PLoS ONE: Golden Berry-Derived 4β-hydroxywithanolide E for Selektivt Killing Oral Cancer Cells ved Generering ROS, DNA skader og Apoptotisk Pathways

Abstrakt

Baggrund

De fleste kemoterapeutiske lægemidler til at dræbe kræft celler er meget cytotoksisk i normale celler, hvilket begrænser deres kliniske anvendelser. Derfor er en fortsat udfordring at identificere et lægemiddel, der er overfølsomme over for kræftceller, men har minimal skadelige virkninger på sunde celler. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere potentialet af 4β-hydroxywithanolide (4βHWE) til selektivt at dræbe kræftceller og at belyse dens relaterede mekanismer.

Metode og vigtigste resultater

Ændringer i overlevelse, oxidative stress, DNA-skader, og apoptose signalering blev sammenlignet mellem 4βHWE-behandlede oral cancer (Ca9-22) og normal fibroblast (HGF-1) celler. Ved 24 timer og 48 timer, antallet af Ca9-22 celler var betydelig mindre, men antallet af HGF-1-celler faldt kun lidt. Derudover IC

50 med henblik på 4βHWE i Ca9-22 celler var 3,6 og 1,9 ug /ml ved 24 og 48 timer, hhv. Tidsafhængige unormale stigninger i ROS og dosis-responsive mitokondrie depolarisering kan udnyttes ved hjælp af 4βHWE i kemoterapi til selektivt at dræbe kræftceller. Dosis-afhængig DNA skade målt ved komet-kerneekstrakt assay og flowcytometri-baserede γ-H2AX /propidiumiodid (PI) analyse viste relativt strengere skader i Ca9-22 celler. Ved både lave og høje koncentrationer, 4βHWE foruroliget helst cellecyklus i Ca9-22 celler ved at øge subG1 befolkning og anholdelse af G1 eller G2 /M. Selektiv induktion af apoptose i Ca9-22 celler blev yderligere bekræftet ved Annexin V /PI assay ved præferentiel ekspression af phosphoryleret ataksi-telangiectasia- og Rad3-relateret protein (p-ATR), og ved spaltning af caspase 9, caspase 3, og poly ADP-ribose polymerase (PARP).

konklusioner /betydning

Sammen resultaterne af denne undersøgelse, især en øget forståelse af de selektive drab mekanismer 4βHWE, kan bruges til at forbedre effektiviteten dræbe mundtlige kræftceller under chemoprevention og terapi

Henvisning:. Chiu CC, Haung JW, Chang FR, Huang KJ, Huang HM, Huang HW, et al. (2013) Golden Berry-Derived 4β-hydroxywithanolide E for Selektivt Killing Oral Cancer Cells ved Generering ROS, DNA skader og apoptotiske veje. PLoS ONE 8 (5): e64739. doi: 10,1371 /journal.pone.0064739

Redaktør: Siyaram Pandey, University of Windsor, Canada

Modtaget 22. januar 2013; Accepteret: 17. april, 2013; Udgivet: 21. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Chiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Science Council (NSC101-2320-B-037-049), Department of Health, Executive Yuan, Kina (DOH102-TD-C-111-002), og National Sun Yat- Sen University-KMU fælles forskningsprojekt (# NSYSU-KMU 102-034). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Oral cancer er den sjette mest almindelige kræftform i verden [1]. Dens høje sygelighed og dødelighed er dels på grund af dens relativt dårlige kemoterapi resultater [2]. På grund af deres høje cytotoksicitet i normale celler, er de forskellige anti-orale cancerlægemidler udviklet hidtil begrænset terapeutiske anvendelser. Derfor er en fortsat udfordring er at udvikle en anti-oral cancer terapi, der er sikrere og mere effektive, navnlig hvad angår selektive drab effektivitet.

