). De transgene kontroldyr blev undersøgt i en alder af 8,5 måned kun (4th Offer), selv om nogle eksplorative kontrast-forstærket billeddannelse blev udført i en alder af 2, 5 og 7 måneder. Alle dyr blev aflivet 2 dage efter PET-billeddannelse. På dette tidspunkt det radioaktive sporstof faldt til under niveauet for detektion. Imaging resultater blev bekræftet af standard histopatologi som beskrevet nedenfor.

Contrast forbedret μCT imaging

Alle dyr blev fastet før billeddannelse i cirka 6 timer. Tre timer før CT-scanninger bedøvede mus blev givet en intravenøs injektion af en lever-specifik ioderet kontrastmiddel (DHOG, Fenestra LC, ART Inc., Saint-Laurent, Canada) til en omtrent volumen på 200-300 pi (10 pl /g legemsvægt) i halevenen. erhvervelse Den billeddata blev udført som anbefalet af fabrikanten og tidligere offentliggjorte protokoller [18], [19].

μCT scanningen blev udført med en høj opløsning små dyr computertomografi scanner (Udforsk Locus, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). Scanningsparametrene blev fastsat som følger: rørspænding 80 kVp, rør nuværende 450 uA, antal erhvervelse 360, antal visninger 720, eksponeringstid 100 ms, en gennemsnit pr frame, aksiale field-of-view 33 mm. Scanninger blev optaget uden respiratorisk gating. Total scan varighed var omkring 12 minutter.

Billeddata blev rekonstrueret ved hjælp af en kegle-beam algoritme på en 8-node linux cluster. Den resulterende voxel størrelse isotrope datasæt var 45 um. Vilkårlige dæmpningsværdier blev konverteret til Hounsfield skala ved hjælp af en kalibrering fantom med vand, luft og knogler skær.

μPET imaging

bedøvet mus fik en intraperitoneal injektion (ip) på 10 MBq (

18F) -2-fluor-2-deoxyglucose i et samlet volumen på 50-100 pi steril isotonisk saltopløsning leveret af Institut for nuklearmedicin, Hannover Medical School, Tyskland. Dyr blev underkastet sekventiel CT og PET-billeddannelse som nødvendiggjorde flere injektioner i halevenen til mulige årsag vaskulære læsioner og embolisering på injektionsstedet. Som CT-scanninger krævede intravenøst administration af Fenestra (se ovenfor)

18F-FDG blev givet ved i.p. indsprøjtning. Dette kan forsinke standard erhvervelse af FDG, imidlertid ikke påvirke det endelige fortolkning af data med glukoseoptagelse er proportional med tumorvækst som vist i den foreliggende undersøgelse. Derfor, efter CT billedoptagelser

18F-FDG blev administreret til mus ved i.p. indsprøjtning. Dyrene forblev bedøvede og efter ca 35 min blev overført på den samme seng /position fra CT-scanner til PET-skanneren. Statiske billeder blev erhvervet præcis efter 45 minutter efter injektion af sporstof ved hjælp af en høj opløsning lille dyr PET kamera (Udforsk Vista, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). Samlet erhvervelse tid var 30 minutter for en enkelt seng position. Billeder blev korrigeret for tilfældige begivenheder og scatter før rekonstruktion med en 3D-FORE /2D-OSEM iterativ algoritme. Ingen dæmpning korrektion blev anvendt.

Billedanalyse

μCT datasæt blev visualiseret og analyseret ved hjælp af software-pakker Microview 2.2 (GE Healthcare, Chalfont St. Diles, UK), MeVisLab 2.0 (MEVIS Medical Solutions AG, Bremen, Tyskland) og OsiriX (v.3.7.1 32-bit, Pixmeo Sarl). Total levervolumen blev beregnet under anvendelse af LiveWireMacro modul (MeVisLab 2.0), som anvender en kontur-baserede semi-automatisk segmentering metode. Fokale leverlæsioner blev talt og kvantificeres ved 2D-måling af den største diameter. Diameteren (d) af læsionerne blev anvendt til estimeret tumorvolumen ved følgende formel: tumorvolumen (V) = 1/6 × π × d

3. De mængder af alle leverlæsioner blev tilsat for at bestemme den samlede tumorvolumen. Tumoren procentdel af leveren blev beregnet som forholdet mellem det samlede tumorvolumen (ml) og det samlede levervolumen (ml).

