PLoS ONE: Omfattende Alternativ splejsning af repressorelement Silencing Transskription Factor Knyttet til Cancer

Abstrakt

repressor element silencing transkriptionsfaktor (REST) ​​er et koordinatsystem transkriptionel og epigenetiske regulator, der fungerer som en tumor suppressor eller onkogen afhængig cellulær sammenhæng, og en trunkeret splejsningsvariant REST4 er blevet forbundet med forskellige former for kræft. Vi udførte en omfattende analyse af alternativ splejsning (AS) i

REST

ved hurtig opformering af cDNA ender og PCR-amplifikation af cDNA fra forskellige væv og cellelinier med specifikke primere. Vi identificerede 8 nye alternative exons herunder en alternativ sidste exon, der fordobler

REST

gen grænse, sammen med talrige 5 ‘/3’ splejsningssteder og ender i de konstitutive exons. Med kombinationen af ​​forskellige splejsning mønstre (f.eks exon spring og alternativ anvendelse af den første og sidste exoner), der er prædiktive for ændret REST aktivitet, mindst 45 alternativt splejsede varianter af kodende og ikke-kodende mRNA blev udtrykt i en arts- og celle -type /vævsspecifik måde med individuelle forskelle. Ved at undersøge repertoiret af

REST

præ-mRNA splejsning i 27 patienter med nyre-, lever- og lungekræft, fandt vi, at alle patienter uden undtagelse viste forskellen udtryk for forskellige

REST

splejsning varianter mellem parret tumor og tilstødende normale væv, med slående celle-type /væv og individuelle forskelle. Desuden afslørede vi, at exon 3 skipping, hvilket forårsager ingen læserammeforskydning men tab af et domæne afgørende for nuklear translokation, var påvirket af pioglitazon, en meget selektiv aktivator af peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma (PPARy), der bidrager til celle differentiering og tumorgenese udover dens metaboliske handlinger. Derfor denne undersøgelse viser en omfattende AS af

REST

præ-mRNA, som omdefinerer

REST

gen grænse og struktur, sammen med en generel, men forskellen mellem

REST

præ- mRNA splejsning og forskellige former for kræft. Disse fund fremme vores forståelse af den komplekse, kontekstafhængig regulering af

REST

genekspression og funktion, og give potentielle biomarkører og terapeutiske mål for kræft

Henvisning:. Chen GL, Miller GM ( 2013) Omfattende Alternativ splejsning af repressorelement Silencing Transskription Factor forbundet med kræft. PLoS ONE 8 (4): e62217. doi: 10,1371 /journal.pone.0062217

Redaktør: Emanuele Buratti, International Center for Genetic Engineering og Bioteknologi, Italien

Modtaget: Februar 14, 2013; Accepteret: 18 Marts 2013; Udgivet 16. april, 2013 |

Copyright: © 2013 Chen, Miller. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver DA025697 (GMM), DA030177 (GMM), og OD11103 (NEPRC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Alternativ splejsning (AS), en proces til differentieret link exons i en enkelt forløber mRNA (præ-mRNA) til at producere to eller flere forskellige modne mRNA, er en stor bidragyder til transkriptom- og proteomanalyse mangfoldighed, med 90% af menneskelige gener undergår AS i et vævs- og udviklingsstadiet-specifik måde [1], [2]. Det anerkendes nu, at koblingen mellem transskription og splejsning er afgørende for AS regulering [3], [4], og at exon-intron-vejkryds eller splejsningssites (SS) er specificeret af epigenetiske modifikationer afhængig cellulær kontekst [4], [ ,,,0],5]. Derfor epigenetiske modifikationer påvirker ikke kun transskription, men også co-transkriptionelle splejsning [6], [7]. Epigenetisk regulering af præ-mRNA splejsning, på linje med den Spatiotemporal udvalg af SS, tyder på, at AS cross-samtaler med miljømæssige stikord til at bidrage til adaptive responser og sygdomme patofysiologi. Faktisk AS moduleres af døgnrytmen ur, psykisk stress, og mange hormoner og kemikalier [8] – [10], mens en anslået 15-60% af genetiske sygdomme hos mennesker, der spænder fra neurologisk til tumorigene og metaboliske forstyrrelser, involverer splejsning mutationer [2], [11] – [14]