Uddrag af

Physalis peruviana

(golden bær), som er en spiselig plante i familien Solanaceae, sigende giver en anti-hepatoma virkning gennem apoptose [3]. Vores tidligere arbejde [4] fandt, at

P. peruviana

-afledt 4β-hydroxywithanolide E (4βHWE) har apoptotiske og antiproliferative virkninger på humane lunge kræftceller [4]. De 4βHWE withanolides er planteafledte C (28) steroide lactoner [5] med potente anti-cancer egenskaber [6]. Andre withanolides, såsom withaferin A, også efter sigende inducere apoptose i mange cancertyper, herunder brystcancer [7], melanom [8], og leukæmi [9].

akkumulerende beviser i de seneste undersøgelser viser, at selektiv aktivering af apoptose forbedrer effektiviteten af ​​cancerkemoterapi [10] – [15]. Til forbedret modulation af den apoptotiske potentiale cancerceller, en lovende linie af forskning er anvendelsen af ​​withanolides som selektivt dræber tumorceller, men har lav toksicitet i raske celler [13]. Men den potentielle anvendelse af apoptoseinducerende withanolides såsom 4βHWE [4] og withaferin A [7] – [9] til selektivt drab, især i orale cancerceller, er sjældent diskuteret

Derfor er denne undersøgelse. undersøgte potentielle effektivitet og relaterede mekanismer i

P. peruviana

-afledt 4βHWE bruges til selektivt at dræbe mundtlige kræftceller.

Materialer og metoder

cellekulturer og narkotika information

To cellelinjer, Ca9-22 (human gingival carcinom) [16] – [18] og HGF-1 (humant normalt gingival fibroblast) [19], blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) henholdsvis -F12 medium og DMEM-medium (Gibco, Grand Island, NY), suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 0,03% glutamin og 1 mM natriumpyruvat. Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Den 4βHWE (C

28H

38o

8; MW: 502,6). Blev fremstillet fra gylden bær ekstrakt som beskrevet i [4] og opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) til afprøvning

vurdering af vækstinhibering

Cellevækst blev målt ved (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium ( MTS) assay som beskrevet i [18]. Kort fortalt blev cellerne eksponeret for vehikelkontrol (DMSO) eller til 4βHWE i koncentrationer på 1, 2, 5 og 10 ug /ml for 24 h. cellerne blev derefter udsat for MTS-opløsning ( CellTiter 96 Aqueous One Solution, Promega, Madison, WI, USA) og fik lov til at inkubere i 1-2 timer ved 37 ° C. produktet blev målt ved 490 nm absorbans ved anvendelse af en Dynex MRX Model 96 Well Plate Reader (MTX Lab Systems, Inc., Vienna, VA, USA).

Vurdering af intracellulære reaktive oxygenarter (ROS)

Intracellulær ROS blev målt ved anvendelse af 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) som tidligere beskrevet [17]. efter 4βHWE behandling blev cellerne vasket med PBS og derefter inkuberet med 10 pM H2DCF-dA i PBS i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Celler blev derefter høstet og vasket med PBS. Efter centrifugering blev cellerne resuspenderet i PBS og analyseret med et FACSCalibur flowcytometer (Becton-Dickinson, Mansfield, MA, USA) med Win-MDI software (https://facs.scripps.edu/software.html) ved excitation og emission indstillinger på 480 og 525 nm

Vurdering af mitokondrie membranpotentiale

mitokondrie membran potentiale (ΔΨ

m MitoMP). blev målt ved hjælp af en MitoProbe ™ DiOC

2 ( 3) assay (Invitrogen, San Diego, CA, USA) som beskrevet i [16]. De 4βHWE-behandlede celler blev suspenderet i 1 ml varmt PBS med ca. 1 × 10

6 celler /ml, fyldt med 5 pi 10 pM DiOC

2 (3), og inkuberet ved 37 ° C i 5 % CO

2 for 20-30 min. Efter høst blev cellerne vasket, resuspenderet i PBS og analyseret med det samme under anvendelse af et flowcytometer med Win-MDI software ved excitations- og emissions- indstillingerne for 488 og 525 nm.

Vurdering af DNA-skade ved komet-NE assay

kerneekstrakt (NE) af HGF-1-celler blev anvendt til at udføre comet-NE assay ifølge en tidligere beskrevet protokol [4], [20] med lille modifikation. Kort fortalt blev cellesuspensioner blandedes med lige store volumener af 1,2% lav-smeltepunkt agarose, umiddelbart påført 1,2% regelmæssige agarose præcoatede objektglas, og derefter afkølet med is, indtil størkning. Det tredje lag med et lige volumen af ​​1,2% lavtsmeltende agarosegel blev derefter sat på den størknede anden gel og igen afkølet med is. Efter cellelyse behandling ved 4 ° C i 2 timer, blev objektglassene behandlet til NE fordøjelse med et dækglas og inkuberet ved 37 ° C i 2 timer i en befugtet rum. Denaturering af objektglassene i 0,3 N NaOH og 1 mM EDTA i 20 minutter blev efterfulgt af elektroforese. Efter vask blev objektglassene overført til 0,4 M Tris-HCl (pH 7,5), og 40 pi propidiumiodid (PI, 50 ug /ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) blev tilsat til fluorescensmikroskopi observation (TE2000-U , Nikon, Tokyo, Japan). I kometen assay blev et freeware program (https://tritekcorp.com), der anvendes til at måle DNA-skader i form af en procentdel af hale-DNA [21].

