PLoS ONE: IL-6 Stabiliserer Twist og Forbedrer tumorcellemotilitet i hoved-halscancer celler gennem Aktivering af Caseinkinase 2

Abstrakt

Baggrund

Planocellulært karcinom i hoved og hals (SCCHN) er den syvende mest almindelige kræftform i verden. Desværre har overlevelsen af ​​patienter med SCCHN ikke forbedret i de sidste 40 år, og der er behov derfor nye mål for terapi. For nylig blev der fundet stigninger i serumniveau af interleukin 6 (IL-6) og ekspression af Twist i tumorprøver at være forbundet med dårlige kliniske resultater i mange forskellige typer cancer, herunder SCCHN. Selvom Twist er blevet foreslået som en mester regulator af epitelial-mesenkymale overgang og metastaser i kræft, de mekanismer, hvormed Twist niveauer er reguleret posttranslationelt er ikke helt forstået. Tumorprogression er karakteriseret ved inddragelse af cytokiner og vækstfaktorer og Twist induktion er blevet forbundet med et antal af disse signalveje, herunder IL-6. Da mange af virkningerne af IL-6 medieres gennem aktivering af protein phosphorylering kaskader, indebærer dette, at Twist udtryk skal være under en stram styring på det post-translationel niveau for at reagere i tide på ydre stimuli.

Metode /vigtigste resultater

Vores data viser, at IL-6 stiger Twist udtryk via en transskription-uafhængig mekanisme i mange SCCHN-cellelinier. Yderligere undersøgelser afslørede, at IL-6 stabiliserer Twist i SCCHN-cellelinier gennem caseinkinase 2 (CK2) phosphorylering af Twist rester S18 og S20, og at denne phosphorylering hæmmer nedbrydningen af ​​Twist. Twist fosforylering ikke kun øger dens stabilitet, men også forbedrer celle motilitet. Således posttranslationel modulering Twist bidrager til dens tumorfremmende egenskaber.

Konklusioner /Betydning

Vores undersøgelse viser Twist udtryk kan reguleres ved post-translationel niveau gennem fosforylering af CK2, hvilket øger Twist stabilitet som respons på IL-6 stimulation. Vores resultater ikke kun give nye mekanistiske indsigt i post-translationel regulering af Twist, men også foreslå, at CK2 kan være en levedygtig terapeutisk mål i SCCHN

Henvisning:. Su YW, Xie TX, Sano D, Myers JN (2011 ) IL-6 Stabiliserer Twist og Forbedrer tumorcellemotilitet i hoved-halscancer Cells gennem Aktivering af Caseinkinase 2. PLoS ONE 6 (4): e19412. doi: 10,1371 /journal.pone.0019412

Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: December 22, 2010; Accepteret: 31 marts 2011; Udgivet: 29 April, 2011

Copyright: © 2011 Su et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde er krediteret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af The University of Texas MD Anderson Cancer center SPORE i hoved- og halscancer tilskud P50 CA097007, National Institutes of Health Cancer center Support tilskud CA016672, og Pantheon og Broudy “Forpligte sig til at helbrede” fundamenter. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

pladecellekræft i hoved og hals (SCCHN) er den syvende mest almindelige kræftform i verden [en]. Trods forbedringer i kirurgiske og stråling terapi teknikker, har 5-års overlevelse ikke forbedret betydeligt i de seneste årtier og er stadig på 50-55%. Selvom lokalt recidiv og hals lymfeknudemetastaser tegner sig for størstedelen af ​​dødsfaldene fra denne sygdom, kun 10-20% af patienterne gavn af integrationen af ​​systemisk kemoterapeutisk behandling, med marginalt forbedret overlevelse og betydelige toksiske virkninger [2], [3]. Der er derfor behov nye mål for terapi

For nylig blev fundet overekspression af Twist i kliniske tumorprøver at være korreleret med metastase og dårlig prognose hos patienter med SCCHN samt andre cancere [4] -. [7] . Twist er et højt konserveret basisk helix-loop-helix transcription faktor, der spiller en vigtig rolle ved at lette celle bevægelse i udviklingen af ​​embryoner. I cancerceller, er Twist betragtes som et onkogen, som dets forhøjede ekspression fremmer sygdomsprogression og metastase ved at inducere epitel-mesenkymale overgang (EMT) [8].