Stiv registrering af PET og CT datasæt var baseret på anatomiske kendetegn og anvendes til at generere kondenserede datasæt. Regioner af interesse (ROI) blev manuelt defineret for fokale leverlæsioner med en diameter på over 5 mm, som påvist i μCT og

18F-FDG μPET billeddannelse. Baggrunden (ikke-tumor) signal blev bestemt ved at anbringe en ROI i tumoren-free leverparenchym og den maksimale tælling per volumen blev bestemt for hver ROI at estimere tumor-til-ikke-tumor forhold.

histopatologi

To dage efter den sidste billeddannelse mus blev aflivet og lever og lunge blev fjernet til histopatologi. Hele lunger og lever blev nedsænket i pufret 4% formaldehyd og indlejres i paraffin ved standard laboratorieprocedurer. Efterfølgende blev 4-5 um snit af blokkene indbyrdes afstand med et interval på 500 um fremstillet ud fra den centrale kerne af den indlejrede væv og farvet med H . 5 mm), medium (5-10 mm) og store læsioner ( 10 mm) og statistiske signifikante forskelle blev bestemt under anvendelse af envejs ANOVA og Bonferroni post-test

på forskellige tidspunkter og efter. alle studiegrupper den gennemsnit og standardafvigelse af tumoren procentdel, den tumormangfoldighed og tumor-til-ikke-tumor-forhold blev sammenlignet. Envejs ANOVA og Bonferroni efter testen blev anvendt til at evaluere den statistiske signifikans (p-værdi cutoff bestemmes som 0,05).

Alle statistiske analyser blev udført og visualiseret ved hjælp af SPSS Statistics 17,0 og GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software , Inc.).

Resultater

kontrast-forstærket lever morfologi og glukose metaboliske imaging

i begyndelsen af ​​studiet ingen af ​​de transgene dyr havde lever tumorer eller prækursorer læsioner mens ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev påvist i alt 244 leverlæsioner, der i varierede i størrelse mellem 0,9 mm og 25,0 mm. Især intravenøs injektion af leverspecifik ioderet kontrastmiddel DHOG defineret tumorbyrde som hypodense sammenlignet med den normale omgivende leverparenkym (figur 1). Læsioner af en størrelse på 1 mm kunne identificeres med sikkerhed ved μCT men ikke med FDG μPET billeddannelse til læsioner af 5 mm. Hos dyr med stor tumor belastning enkelte læsioner kunne ikke altid løses på grund af individuelle tumorer, der var fusioneret sammen (sammenstød tumorer).

Aksiale skiver af en CT (A) og en FDG-PET-scanning (B) samt koronale skiver af en CT-scanning (C) og makroskopiske visning (D) af en eksplanteret lever af en NDEA behandlet mus i en alder af 7 måneder. Sammenlignet med de normale leverparenchym tumorer er hypodens på CT som optagelsen af ​​leveren specifikke kontrastmiddel reduceres. PET scanninger afslører tumor læsioner ved en øget tracer optagelse på grund af forbedret glukosemetabolismen. På grund af den fremskredent stadium af sygdom tumorer af forskellig størrelse var slået sammen. K = nyre, L = lunge, S = ryg, Sp = milt, T = tumor.

Vurdering af vækst og mangfoldighed af tumor læsioner

Behandling af transgene mus med genotoksisk hepatocarcinogen NDEA inducerede hurtigt udviklingen af ​​HCC. I en alder af 4 måneder (1. sacrifice) havde en ud af seks dyr HCC, og tumorincidensen var allerede 100% ved en alder af 5,5 måned (2. offer). Ved CT billeddannelse leveren og tumorvolumen blev bestemt, og den resulterende forholdet blev defineret som tumor procent (figur 2A). Samlet set var der ingen forskel i tumorincidensen eller tumor volumen, når mandlige og kvindelige c-myc transgene mus behandlet med NDEA blev sammenlignet (tabel 2).

(A) volumen Orglet og tumor blev vurderet ved CT og ved histopatologi. Afbildet er den procentvise tumor volumen på forskellige stadier målt enten ved histopatologi (lysegrå) eller derimod forbedret CT billeddannelse (mørkegrå). Middeldiameteren af ​​læsioner (B) og det samlede antal læsioner (C) er vist. * P 0,05. ** P. 0,01

data blev valideret af histopatologi som beskrevet nedenfor. Der var god overensstemmelse mellem histopatologi og

in vivo

billeddiagnostiske resultater. Med hensyn til tumorvækst blev observeret den største forskel mellem den 1. og 2. offer hvor CT-scanninger defineret procentvise tumorvolumener på henholdsvis 2,8% og 58,0%, henholdsvis. I en alder af 8,5 måneder (4th offer) var den procentvise tumorvolumen 69,3%. Diameteren og antallet af læsioner blev bestemt ved CT billeddannelse og ved histopatologi. Med NDEA de tumorbyrde øget tid hængigt fra 2,2 ± 0,3 mm (1st offer) til 6,5 ± 0,9 mm (figur 2B). Ligeledes tumor mangfoldigheden for NDEA behandlede dyr steg fra første til 2nd offer men faldt derefter muligvis som et resultat af fusionerende tumorer (Figur 2C).