Vurdering af DNA-skader ved γ-H2AX /PI cytometri

Efter 4βHWE behandling blev cellerne fikseret i 70% ethanol, vasket to gange i BSA-T-PBS-opløsning (1% bovint serumalbumin og 0,2% Triton X-100 i PBS; Sigma), og inkuberet natten over ved 4 ° C i 100 pi BSA-T-PBS-opløsning indeholdende 0,2 ug p-histon H2A.X (Ser 139) monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Efter vask blev cellerne suspenderet i 1 time i en 1:100 fortynding af Alexa Fluor 488-mærket sekundært antistof (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). Efter endnu vask blev cellerne resuspenderet i 5 ug /ml PI for analyse med et FACSCalibur flowcytometer med Win-MDI software.

Vurdering af cellecyklusfordeling og sub-G1 population

PI-farvning blev udført som tidligere [20] beskrevne. Kort beskrevet blev celler behandlet med vehikel (kun DMSO) eller 0,5, 1, 2, 5, og 10 ug /ml 4βHWE i 24 og 48 timer. Efter høst blev cellerne fikseret natten over med 70% ethanol. Efter centrifugering blev cellepellets inkuberet med 10 pg /ml PI og 10 ug /ml RNase A i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Prøverne blev derefter analyseret med et FACSCalibur flowcytometer og Win-MDI software.

Vurdering af apoptose

Apoptose blev målt ved annexin /PI double-farvning (Pharmingen, San Diego, CA, USA) som tidligere beskrevet [22]. Kort beskrevet blev celler behandlet med vehikel eller med 4βHWE i doser på 1, 2, og 5 ug /ml for 24 timer. Cellerne blev derefter inkuberet med 10 ug /ml annexin V-fluoresceinisothiocyanat og 5 ug /ml PI og analyseret med et FACSCalibur flowcytometer (Becton-Dickinson) med Win-MDI software.

Western blotting

Western blot-assay blev udført som tidligere [23] beskrevne. Kort fortalt blev celler først høstes og lyseres. Lysater blev centrifugeret, og proteinkoncentrationer blev bestemt. De 40 ug proteinlysater blev adskilt ved 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese og derefter elektrooverført. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk. Membranerne blev derefter inkuberet med primære antistoffer mod phosphoryleret ataksi-telangiectasia- og Rad3-relateret protein (p-ATR) (# sc-109.912, Ser 428, Santa Cruz Biotech., CA, USA), spaltet caspase-9 (# 9501 , cellesignalering Technology, Beverly, MA, USA), spaltet caspase-3 (# IMG-144A, IMGENEX, San. Diego, CA, USA), spaltet poly ADP-ribose polymerase (PARP) (# 9541, Cell signaling Technology) og β-actin (# sc-8432, Santa Cruz Biotech.), og deres tilsvarende sekundære antistoffer. ECL ™ (Amersham Piscataway, NJ, USA) kemiluminescensdetektion kit blev derefter anvendt til signaldetektering.

Statistisk analyse

Alle data blev præsenteret som middelværdi ± SD. Gruppe forskelle i cellernes levedygtighed og cellecyklus blev vurderet ved hjælp af JMP® 9-software til at udføre envejs ANOVA med Tukey HSD post hoc test. Niveauer ikke forbundet med samme bogstav angivne væsentlige forskelle. Andre data blev analyseret ved Student

t

-test.