Trods dens betydning i tumorprogression, posttransskriptionel regulering af Twist er ikke godt forstået

En sammenlignende analyse af Twist mRNA og Twist proteinekspression i musefostre viste rigelige Twist RNA udtryk i presomitic mesoderm, epitel somitter, og forreste mesoderm, men ingen Twist protein kunne findes i disse væv [9]. Forskellen blev også bemærket i løbet af mus embryo udvikling, som Twist RNA når sit højeste niveau på 7,0 dage efter coitum mens ingen Twist protein kunne findes før 8,25 dage efter coitum. Den manglende overensstemmelse mellem Twist mRNA ekspression og Twist proteinekspression indikerer, at Twist udtryk styres på post-transkriptionelle niveau [9]. Posttranskriptionel modifikation af transkriptionsfaktorer, herunder phosphorylering og ubiquitinering, har vist sig at være vigtige for deres funktion, da dette tilvejebringer en mekanisme, ved hvilken cellen hurtigt kan iværksætte transskriptionelle programmer som svar på ydre stimuli. For eksempel er det blevet rapporteret, at Twist kan nedbrydes gennem ubiquitin /proteasom nedbrydningsvej, som behandling med en proteasominhibitor inhiberer nedbrydning af Twist [10]. Der er også tegn på, at funktionen af ​​Twist kan moduleres ved phosphorylering [11], [12]. Eftersom fosforylering ofte er involveret i reguleringen af ​​et proteins ubiquitin /proteasom-afhængige nedbrydning [13], vi hypotese, at phosphorylering af Twist øger dens stabilitet ved at øge sin relative udtryk niveau.

SCCHN tumorigenese og progression er kendt for at påvirkes af flere vækstfaktorer og cytokin-signalering faktorer, herunder interleukin 6 (IL-6) [14] – [17]. I SCCHN patienter, forhøjet serum IL-6-niveau korrelerer med dårlig overlevelse og ugunstige kliniske resultat [14], [15], [18]. IL-6, fremstilles enten ved at infiltrere immunceller eller tumorceller, giver ikke kun overlevelsessignaler for cancerceller, men også letter motilitet af cancerceller gennem EMT [19], [20]. Den traditionelle IL-6 signalvej er gennem binding med sIL-6-receptor (gp80), som inducerer dimerisering af gp130 og efterfølgende aktivering af enten Janus-kinaser (JAK) /STAT3 i en transkription-afhængig måde, eller Ras-MAPK og PI3K /Akt vej [21]. Foruden kanoniske veje, caseinkinase 2 (CK2) er også for nylig blevet rapporteret nedstrøms for IL-6-signalering i kræft [22].

CK2 er en stærkt bevaret og ubikvitært serin /threonin-kinase, som består af to katalytiske (α eller α ‘) og to p regulatoriske underenheder [23]. Betydningen af ​​CK2 underenheder kan påvises ved genetiske undersøgelser viser, at mus, som mangler CK2α eller CK2β er embryonale letale mens CK2 a’knockout-mus havde mangler kun i spermatogenese [24] – [26]. CK2 er for nylig kommet for at blive betragtet som en “master-kinase”, da den styrer aktiviteten af ​​mange andre kinaser og er involveret i mange vigtige cellulære processer [27]. F.eks CK2 styrer stabilitet kBa og PML tumor suppressor gennem phosphorylering og ændring af deres ubiquitin /proteasom nedbrydning [28], [29]. CK2 er blevet rapporteret at blive overudtrykt og at korrelere med ringe overlevelse på mange tumortyper, herunder SCCHN [30] -. [32] Traditionelt er CK2 betragtes som en grundlæggende aktiv proteinkinase, men flere undersøgelser har vist, at CK2 kan reagere på mange vækstfaktor stimuli, herunder IL-6 [22], [33], selv om mekanismerne i dets aktivering stort set uklar [34 ].