tidsafhængig tumorvækst også afbildet i figur 3, hvor CT og PET scanninger af NDEA behandlede dyr blev erhvervet i en alder af 5,5 og 7 måneder. Her glukosemetabolismen i leverlæsioner blev bestemt ved in vivo

18F-FDG μPET billeddannelse.

(A) CT billedet viser en enkelt tumor læsion (A1) i en 5,5 måneder gammel mus uden øget

18F-FDG optagelse (A2). Det fusionerede CT og PET billede er afbildet i A3. (B) I en alder af 7 måneder ekspansiv tumor vækst (B1) samt en øget sporstof uptake i hepatocellulært carcinom (B2) overholdes. Det fusionerede CT og PET billede er afbildet i B3. G = galdeblæren, K = nyre, L = lever, S = ryg, St = mave, T = tumor.

For at give mulighed for præcis anatomisk lokalisering af fokal

18F-FDG optagelse, registrering og fusion af μCT og μPET datasæt erhvervet inden den kvantitative analyse af glukose imaging (se figur 3). Til dette formål blev dyrene anbragt i bugleje på en multimodale temperaturreguleret seng uden repositionering af dyr, når afbildningsmodaliteter blev ændret. Således blev dyr, der holdes under indånding anæstesi og i samme seng position mellem CT og PET-scanning for at tillade registrering af scanninger.

18F-FDG-optagelsen var hovedsageligt homogen blandt leverlæsioner. Nogle større læsioner vises et inhomogent optagelse af

18F-FDG, der var særligt fremtrædende i de perifere dele af tumoren. Inhomogen sporstofoptagelse var forbundet med cystiske og nekrotiske ændringer af tumoren støder op til vitale tumorvæv som vist ved histopatologi.

Generelt middelværdien tumor-til-ikke-tumor-forholdet var afhængig af tumorstørrelsen (figur 4). For læsioner større end 10 mm var det tumor-til-ikke-tumor-forhold 3,3 ± 0,6 og bestemt til at være statistisk signifikant forøget (p 0,05) sammenlignet med læsioner med en diameter på 5 til 10 mm (1,6 ± 0,2). For mindre læsioner tumor-til-ikke-tumor-forholdet var 0,98 ± 0,03, derfor tyder ingen stigning i

18F-FDG-optagelse sammenlignet med den normale leverparenkym.

Tumor-til-ikke- tumor-forholdet, bestemmes af PET glukose billedbehandling, blev øget betydeligt i læsioner 10 mm. * P 0,05. ** P. 0,01

Figur 5 opsummerer PET /CT billeddannelse og modalitet fusion af billeder opnået fra transgene mus behandlet med enten saltvand (figur 5A), BHT (figur 5B) eller NDEA (figur 5C ). Bemærk, i 1 ud af de 6 dyr behandlet med BHT en tumor . 10 mm blev observeret

Afbildet er leveren morfologi som bestemt ved CT (A1, B1, C1), glucosemetabolismen (A2 , B2, C2) og kondenserede PET- og CT-scanninger (A3, B3, C3) af transgene dyr behandlet med enten fysiologisk saltvand (A), med BHT (B) eller med NDEA (C) i en alder af 8,5 måneder. Bemærk, efter behandling med NDEA ekspansiv tumorvækst med stor stigning af lever vægt og kompression og forskydning af tilstødende organer blev observeret. Her viste læsionerne en forøget 18F-FDG-optagelse. I modsætning hertil tilsvarende kontroldyr behandlet med fysiologisk saltvand sås ingen leverlæsioner. Efter behandling med BHT lille hypodens læsioner er bemærket, men PET viste ikke en øget 18F-FDG optagelse. K = nyre, L = lever, S = ryg, Sp = milt, St = mave, T = tumor.

Desuden har behandling af transgene dyr med HEPATOTOXIN paracetamol fremprovokere tumorvækst som bestemt ved histopatologi (se nedenfor).