Resultater

Vurdering af væksthæmning

MTS analysen af ​​cellelevedygtighed efter 24 timer og 48 h behandling med 4βHWE (0, 1, 2, 5 og 10 ug /ml) viste, at der for hver forsøgsgruppe koncentration af 4βHWE, proliferation af Ca9-22 cancer oral celler var signifikant lavere end den for HGF-1 normale celler (en- vejs ANOVA) (figur 1). I HGF-1 celler, behandling med 10 ug /ml 4βHWE faldt en smule cellelevedygtighed til 89,02 ± 1,17% og til 65,42 ± 2,26% efter 24 timer og 48 t. I modsætning hertil levedygtigheden af ​​tilsvarende behandlet 4βHWE-behandlede Ca9-22 celler dramatisk faldt til 26,56 ± 2,22 og 16,01 ± 2,38 efter 24 timer og 48 timer, hhv. Den antiproliferative effekt af 4βHWE på Ca9-22 celler var både dosis-lydhør og tidsafhængig. Derudover IC

50 værdier var 3,6 og 1,9 pg /ml efter 24 timer og 48 timer henholdsvis i 4βHWE-behandlede Ca9-22 celler mens IC

50 blev opdaget i tilsvarende behandlet HGF-1 celler.

Celler blev behandlet med 0, 1, 2, 5, og 10 ug /ml 4βHWE i 24 og 48 timer. Data, middelværdi ± standardafvigelse (n = 3). Af samme lægemiddelkoncentrationer i fire forskellige grupper (Ca9-22 for 24 timer, Ca9-22 i 48 timer, HGF-1 til 24 timer, HGF-1 til 48 h), data ikke er forbundet af den samme bogstav ( øverste højre hjørne af SD) signifikant forskellig (envejs ANOVA med Tukey HSD post hoc test).

Vurdering af ROS

Nogle withanolides såsom withaferin et sigende inducere celledød i melanomceller ved at generere ROS [8]. Derfor er denne undersøgelse næste sammenlignede regulerer virkningerne af ROS på spredning af Ca9-22 og HGF-1 celler. Figur 2A og 2B viser ROS fluorescensintensiteter udtrykt i procentdele af Ca9-22 og HGF-1-celler var positive for DCFD-A, som blev talt efter behandling med 3,6 ug /ml 4βHWE i varierende tidsintervaller. Figur 2C viser den milde induktion af ROS observeret i HGF-1-celler sammenlignet med den relativt dramatiske tidsafhængige induktion af ROS i Ca9-22 celler. For hver eksperimentel koncentration af 4βHWE, procentdelen af ​​DCFD-A positive celler var signifikant højere i Ca9-22 oral kræftceller end i de normale HGF-1-celler (

P

0,0001).

Celler blev administreret et køretøj og 3,6 ug /ml 4βHWE i varierende tidsintervaller (0 til 5 h). For at måle ROS ændring, 200 uM H

2O

2 blev anvendt som en positiv kontrol. (A, B) repræsentant flowcytometri-baserede ROS profiler for 4βHWE-behandlede celler. (C) Kvantificering analyse af ROS intensitet udtrykt i DCFD-A positivitet (%). Stjernerne viser signifikante forskelle mellem to cellelinjer efter behandling med lignende koncentrationer 4βHWE (

t

-test,

P

0,0001 **).

Vurdering af mitokondrie membran potentialer (mitoMP)

Dernæst en DiOC

2 (3) assay blev udført for at undersøge virkningerne af 4βHWE-induceret ROS induktion på mitoMP. Figur 3A og 3B viser de mitoMP fluorescensintensiteter udtrykt i procentdele af DiOC

2 (3) -positiv Ca9-22 og HGF-1-celler efter 24 timers behandling med 0, 1, 2, og 5 ug /ml 4βHWE. Figur 3C viser, at mitoMP moderat nedsat i HGF-1-celler, men i det væsentlige reduceret i Ca9-22 celler på en dosisafhængig måde. For hver eksperimentel koncentration af 4βHWE, procentdelen af ​​celler positive for DiOC

2 (3) var signifikant lavere i Ca9-22 celler end i HGF-1-celler (

P

0,0005).

(A, B) repræsentant flowcytometri-baserede MitoMP profiler for 4βHWE-behandlede Ca9-22 og HGF-1-celler. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer (0-5 ug /ml) af 4βHWE i 24 timer. (C) Kvantificering analyse af MitoMP intensitet. Data er præsenteret som middelværdi ± SD’er% (n = 3). Stjernerne angiver statistisk signifikante forskelle mellem Ca9-22 og HGF-1 cellelinjer efter behandling med lignende koncentrationer af 4βHWE (

t

-test,

P

0,0005 **).