det er blevet rapporteret, at STAT3, de store nedstrøms signal af IL-6-vejen, kan transkriptionelt aktivere ekspressionen af ​​Twist [35], [36]. Vores foreløbige data viste imidlertid, at Twist proteinekspression blev øget med IL-6 før opregulering af Twist-mRNA i multiple aggressive SCCHN-cellelinier, hvilket antyder en transkription-uafhængig regulering af Twist af IL-6. Da mange af virkningerne af IL-6 medieres via aktivering af proteinphosphoryleringsbegivenheder kaskader [21], og substratphosphorylering er ofte involveret i regulering af et proteins ubiquitin /proteasom-afhængige nedbrydning [37], vi postulerede, at Twist ekspression reguleres af IL-6-aktiveret phosphorylering.

i denne undersøgelse viser vi, at behandling af SCCHN-cellelinier med IL-6 fører til stabilisering af Twist-proteinet. Yderligere undersøgelser viste, at IL-6 stimulerer Twist fosforylering gennem aktivering af CK2 serin /threoninproteinkinase. Vores resultater ikke kun give en roman mekanistisk indsigt, Twist aktiveres gennem fosforylering af CK2 kinase, men også har betydelige konsekvenser for prognosticering og behandling af hoved-halscancer.

Resultater

Twist udtryk opreguleres kort efter IL-6 behandling

Mest SCCHN og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier secernerer IL-6 og udtrykke receptorer for IL-6 (tabel S1 og fig S1) [38]. At undersøge virkningen af ​​IL-6 til disse cellelinier blev Twist ekspression undersøgt langs tidsforløbet af behandlingen. Western blots fra repræsentative cellelinier er vist i figur 1A. Twist-ekspression blev induceret i disse celler inden for 15 minutter efter behandling med IL-6. I modsætning hertil Twist mRNA niveauer forblev uændret over en tilsvarende behandlingsperiode (figur 1B). Disse data indikerer, at Twist ekspression reguleres af IL-6 ved post-transkriptionel niveau.

(A) Twist-protein blev induceret kort efter IL-6 behandling i SCCHN-celler (OSC-19, HN31) og lungecancerceller (A549). Efter serumudsultning natten over, celler blev underkastet IL-6 behandling (20 ng /ml for 0-4 h), og Twist ekspression i cellelysater blev analyseret ved western blot. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) Twist mRNA ekspression som kvantificeret ved real-time RT-PCR forblev meste uændret gennem IL-6 behandling (0-6 timer). Værdier blev normaliseret til ekspressionsniveauerne af husholdning genet

GAPDH

, og er udtrykt som middelværdien fold ændring fra basisniveauet ± s.e.m. For hvert tidspunkt blev to til fire gentagelser udført. Alle forsøg blev udført to gange for hver cellelinie. Data fra et repræsentativt eksperiment med OSC-19 SCCHN-celler er vist. (C) Twist nedbrydning blev inhiberet ved enten MG132 eller IL-6. Efter OSC-19 SCCHN-celler blev behandlet med CHX (100 uM), CHX plus proteasominhibitor MG132 (10 uM), eller CHX plus IL-6 (20 ng /ml) i 0-4 timer blev Twist ekspression bestemt ved western blot. (D) De pixels i hvert bånd i (C) blev målt af Image J og normaliseret, således at antallet af pixel ved tid 0 var 100%. Dataene er plottet som log

10 af den relative pixeltæthed (y-akse) versus tid (min). Halveringstiden blev bestemt ud fra log af 50% relativ pixeltæthed. Halveringstiden for Twist var 1,2 time i nærværelse af CHX alene og . 4 timer i nærværelse af CHX + IL-6

Denne iagttagelse, at IL-6 opregulerer Twist udtryk post- transkriptionelt førte os til at undersøge, om nedbrydning af Twist blev til gengæld moduleres af IL-6 behandling. De nedbrydningshastigheder af Twist i SCCHN-celler blev undersøgt ved behandling med proteinsynteseinhibitor cycloheximid (CHX) alene, CHX plus proteasominhibitor MG132 eller CHX plus IL-6. Mængden af ​​protein ved hvert tidspunkt blev bestemt ved Western blot og kvantificeres ved densitometri. Som vist i figurerne 1C og 1D, endogen Twist havde en 1,2-h halveringstid men når enten IL-6- eller MG132 blev tilsat, mindre Twist var nedbrudt, og det ikke nå dets halveringstid i behandlingsperioden 4-h . Dataene er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, der viser, at Twist protein nedbrydes gennem proteasomet nedbrydning systemet [10], og indikerer, at Twist protein er stabiliseret posttranslationelt ved hæmning af nedbrydning af IL-6.