repressorelement silencing transkriptionsfaktor (REST, også kendt som NRSF for neuron-begrænsende lyddæmpende faktor), oprindeligt identificeret som en repressor af neuronale gener i ikke. neuronale celler [15], [16], er nu anerkendt som et koordinatsystem transkriptionel og epigenetiske regulator, der orkestrerer den cellulære epigenome i både neuronale og ikke-neuronale celler [17]. REST binder til vidt udbredt genomiske regulatoriske sekvenser, herunder repressor element-1 (RE1) af en DNA-bindende domæne (DBD), som omfatter 8 zinkfinger motiver (ZFMs), mens dens virkning på genekspression medieres af to uafhængige undertrykkelse domæner ( RD1 og RD2), som direkte eller indirekte rekruttere talrige transkriptions- og epigenetiske cofaktorer. Kort fortalt, den N-terminale RD1 rekrutterer mSin3, et stillads for histondeacetylaser (HDAC’er), mens de C-terminale RD2 partnere med resten co-repressorkomplekset (Corest) som yderligere rekrutterer HDAC, methyl-CpG bindende protein 2 (MeCP2), histon H3K4 lysin demethylase (LSD1) og H3K9 methyltransferaser (G9A), samt en bestanddel af SWI /SNF kromatin remodeling kompleks-Brg1. Ved at rekruttere talrige cofaktorer at målrette gen loci, REST fremmer dynamisk, kontekstafhængig chromatin organisation og undertrykkelse /aktivering af tusinder af gener involveret i mange cellulære processer, herunder tumorigenese, for hvilke den fungerer som en tumorsuppressor eller et onkogen afhængig cellulær kontekst [ ,,,0],18], [19]. De forskellige, kontekstafhængig funktion af REST er specificeret af flere mekanismer, herunder proteasomalaktivitet nedbrydning, nuklear translokation og præ-mRNA splejsning [20] – [23], samt modulation af ikke-kodende RNA (ncRNAer) og bindende affinitet REST til diverse RE1 og ikke-RE1 sites [24], [25].

REST

gennemgår AS med et begrænset antal splejsning varianter er blevet rapporteret, hvoraf en C-terminal afkortet variant REST4, som indeholder RD1 og ZFMs 1-5, er veldokumenteret [20], [21]. Som en dominant negativ, REST4 forbundet med småcellet lungecancer (SCLC), neuroblastom og brystcancer [26] – [28], og det bidrager til den tidlige liv programmering af stress respons, neurobeskyttelse og hormonel regulering af glutamin synthethase [ ,,,0],29] – [31]. Endnu to splejsningsvarianter, REST1 som indeholder RD1 og ZFMs 1-4 [16], og REST-5FΔ med en sletning af ZFM-5 [27], er også blevet dokumenteret. Især er REST4 med ZFM-5 transporteres til cellekernen, mens REST1 uden ZFM-5 er ikke [32], og det blev senere vist, at ZFM-5 er afgørende for den nukleare målretning af REST [33].

i denne undersøgelse, vi foretaget en omfattende analyse af AS for

REST

præ-mRNA og undersøgt dens relevans for kræft. Vi viser, at: 1)

REST

gennemgår omfattende AS tværs af en gengrænse nu fordoblet ved en hidtil ukendt sidste exon (E

5), med talrige kodende og ikke-kodende mRNA’er er dannet med et arts- og celle-type /vævsspecifik udtryk; 2) talrige

REST

splejsningsvarianter, som er forårsaget af forskellige splejsning mønstre (f.eks exon skipping og alternativ anvendelse af de første og sidste exoner) prædiktiv for ændret REST aktivitet, er generelt, men differentieret bundet til forskellige former for kræft ; og 3) exon 3 (E