Vurdering af DNA-skader ved komet-NE assay

i kometen-NE assay (figur 4A), de “hale” effekter observeret i de Ca9-22 celler største ved høj 4βHWE koncentrationer. I modsætning hertil ingen af ​​de eksperimentelle 4βHWE koncentrationer inducerede en observerbar hale virkning i HGF-1-celler. Figur 4B viser, at HGF-1-celler viste ingen synlig stigning i% hale-DNA henviser Ca9-22 celler dramatisk viste forøget% hale-DNA i en dosis-respons måde. For hver eksperimentel koncentration af 4βHWE, DNA skader i form af% DNA i halerne af celler behandlet med 4βHWE var betydeligt mere alvorlig i HGF-1-celler end i Ca9-22 celler (

P

0,0001) .

(A) Repræsentative komet PI farvningsresultater for cellekontroller (DMSO) og celler behandlet med 0,5, 1, 2, og 5 ug /ml 4βHWE i 2 timer. Kernerne vises som røde pletter, og haler pletterne efter hvor DNA-skade efter 4βHWE behandlinger. (B) Gennemsnit af den% af halen DNA i 4βHWE-behandlede Ca9-22 og HGF-1 celler. Data, middelværdi ± standardafvigelse (kerner = 50). Stjerner angiver signifikante forskelle mellem Ca9-22 og HGF-1 cellelinjer efter behandling med lignende koncentrationer 4βHWE (

t

-test,

P

0,0001 **).

Vurdering af DNA-skader ved γ-H2AX /PI cytometri

for yderligere bekræftelse af involvering af DNA-skader i 4βHWE-induceret hæmning af væksten i Ca9-22 cancer oral celler, DNA dobbelt streng pause (DSB) blev målt ved γ-H2AX ekspression. Figur 5A viser γ-H2AX /PI farvningsprofiler opnået efter 24 timer behandlinger med positiv kontrol eller med 0, 0,1, 0,25, 0,5 og 1 ug /ml 4βHWE. Figur 5B viser, at efter behandling med 4βHWE koncentrationer lavere end 2 pg /ml, HGF-1 celler opretholdt lave niveauer af γ-H2AX ekspression henviser Ca9-22 celler viste dramatiske dosisafhængige stigninger i γ-H2AX ekspression. Ved højere koncentrationer af 4βHWE imidlertid fold ændring i% af γ-H2AX-positive celler var signifikant større i Ca9-22 celler end i HGF-1-celler (

P

0,0005).

Celler blev behandlet med 0, 1, 2, og 5 ug /ml 4βHWE i 24 timer. (A) repræsentant flowcytometri-baserede DSB profil for 4βHWE-behandlede Ca9-22 og HGF-1-celler. Celler behandlet med 5 pM camptothecin (CPT) i 24 timer blev anset γ-H2AX positive kontrol. (B) Kvantificering analyse af fold ændringer i γ-H2AX-baserede DNA-skader i 4βHWE-behandlede Ca9-22 og HGF-1-celler. Data, middelværdi ± SD. Stjernerne angiver statistisk signifikante forskelle mellem Ca9-22 og HGF-1 celler behandlet med lignende koncentrationer 4βHWE (

t

-test,

P

0,0005 ** n = 2 og 3, henholdsvis).

Vurdering af cellecyklusfordeling

Figur 6 viser, at efter 24 timers behandling med 4βHWE, den procentvise ændring i sub-G1 befolkninger i HGF-1 celler ikke var statistisk signifikant ved koncentrationer lavere end 2 pg /ml. Den procentvise ændring i sub-G1 svagt forøget til 2,75%, når koncentrationen nåede 5 ug /ml. I modsætning hertil den procentvise ændring i sub-G1 i Ca9-22 celler behandlet med 4βHWE i 24 timer begyndte at vise betydelige ændringer i koncentrationer så lave som 2 ug /ml og til sidst nåede 30,59%. Efter 48 timer behandling, var procentdelen af ​​sub-G1 populationer i HGF-1-celler moderat øget til 25,03% og 29,42% efter behandling med 2 og 5 ug /ml 4βHWE hhv. I modsætning hertil procentdelen af ​​sub-G1 i Ca9-22 celler behandlet med 4βHWE i 48 timer viste en statistisk signifikant ændring (42.76%) efter behandling med 1 ug /ml og en meget større ændring (78,89%) efter behandling med 5 ug /ml.