Twist phosphoryleres som reaktion på IL-6 behandling, og CK2 er fundet i vejen mellem IL-6 og Twist

Fordi IL-6 er blevet vist at aktivere flere celle signalveje gennem aktivering af protein kinase kaskader, vi næste undersøgt, om Twist phosphoryleres som reaktion på IL-6 behandling. Celler transficeret med et plasmid, der koder for en hemagglutinin (HA) -Twist fusionsprotein blev behandlet med IL-6; efterfølgende immunopræcipitation med et HA-antistof og western blotting under anvendelse af en ikke-specifik phosphoserin antistof afslørede forøget phosphorylering af serin /threoninrester i Twist (figur 2A), hvilket bekræfter, at Twist phosphoryleres som reaktion på IL-6-stimulering.

(A ) Twist blev phosphoryleret i respons på IL-6 behandling. OSC-19 SCCHN-celler blev transficeret med enten HA-Twist plasmid eller kontrolvektoren i 48 timer, derefter behandlet med IL-6 (20 ng /ml) i 30 min; behandlede og ubehandlede cellelysater blev immunpræcipiteret med HA-antistof og analyseret ved western blot med et uspecifikt phosphoserin antistof. (B) Inhibitorer til kendte nedstrøms veje for IL-6 var i stand til at inhibere Twist opregulering af IL-6. OSC-19 SCCHN-celler blev forbehandlet med de angivne kinaseinhibitorer eller dimethylsulfoxid (DMSO, kontrol) i 1 time, derefter blev behandlet med IL-6 (20 ng /ml) i 30 min. Twist-ekspression blev bestemt ved Western blot. (C) Den CK2 phosphoryleringssite (SNSE) Twist, forudsagt ved anvendelse af https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml, er bevaret på tværs af arter. (D) CK2-aktivitet blev øget med IL-6 og inhiberes af CK2 inhibitor DMAT i SCCHN-celler. Efter serumudsultning natten over, blev lysater af HN31 celler behandlet med PBS (kontrol), IL-6 (20 ng /ml, 30 min), eller IL-6 plus DMAT (10 uM) opsamlet. Endogen CK2 aktivitet i cellelysaterne (5 ug) blev målt under anvendelse af et syntetisk peptid CK2 substrat (RRRADDSDDDDD; 0,1 mM) og γ-

32P-ATP som phosphatdonor som tidligere beskrevet [49]. Y-aksen repræsenterer tællingen per minut (CPM) af radioaktiviteten efter normalisering til no-substrat kontrol. *

P

0,05 af Student

t

-test. (E) IL-6-induceret Twist-ekspression blev inhiberet af CK2 inhibitorer. Twist ekspression blev målt efter behandling med IL-6 (30 min) i lysater af OSC-19 SCCHN eller A549 lungecancerceller tidligere inkuberet i CK2 hæmmere DMAT eller TBB (1 h). Twist-ekspression blev inhiberet ved doser så lave som 0.8 uM og blev ikke begrænset til en bestemt cellelinie. (F) Knockdown af den katalytiske subunit af CK2 (CK2α) ved shRNA inhiberede Twist proteinekspression. Knockdown af CK2α i OSC-19 SCCHN celler i 24 timer betydeligt reduceret Twist udtryk og blokeret sin induktion af IL-6 behandling (20 ng /ml, 30 min).