3) skipping, hvilket forårsager ingen læserammeforskydning men tab af ZFM-5 essentiel for nuklear translokation, er bemærkelsesværdigt påvirket af pioglitazon, en meget selektiv agonist for PPARy, som modulerer celledifferentiering og tumorigenese ud over sin metaboliske handlinger. Disse fund fremme vores forståelse af kompleksiteten af ​​

REST

genregulering og funktion, og give potentielle biomarkører og terapeutiske mål for kræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

brugen af ​​humane væv blev godkendt af Harvard Board Institutional Review, og de relaterede projekter, som makakaber og mus blev aflivet blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Harvard Medical School. Harvard Medical School dyr management program er akkrediteret af American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) og opfylder National Institutes of Health standarder som beskrevet i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (DHHS publikation nr ( NIH) 85-23 Revideret 1985). Institutionen accepterer også som obligatoriske PHS Politik om Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr ved tilbudsgiveren institutioner og NIH Principper for Udnyttelse og Pleje af hvirveldyr, der anvendes i Testing, forskning og uddannelse.

Dyr (makakaber og mus) er involveret i denne undersøgelse blev passet i overensstemmelse med National Institutes of Health, US Department of Agriculture, og Harvard Medical School retningslinjer for dyr forskning. Makakker var single-opstaldet og blev gjort alle bestræbelser på at reducere ubehag og give berigelse muligheder (fx varieret kosttilskud, fouragerende og opgaveorienterede ernæringsmetoder samt samspil med pårørende og forskning personale). Konkret blev makakaber fodret to gange dagligt (AM og PM) med en afbalanceret kommercielt tilgængelig gamle verden Primate Diet (fx Harlan Teklad 8714 Monkey Diet). Frugt og /eller vegetabilske kosttilskud blev givet til alle dyr dagligt, og drikke vand blev leveret ad libitum fra automatiske vand lixits eller plastik vandflasker. Vævsprøver blev opsamlet fra fem makakaber, der var blevet anvendt i andre forsøg på tidspunktet for deres obduktion. Makakaber blev aflivet følgende blive bedøvet med ketamin HCl ved en intravenøs pentobarbital overdosis, og tømt for blod. Mus blev aflivet med kuldioxid gas indånding efterfulgt af cervikal dislokation, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

menneskers og dyrs væv

cDNA prøver stammer fra voksne normale humane væv (nyre, lever, lunge, hypofyse, hippocampus, amygdala og pons, 1 for hver) blev købt fra BioChain® Institute, Inc (Newark, CA). 27 par af tumor og tilstødende normale væv fra patienter diagnosticeret klinisk med nyrer, lever og lungekræft (9 par for hver) blev opnået fra UMass Cancer Center Tissue Bank (5 par for hver kræft som væv i RNAlater) og BioChain® Institute Inc (4 par for hver kræft som total RNA). Den demografiske information af patienterne kortvarigt vist i tabel 1. De humane mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er), der blev oprenset som beskrevet tidligere [34], blev venligst Givet af Dr. Fred Wang på Brigham Kvinders Hospital. Vi indsamlede også væv fra rhesusaber og mus aflivet for andre projekter.

cellelinjer og narkotikabehandling

I alt 18 cellelinjer afledt fra humant (HEK293, HEK293T, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, A549, MCF7, K562, SK-N-MC, HeLa, Raji, TE671, Jurkat, Sup-T1 og induceret pluripotente stamceller (iPS)), human primat (COS-7) og gnavere (RN46A og PC12) blev anvendt i denne undersøgelse. Bortset RN46A og iPS blev alle de andre 16 cellelinjer opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). RN46A celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Scott Whittemore [35], mens IPS celler stammer fra Dr. Stephen J. Haggarty [36]. For at undersøge effekten af ​​pioglitazon på

REST

præ-mRNA splejsning, den NCCIT, HEK293T og HepG2-celler blev behandlet med enten 10 uM af pioglitazon (Sigma-Aldrich) eller en matchet koncentration af opløsningsmidlet (0,04% DMSO ), og celler blev høstet ved 48 timer efter behandling. Behandlinger blev udført i dobbeltbestemmelse på 3 uafhængige lejligheder.