Celler blev behandlet med 0, 1, 2, og 5 ug /ml 4βHWE i 24 timer og 48 timer. (A) Repræsentant cellecyklus distribution i 4βHWE behandlet Ca9-22 og HGF-1 celler. (B) Cell fase procentdele opnået for (A) i tredobbelte forsøg. For den samme fase af forskellige koncentrationer narkotika, data ikke forbundet med samme bogstav (øverst til højre på SD) signifikant forskellig (envejs ANOVA med Tukey HSD post hoc test).

På 24 timer, analyser af G1 og G2 /M befolkninger i HGF-1-celler viste en ikke-væsentlig ændring i G1 befolkning og et basalt niveau af ændringer i G2 /M forurening. I modsætning hertil efter 24 timers 4βHWE behandling viste Ca9-22 celler betydelige ændringer i G1 arrest (57.49% og 40.75% ved 0,5 og 1 ug /ml) og i G2 /M arrest (50.44% og 62,08% ved 1 og 2 pg /mL). Efter 48 h behandling med 5 ug /ml βHWE, G1 befolkningen i HGF-1 celler faldt en smule til 56,27%, mens G2 /M befolkning steget en smule. I modsætning hertil viste Ca9-22 celler betydelig (79,23%) G1 arrest efter 48 timers behandling med en 4βHWE koncentration på kun 0,5 ug /ml. I G2 /M befolkning, behandling med 1 pg /ml 4βHWE resulterede i moderat (27,34%) G1 anholdelse kombineret med dramatiske subG1 ophobninger som beskrevet ovenfor.

Vurdering af apoptose

For at undersøge inddragelse af apoptose i 4βHWE-induceret sub-G1 ophobning, flowcytometri-baserede annexin V /PI double-farvning blev udført. Figur 7A viser γ-H2AX /PI farvningsprofiler af HGF-1 og Ca9-22 celler behandlet med varierende 4βHWE koncentrationer. De dobbelte positive områder af y-H2AX og PI intensiteter defineres almindeligvis som sen apoptose. Analyser af sen apoptose (figur 7B) viste en mild dosisafhængig stigning i HGF-1-celler, men en dramatisk dosisafhængig stigning i Ca9-22 celler. For hver eksperimentel koncentration af 4βHWE, procentdelen af ​​celler, der undergik sent apoptose efter 4βHWE behandling var signifikant højere i Ca9-22 celler end i HGF-1 celler (

P

0,0001).

Celler blev behandlet med 0, 1, 2, og 5 ug /ml 4βHWE i 24 timer. (A) Repræsentative apoptotiske profiler opnået ved Annexin V /PI dobbelt farvning i 4βHWE-behandlede Ca9-22 og HGF-1-celler. (B) Kvantificering analyseresultater for sen apoptose befolkning (%). Kun annexin V (+) /PI (+) regioner blev analyseret. Data, middelværdi ± standardafvigelse (n = 3). Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle mellem to cellelinjer (Ca9-22 og HGF-1), der blev behandlet med lignende koncentrationer 4βHWE (

t

-test,

P

0,0001 **).

Vurdering af apoptotiske signaler

apoptotisk signalering blev undersøgt ved Western blotting assays af Ca9-22 og HGF-1 celler behandlet med forskellige koncentrationer af 4βHWE (0, 1, 2, og 5 ug /ml). Figur 8 viser, at stigende koncentrationer af 4βHWE inducerede trinvise stigninger i ATR phosphorylering forbundet med cellulære DNA-skader i Ca9-22 celler. Spaltning af caspase 9, caspase 3 og PARP blev også induceret i Ca9-22 celler, især ved 4βHWE koncentrationer på 2 ug /ml og 5 ug /ml. I modsætning hertil 4βHWE ikke udløse enten ATR phosphorylering eller aktivering af caspase kaskade i HGF-1-celler. Salg

Celler blev behandlet med 0, 1, 2, og 5 ug /ml 4βHWE i 24 timer. Apoptose signalering proteiner, såsom p-ATR, og spaltning af pro-caspase 9, blev påvist pro-caspase 3 og PARP. Den β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Hver blot repræsenterer et uafhængigt forsøg udført tre gange.