For at identificere kinase ansvarlig for IL-6-induceret phosphorylering af Twist, anvendte vi en kemisk inhibitor screening strategi at afgøre, om IL-6-medieret Twist opregulering kan blokeres af kinaseinhibitorer vides at være nedstrøms for signalvejen. Twist blev opreguleret af IL-6 til trods for anvendelse af inhibitorer blokerer JAK (AG490), PI-3K (Wortmannin), Erk (U0126), p38 MAPK (SB202130), eller juni

N

terminal kinase (SP600125) , hvilket indikerer, at Twist opregulering er uafhængig af disse veje (figur 2B). Da ingen af ​​de kendte veje, som vi testede syntes at være involveret i mediering af IL-6-induceret Twist ekspression, vi næste scannet aminosyresekvensen i den beregningsmæssige proteinfamilie forudsigelse webserver https://scansite.mit.edu/motifscan_seq.phtml og identificeret en CK2 substrat konsensus motiv (SNSE) inden Twist på resterne 18 til 21, der er bevaret på tværs arter (Figur 2C)

CK2 er en serin /threonin kinase.; stigende nyere undersøgelser viser, at det kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​SCCHN [32], [39]. Det blev tidligere betragtet som en konstitutivt aktiv intracellulær kinase, men flere nyere fund har vist, at CK2 kan aktiveres som respons på eksterne stimuli, såsom IL-6, skønt de underliggende mekanismer for denne aktivering er fortsat uklare [22], [34]. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser blev CK2 aktivitet i SCCHN cellelysater opreguleret af IL-6 og inhiberes af CK2-specifik inhibitor 2-dimethylamino-4, 5, 6, 7-tetrabrom-1H-benzimidazol (DMAT), som bestemt ved en CK2 kinase aktivitet assay, der brugte en syntetisk CK2 substrat peptid og γ-

32P-ATP som fosfat donor (figur 2D).

for yderligere at demonstrere, at CK2 er i vejen mellem IL-6 og Twist, vi næste undersøgt Twist ekspression i nærvær af IL-6 og CK2 inhibitorer DMAT eller 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB). Som vist i figur 2E, blev IL-6-induceret Twist ekspression inhiberes af enten CK2 inhibitor og denne inhibering blev observeret på tværs af forskellige cellelinier. Virkningerne af CK2 på IL-6-induceret Twist ekspression blev yderligere bekræftet ved knockdown af den katalytiske underenhed CK2α i SCCHN-cellelinier, hvor begge de basale niveauer af Twist ekspression og dem efter IL-6 behandling blev reduceret (figur 2F). Tilsammen disse data yderligere bekræfter betydningen af ​​CK2 til IL-6-induceret stabilisering af Twist.

CK2 associerede med, phosphorylerer, og stabiliserer Twist

Vi næste undersøgt, om CK2 og Twist er forbundet med hinanden ved hjælp af co-immunopræcipitationsforsøg. Først brugte vi lysater fremstillet fra HEK 293T-celler transficeret med både vildtype Myc-Twist og CK2α. Som vist i figur 3A, blev CK2α detekteret i Western blots af immunpræcipitater udført med Myc-antistof og Myc-Twist blev påvist i Western blots af immunpræcipitater udført med CK2α antistof. Kontrol immunpræcipiterer hjælp uspecifik IgG præcipiterede ikke begge proteiner. Dataene antyder, at proteinerne kan interagere med hinanden. For yderligere at undersøge samspillet mellem endogene CK2α og Twist protein i SCCHN celler blev FaDu cellelinje valgt, fordi det udtrykker en høj basal niveau af CK2 protein; HN31 SCCHN-celler, der stabilt udtrykker Myc-mærket Twist (HN31 Myc-Twist SCCHN celler) blev etableret for immunpræcipitation formål på grund af de dårlige resultater af de kommercielt tilgængelige Twist antistoffer. Som vist i figur 3B, endogene Twist i FaDu SCCHN-celler blev co-immunpræcipiteret med et anti-CK2α antistof. I HN31 Myc-Twist SCCHN-celler, som stabilt udtrykker Myc-mærket Twist, endogen CK2α var også co-præcipiteret med anti-myc-immunpræcipitater. Disse data understøtter den hypotese, at CK2 kan regulere Twist ved at vise, at disse to proteiner fysisk omgås hinanden