Validering af billeddiagnostiske resultater efter histopatologi

histopatologien dokumenteret normal lever med fuldstændig bevarelse af luftrør arkitektur, galdegangene og karrene parenkym i ikke-transgene mus. I vehikelbehandlede c-myc transgene dyr blev observeret diffus dysplasi (figur 6A). Et lille antal af transgene dyr, der modtog enten fysiologisk saltvand (1/24 dyr) eller majsolie (4/24 dyr) samt BHT behandlede dyr (3/24 dyr) vises uni- eller multifokale dysplastiske leverknuder erstatte 10-80 % af leverparenkym der varierede i størrelse mellem 1 og 10 mm. Disse foci bestod af forstørrede hepatocytter med et bevaret nukleart cytoplasmatisk forhold, uni- at ​​bicellular lag og en samlet nodulær arkitektur. Transgene dyr behandlet med paracetamol var ens i histopatologi som observeret med vehikelbehandlede kontroller (billedet ikke vist). Et dyr hver af majsolie og fysiologisk saltvand behandlede transgene dyr viste lille foci af hepatocellulært carcinom. Her cellestørrelsen var mindre sammenlignet med dysplastiske foci med en stigning i nuklear størrelse og en væsentlig fordrejning af arkitekturen afslørende flerlags trabecula og områder af cystiske pseudoglands.

(A) Diffus levercelle dysplasi af fysiologisk saltvand (= køretøj) behandlede transgene mus ved (A1) 50- og (A2) 200 ganges forstørrelse. (B) storcellet dysplasi af forskellige grader i BHT behandlede dyr på (B1) 50- og (B2) 200 ganges forstørrelse. (C) Hepatocellulært carcinom i en transgen mus behandlet med den genotoksisk carcinogen NDEA på (C1) 50 og (C2) 200 ganges forstørrelse.

Antallet, størrelsen og biologisk aggressivitet leverlæsioner var helt knyttet til NDEA behandling (figur 6C). Hepatocellulært carcinom med flerlaget trabekulær arkitektur blev observeret var pseudoglandular områder og til tider cystiske rum i tumorer. Af de 18 undersøgte dyr ved histopatologi 13 afslørede hepatocellulært karcinom hvoraf nogle (n = 10 dyr) vises dysplastiske knuder støder op til hepatocellulært carcinom samt. Desuden blev 3 dyr identificeret med dysplastiske knuder kun mens i 8 tilfælde HCC også var ledsaget af markant galdegang spredning. Alle HCC havde områder af flerlaget trabekulær arkitektur, de fleste afslørede også pseudoglandular områder undertiden med stor cystisk og peliosis-lignende rum. På grund af den tætte rumlige og tidsmæssige forhold dysplastiske knuder og HCC i lever fra de transgene dyr virkede det rimeligt at definere dysplastiske knuder som forstadier og tidlige læsioner af leverkræft. Her kan størrelsen af ​​læsioner anvendes som et middel til at skelne mellem leverlæsioner hvorved dysplastiske knuder var mindre end 5 mm og HCC var større end 10 mm.

Nogle dyr behandlet med NDEA viste metastase af den primære leveren kræft i lunge (figur 7B), men behandling med NDEA også induceret primær lungecancer som det fremgår af

in vivo

billedbehandling og histopatologi (Figur 7C). Således blev nogle dyr belastet af primær og sekundær tumorvækst i to forskellige organer.

(A) Normal lunge parenkym af et køretøj behandlet kontrol dyr som vist ved CT (A1) og ved histopatologi (A2). CT af NDEA behandlede dyr i en alder af 8,5 måned. Afbildet er lunge knuder af forskellig størrelse (røde pile). Histopatologi fremgår disse lungeknuder som metastase af en dårligt differentieret HCC (B2) og så godt adenocarcinom i lungerne (C2).

Nøjagtighed

fra in vivo

billeddannelse

Der var en yderst signifikant sammenhæng mellem levervolumen, beregnet ved halvautomatisk segmentering af CT-scanninger, og leveren vægt, bestemt

ex vivo

(korrelationskoefficient r = 0,99, p 0,001). Derudover den beregnede levervolumen korreleret med den estimerede tumorvolumen (r = 0,94, p 0,001). (Se figur S2)

I fig S3 leveren forhold til kropsvægten af ​​transgene mus behandlet med enten NDEA eller BHT er givet. Når tumorvolumen bestemt ved

in vivo

μCT og μPET billeddannelse blev sammenlignet med tumorområdet defineret ved histopatologi blev en rimelig opnåede korrelation (r = 0,82), således demonstrerer godhed

in vivo

imaging (data ikke vist).