Diskussion

withanolides er plante-afledt C (28) steroide lactoner med potent anti-cancer aktivitet [24], [25] . Men brugen af ​​withanolides til selektiv aflivning cancerceller er ikke blevet intensivt undersøgt. Withaferin A vides at inducere apoptose i mange cancertyper, herunder leukæmi [9], melanom [8], og kræft i bryst [7], lever [26], pancreas [27], colon [28], lunge [29 ], og prostata [30]. I tidligere undersøgelser, XTT analyser udført efter 24 timers behandling med withaferin A viste IC

50 værdier på 2 um i leukæmiceller (HL-60) [31], 4 uM i prostata kræftceller (PC3) [30], og 6 uM i hepatom (SK-HEP1), coloncancer (HT29), og nyrecancer (Caki) celler [26]. Rapporteret IC

50 værdier opnået ved MTT-analyser af brystkræftceller (MDA-MB-231) omfatter 13 uM for anomanolide A, 15 uM for tubocapsanolide E, og 20 uM for tubocapsenolide B, tubocapsanolide C, og peruvianolide H [ ,,,0],6].

for nylig withanolide afledt af Ashwagandha blad ekstrakt [32] har vist en potentiel rolle i selektivt drab brystkræft MCF7-celler ved en koncentration på 24 ug /ml [33]. Den nuværende undersøgelse viste ligeledes, at IC

50 værdier af Ca9-22 orale cancerceller var 3,6 ug /ml (7,16 um) og 1,9 ug /ml (3,78 uM) efter 24 timer og 48 timer behandling med 4βHWE hhv. Vi hypotesen, at den selektivt drab effekt af 4βHWE kan være sammenlignelige eller endnu mere potent i andre orale cancercellelinier. I HGF-1-celler imidlertid IC

50 værdier var ikke kan påvises ved MTS assay ved koncentrationer på under 10 pg /ml. I andre undersøgelser af 4βHWE behandlinger for 24 timer blev en IC

50 værdi på 6 uM rapporteret i en MTT-analyse af brystcancer MDA-MB-231-celler [6] og en IC

50 værdi på 1,41 uM var rapporteret i en trypanblåt assay for lungekræft H1299 celler [4]. Disse data indikerer, at stoffet følsomhed 4βHWE varierer efter cancer celletype. Endvidere vil den nuværende undersøgelse er den første til at bekræfte, at 4βHWE dræber orale cancerceller fortrinsvis til normale orale celler.

Endvidere beskyttende virkninger withanolides findes i normale fibroblastceller. F.eks withanone afledt af Ashwagandha blad beskytter normale humane fibroblaster mod methoxyeddikesyre-induceret senescens-lignende vækststandsning i form af senescens-associerede β-galactosidase-farvning [34]. Ligeledes den nuværende undersøgelse viste, at morfologien af ​​HGF-1-celler behandlet med 1, 2, og 5 ug /ml 4βHWE var svarende til den i ubehandlet fibroblast HGF-1-celler (data ikke vist). Yderligere undersøgelser af vækst anholdelse fænotyper er nødvendige for at afgøre, om 4βHWE er sikkert for normale celler.

Selvom akkumulere beviser enig i, at withanolides inducerer ROS-medieret apoptose, deres potentielle anvendelse til selektivt at dræbe cancerceller er relativt uklart. F.eks withaferin A vides at inducere ROS-medieret apoptose i brystcancer [7], melanom [8], og leukæmi [9], [31]. Selvom forventes kræftceller til at have højere oxidativt stress i forhold til normale celler [35], kan normale celler tolerere en exogen oxidativ stress-niveau er tilstrækkeligt til at forhindre overbelastning resulterer i celledød. I modsætning hertil kan cancerceller udsat for høj oxidativt stress ikke tolerere exogene ROS-modulerende midler, og celledød øges som tærskel er overskredet [36]. Dette koncept kan til dels forklare de selektive drab virkninger af 4βHWE i orale kræftceller observeret her og de withanone i brystkræftceller som rapporteret i [33], dvs. både ROS induktion og reduktion af mitochondriemembranpotential er højere i kræftceller sammenlignet til normale celler. Disse resultater tyder på, at terapier for selektivt at dræbe kræftceller bør være rettet mod at modulere redox status i både kræftceller og normale celler [36]. Men roller caspaser og caspaseinhibitorer [37] i 4βHWE-induceret selektiv apoptose brug for yderligere undersøgelse.

ROS-medierede virkninger af withanolides kan moduleres af antioxidanter. For eksempel kan N-acetylcystein efter sigende redde humane melanomceller fra withaferin A-induceret, ROS-medieret apoptose [8]. Følgelig kan rolle ROS i det selektive drab på 4βHWE præciseres yderligere ved at studere ROS modulatorer.