(A) . (B) Tovejs co-immunpræcipitering viste, at CK2α er forbundet med Twist. (A) Co-immunfældning blev udført i lysater fra HEK 293T-celler transficeret med både WT Myc-Twist og CK2α. CK2α blev co-immunpræcipiteret med Myc-Twist og omvendt. (B) Cellelysater fra FaDu (venstre) eller HN31 celler, som stabilt udtrykker WT Myc-Twist (højre), blev immunpræcipiteret med CK2α (i FaDu celler) eller Myc-antistof (i HN31 WT Myc-Twist celler) og underkastet western blot analyse. Endogen Twist blev co-immunpræcipiteret med CK2α i FaDu cellelysater, og endogen CK2α blev fundet i Myc-immunopræcipitater af HN31 Myc-WT Twist cellelysater. (C) Co-immunpræcipiteret CK2α i HN31 Myc-Twist immunpræcipitater blev forøget med IL-6 (20 ng /ml, 20 min) og inhiberes ved forbehandling med et antistof mod IL-6-receptor, tocilizumab (50 ng /ml, 45 min). (D) CK2 phosphoryleret Twist. En immunkompleks kinase assay blev udført på Myc-immunopræcipitater fra HEK 293T cellelysater forbigående overekspression WT Myc-Twist eller Myc -S18,20A Twist. Rekombinant CK2 kinase og γ-

32P-ATP blev sat til immunopræcipitaterne ved 30 ° C i 15 min, og reaktionen blev stoppet ved tilsætning af SDS-prøvebuffer og opvarmning ved 95 ° C i 5-10 min. Prøverne blev derefter underkastet elektroforese og overført til en polyvinylidenfluoridmembran til autoradiografi eller Western blot-analyse. (E) Stabiliteten af ​​Twist var påvirket af site af CK2 fosforylering. [HN31 SCCHN celler stabilt udtrykker WT Myc-Twist, den CK2 hypophosphomimetic mutant Myc-S18,20A Twist, eller phosphorylering-mimetiske mutant Myc-S18,20D Twist var behandlet med CHX (100 uM) i de angivne tidsrum. Myc-Twist ekspression i cellelysaterne blev bestemt ved Western blot. Data repræsenterer en af ​​tre uafhængige forsøg. De beregnede halveringstider (t1 /2) fra tredobbelte forsøg er udtrykt som gennemsnit ± S.E.M. *

P

. 0,05 af Student

t

-test

For at undersøge, om samspillet mellem Twist og CK2α er IL-6 afhængig, samarbejde immunfældning blev gentaget i Myc-Twist-stabil cellelinie HN31 ved kortvarig behandling med IL-6 (20 min). Fordi HN31 udtrykker høje niveauer af endogen IL-6 (tabel S1), et monoklonalt antistof mod IL-6-receptor, tocilizumab, blev anvendt til at undersøge deres interaktion under blokade af IL-6-signalering. Som vist i figur 3C, øget CK2α blev co-immunpræcipiteret med Myc-Twist efter-IL-6 behandling, men blev ikke fundet i immunopræcipitater fra celler, forbehandlet med tocilizumab i 45 min.

For at bestemme om CK2 phosphorylerer Twist på rester S18 /S20, det formodede phosphoryleringssted fra vores beregningsmæssige forudsigelse, udførte vi et immunkompleks kinaseassay i HEK 293T-celler, der overudtrykker enten vild-type (WT) Myc-Twist eller mutant Myc-Twist, hvori S18 og S20 er substitueret med alanin ( S18,20A Twist). Renset CK2 kinase phosphoryleret WT Twist, men fosforylering blev afskaffet i overværelse af CK2 inhibitor DMAT og stærkt reduceret i muteret S18,20A Twist (figur 3D).

For at teste, om stabiliteten af ​​Twist påvirkes af site af fosforylering blev stabile HN31 celler overeksprimerer WT Twist, S18,20A Twist, eller en fosforylering efterligne hvor S18 og S20 er muteret til asparaginsyre (S18,20D Twist) etableret. Efter behandling af cellerne med CHX, de beregnede halveringstider for S18,20D Twist, S18,20A Twist, og WT Twist fra de tre forsøg var 9,62 ± 0,99 h til S18,20D Twist, 2,45 ± 0,59 h for S18,20A Twist og 4,69 ± 0,73 timer for WT Twist (figur 3E). Alle

P

værdier for at sammenligne midler fra to grupper med Student

t

-test var mindre end 0,05. Dette understøtter hypotesen om, at phosphorylering af Twist af CK2 øger Twist stabilitet. Tilsammen indikerer disse data, at CK2 forbinder med og phosphorylerer Twist, og at phosphorylering på S18 og S20 stabiliserer Twist.

CK2 og Twist er involveret i IL-6-forfremmet celle motilitet

Vi næste undersøgt virkningerne af IL-6, CK2 inhibering, og Twist knockdown på SCCHN cellemotilitet, som målt ved sårheling og Boyden-kammer migration assays. Som vist i figur 4A og 4B, blev migreringen af ​​OSC-19 SCCHN-celler i en 12-h sårheling ridse assay fremmes af IL-6 og undertrykt af CK2 inhibitor DMAT, mens den relative proliferationshastighed i hver gruppe undergik ingen signifikant ændring (figur 4C). Knockdown Twist i OSC-19 celler dybt undertrykt cellemotilitet, angiver dens vigtige rolle i celle migration (figur 5A, øvre panel). Efter behandling med IL-6 i 24 timer, blev migration steget, men denne stigning blev vendt i de Twist knockdown grupper (figur 5A, midterste panel). IL-6-forfremmet cellemigration blev hæmmet af CK2 inhibitor samt knockdown Twist, hvilket tyder på, at både CK2 og Twist er impliceret i signal-induceret migration. Vi næste sammenlignet motilitet cellelinjer stabilt udtrykker WT eller mutant Twist

in vitro

. Trods en situation med høj endogen IL-6-sekretion og eksistensen af ​​endogent Twist i HN31 SCCHN-celler, overekspression af WT, men ikke S18,20A, Twist fremmes cellemigration i forhold til kontrollen (figur 5B, øvre panel;

P

0,05). Endvidere overekspression af S18,20D Twist yderligere øget cellemotilitet forhold til den for celler, der udtrykker enten WT eller S18,20A Twist, hvilket antyder, at denne mutation fører til forøget cellemotilitet.

(A) Billeder til SCCHN cellemigration ved sårhelende assay er vist. OSC-19 SCCHN celler blev behandlet med PBS (kontrol), IL-6 (20 ng /ml), DMAT (20 uM) eller både IL-6 og DMAT i 2% medium som angivet. De sammenflydende cellemonolag blev såret ved skrabning med en 200-pi pipettespids. Billeder af ridser blev erhvervet ved 0 og 12 timer. (B) Kvantitative målinger af relative migrerede afstand blev analyseret med Image J. Data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. af den relative migrerede afstand. *

P

0,05 af Student

t

-test. (C) Cell proliferationshastighed under hver betingelse i (A) blev målt ved MTT-assay i 12 timer. Forskelle mellem grupper har ingen statistisk signifikans.

(A) Knockdown Twist hæmmede SCCHN celle migration i Boyden kammer migration assay. OSC-19 SCCHN-celler blev først transficeret med kontrolvektor eller Twist shRNAs i 24 timer i medium med eller uden IL-6 (20 ng /ml). Celler blev derefter underkastet trypsinbehandling, talt og analyseret for cellemotilitet anvendelse af en Boyd kammer migration assay efter 20 timer. Upper midterste paneler: data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. af celletal fra fire forskellige lavere effekt felt mikroskopiske synspunkter. *

P

0,05 af Student

t

-test. Underpanel: Twist udtryk for de tilsvarende eksperimenter i de øvre og midterste paneler blev opdaget af western blot. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Mutation Twist ændret migration af SCCHN-celler. Motilitet HN31 SCCHN-celler, der stabilt udtrykker WT Myc-Twist eller angivet mutant Myc-Twist protein blev undersøgt med den Boyden kammer migration assay efter 20 t. Øverste panel: data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. af celletal fra fire forskellige lavere effekt felt mikroskopiske synspunkter. *

P

0,05 af Student

t

-test. Midterste panel: repræsentative billeder af de migrerede celler fra de tilsvarende transwell membraner ved lav effekt felt forstørrelse. Underpanel: western blots for de tilsvarende eksperimenter i det øverste panel af (B). p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (C) Cell proliferation af hver betingelse i (B) som målt ved MTT-assay i 20 timer. Forskelle mellem grupper har ingen statistisk signifikans.