ROS er kendt for at inducere DNA-skader og checkpoint respons [38]. For eksempel komet-NE og γ-H2AX assays i denne undersøgelse viste, at 4βHWE induceret DNA-ødelæggelse og G1 eller G2 /M cellecyklusstandsning, som begge er blevet observeret tidligere i andre withanolides. F.eks tubocapsanolide A sigende inhiberer proliferation af lunge cancer A549 celler via G1 arrest [39]. Imidlertid 4βHWE [4] og withanone [33] vides at inducere DNA-beskadigelse og derefter standsning ved G2 /M i lungekræft H1299 celler og i brystcancer MCF-7 celler.

Selektiv DNA-beskadigelse ( dvs., DSB) kan overvåges af H2AX, som phosphoryleres i en ATR-afhængig måde [40]. Den H2AX hjælper også til at stabilisere genomet [41] og er afgørende for caspase-aktiveret DNA fragmentation [42]. Som forventet 4βHWE behandling induceret højere udtryk for ATR og caspase signalering proteiner i Ca9-22 celler sammenlignet med HGF-1 celler.

Efter 24 timers behandling med 2 mg /ml 4βHWE, Ca9-22 og HGF-1 celler viste celle levedygtighed (%) for 56,09 ± 1,78 og 92,81 ± 2,20 (Figur 1); mitoMP (%) af 61,18 ± 3,21 og 99,81 ± 0,74 (figur 3); γ-H2AX (fold) af 8,47 ± 0,54 og 0,73 ± 0,19 (figur 5); subG1 populationer (%) af 14,74 ± 0,30 og 1,32 ± 0,15; G2 /M anholdelser af 62,08 ± 1,03 og 15,89 ± 0,19 (figur 6) sen apoptose (%) af 13,80 ± 1,05 og 7,97 ± 0,06 (figur 7); og over- og under-ekspressionen af ​​apoptose signalering proteiner (figur 8), hhv. Disse resultater konsekvent viste virkningerne af 4βHWE i form af selektive drab, selektiv mitokondriel dysfunktion, selektiv DNA-skader (dvs. DSB), selektiv G2 /M anholdelse, og selektiv apoptose af Ca9-22 celler fortrinsvis til HGF-1 celler. Efter lignende behandling med 3,6 ug /ml 4βHWE i 2 timer, den Ca9-22 og HGF-1 celler viste ROS induktion (%) af 158,83 ± 0,34 og 108,63 ± 1,04 (figur 2) og komet-NE-baserede DNA-beskadigelse af 29,21 ± 5,93 og 0,27 ± 0,52 (figur 4), henholdsvis. Disse resultater bekræftede yderligere, at 4βHWE behandling selektivt inducerer ROS og DNA-skader i Ca9-22 celler frem for HGF-1 celler.

Som konklusion, at resultaterne af denne undersøgelse bekræfter, at 4βHWE behandling selektivt inducerer ROS, mitokondrie depolarisering og DNA-beskadigelse, som igen inducerer selektiv apoptose signalering, hvilket i sidste ende resulterer i selektivt drab af orale cancerceller (figur 9). Følgelig viste denne undersøgelse, for første gang, at 4βHWE behandling selektivt dræber orale cancerceller frem for normale orale celler. Yderligere undersøgelse af mål kandidater og signalanlæg mekanismer rapporteret her kan også give en tilstrækkelig øget forståelse af de selektive drab mekanismer 4βHWE at muliggøre en effektiv anvendelse til behandling af kræft i mundhulen med minimale bivirkninger.

Ændringer i Ca9-22 celler er angivet med blå pile. Normale orale celler (ikke vist) viste relativt mindre ændringer i forhold til Ca9-22 celler. I Ca9-22 behandlet med 4βHWE, forstærket ROS-generering resulterede i øget oxidativt stress. Induktionen af ​​ROS derefter forøget mitokondriel dysfunktion og lettes reduktion af mitochondriemembranpotential i Ca9-22 celler. Induktion af ROS resulterede også i øget DNA skader i Ca9-22 celler, fx, γ-H2AX i DSB, som derefter induceret ATR phosphorylering. Sammen mitochondriebeskadigelse signalering og DNA skader signalering resulteret i øget apoptose signalering, som derefter førte til selektiv apoptose og drab på Ca9-22 celler.