Diskussion

Denne rapport viser en ny post-translationel phosphoregulation Twist af IL-6 til aktivering af CK2 i SCCHN celler. Denne post-translationel modifikation kan stabilisere Twist, gør det muligt at regulere celle motilitet, forelægge bevis for en ny mekanisme til Twist regulering i kræftceller.

Offentliggjorte rapporter har involveret både Twist og IL-6 i udvikling /progression af kræft, da deres udtryk kan påvises i mange epiteliale tumorer eller patienternes serum og er forbundet med ugunstige kliniske resultater [4], [16], [18]. Selv om det er blevet rapporteret,, at IL-6 og dets nedstrøms signal mediator, STAT3, kan øge Twist udtryk gennem transskription i brystcancercellelinier [20], [35], [36], udelukker dette ikke den mekanisme af posttranslationel modifikation af Twist ekspression. Som vist i figur 2B, er Twist ekspression induceres kort efter IL-6 behandling trods inhibering af phospho-STAT3 ved kemisk inhibitor AG490 eller SB202130 ved højere doser, hvilket indikerer, at Twist opregulering er STAT3 uafhængige. Som vist i figur 1A og 1B, Twist proteinekspression markant forøget inden ændringer i Twist-mRNA-ekspression i SCCHN-cellelinier. Disse resultater er ikke i modstrid dem af en tidligere undersøgelse fra Lo

et al

[36], hvor Twist protein blev induceret ved 1 timer efter aktivering af EGFR-phospho-STAT3 vej mens Twist mRNA-niveauer steg kun efter 2 timer af behandlingen. Selv om det ikke blev drøftet i det tidligere arbejde, uoverensstemmelsen mellem Twist mRNA og protein udtryk i vores undersøgelse viser, at der findes en post-transkriptionel reguleringsmekanisme på tværs af forskellige cellelinjer.

Vores data viser, at Twist protein kan være phosphoryleret og stabiliseret af IL-6 i SCCHN-cellelinier, støtter konceptet, at phosphoregulation af transkriptionelle faktorer ofte udnyttes af flere cellulære signalveje for rettidig reaktion på eksterne stimuli [37]. Selvom Twist phosphoregulation er blevet beskrevet i studier af Twist mutationer hos patienter med Sæthre-Chotzen syndrom, en autosomal dominant lidelse craniosynostosis [11], rolle phosphoregulation Twist i kræftceller, at vores viden, er blevet drøftet i kun nogle få undersøgelser [12], [40]. Den CK2 phosphoryleringssite (S18 og S20) identificeret i denne undersøgelse placeret i NSEEE motiv, en af ​​fem evolutionært konserverede domæner i Twist aminosyresekvens, hvis funktion er uklar [41]. Vores fund kan hjælpe med at forbedre forståelsen af ​​dette domæne, eftersom CK2 er forbundet til mange vækstfaktor eller cytokin-veje, såsom IL-6 og epidermal vækstfaktor (EGF), hvori Twist er også involveret [20], [22], [ ,,,0],33], [36].

Interessant er disse faktorer også velkendte for at påvirke tumorigenese og progression af SCCHN [16]. Vi analyseret den post-transkriptionel regulering af Twist i afhængighed andre SCCHN-relevant cytokiner /vækstfaktorer og fandt, at funktionen af ​​stabiliserende Twist ikke er begrænset på IL-6. Andre vigtige vækstfaktorer i SCCHN, såsom EGF og vaskulær endotelvækstfaktor C, også stabilisere Twist niveauer [Figur S2]. Dette antyder, at en fælles mekanisme, kan deltage i reguleringen af ​​Twist i SCCHN, og at det kan være interessant at vide rolle CK2 i disse signalveje.

Den mekanisme, hvorigennem CK2 aktiveret fortsat uklart [34] . Selv om det er blevet vist, at CK2 aktivering er Erk-afhængig i neuroblastomceller [33], farmakologisk inhibering af Erk med U0126 i vores undersøgelse ikke blokerer IL-6-medieret stigning i Twist ekspression (figur 2B). Dette antyder, at der kan være andre end Erk, der kan aktivere CK2 cellemediatorer. Om det er celle typespecifikke behov, der skal undersøges nærmere.

Metastase er den største trussel mod sundheden og overlevelse af kræftpatienter og dens ledelse er udfordrende for sundhedspersonale.