RNA-isolering og cDNA-syntese

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse Trizol® reagens (Invitrogen). En alikvot af totalt RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Qiagen), mens en anden aliquot blev revers transkriberet til cDNA ved anvendelse af en forankret oligo-dT (anker-sekvensen givet i tabel 2). Syntetiseret cDNA blev fortyndet til 50 ng /ul til brug.

PCR-amplifikation og DNA-sekventering

Et touchdown PCR-protokol blev ansat til både standard og indlejrede PCR’er, og amplificeringer blev udført i en MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler (GMI) i et totalt volumen på 20 pi indeholdende 1 pi skabelon (50 ng /pl cDNA for standard eller 1

st trin PCR, og 1:20 fortyndet produkt af 1

st trin PCR for 2

nd trin af nested PCR), 10 pmol af hver primer (tabel 2), og 10 pi GoTaq® Green Master Mix (Promega). Det første skridt i nested PCR blev udført ved hjælp af cDNA fra forankret oligo-dT som skabelon og oligo-dT anker parret med E

1AF

2, E

1bF

2 og E

1cF

2 som primer sæt. For voksne normale humane væv uden cDNA fra forankret oligo-dT til rådighed, blev oligo-dT anker erstattet af E

4R

3 og E

5R

2 (uden E

4R

1 og E

5R

1 hhv). Primere til rhesus makak og gnavere blev ændret, hvis nødvendigt. Amplifikationsbetingelser involverede en initial 2,5 min denaturering ved 95 ° C, efterfulgt af 28 (for 1

st trinnet nested PCR) eller 40 (for standard eller 2

nd trin af nested PCR) cykler af 30 s denaturering ved 95 ° C, 30 s annealing (temperatur begyndende ved 61 ° C og faldt med 0,5 ° C /cyklus i de første 12 cyklusser, fikseres derefter ved 55 ° C), og 60~180 s forlængelse ved 72 ° C, med en endelig udvidelse af 5 minutter ved 72 ° C. PCR-produkter blev fyldt på en 2% agarosegel og amplikoner af særskilte størrelse blev udskåret, renset og sekventeret. DNA-sekventering blev udført som kommerciel tjeneste af de funktionelle Biosciences Inc (Madison, WI). PCR-produkter med sekventeringsdata dårlig kvalitet blev klonet ind pGEM®-T-vektoren (Promega) for yderligere sekventering.

5 ‘/3’ hurtig amplifikation af cDNA-ender (RACE)

Total RNA genereret fra HEK293, HEK293T, HepG2 og SH-SY5Y blev anvendt til at udføre 5 ‘og 3’ RACE, som blev udført af to kommercielle kits, 5 ‘/3’ RACE Kit (2

nd Generation) fra Roche ( Indianapolis, IN) og GeneRacer® fra Invitrogen, som adskiller sig i strategier for 5′-RACE. For 5 ‘RACE med GeneRacer® kit blev en RNA Oligo først ligeret til RNA, efterfulgt af cDNA syntese hjælp Oligo-dT og indlejret PCR ved hjælp af

REST

-specifikke reverse primere (f.eks E

4R

1 og E

4R

2) parret med en GeneRacer® 5′-primer (homolog med RNA Oligo). For 5 ‘RACE med Roches kit blev cDNA først syntetiseret fra total RNA ved hjælp af en

REST

-specifik reverse primer (f.eks E

4R

2, uden), efterfulgt af hale med dATP og terminale transferase og efterfølgende nested PCR ved hjælp forankret Oligo-dT eller anker primer parret med en

REST

-specifik reverse primer (f.eks E

4R

1, indvendig). For at udføre 3 ‘RACE blev cDNA syntetiseret fra total RNA ved hjælp forankret Oligo-dT, efterfulgt af nested PCR ved hjælp af

REST

-specifikke fremadrettede primere (f.eks E

1AF

1 og E

1AF

2) parret med ankeret primeren.

Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) assay

anvendelse af primere, der er opført i tabel 2, udviklede vi SYBR Green i og /eller hybridiseringsprobe QRT-PCR for specifikke exon-exon junctions og exon 2 (E, betegner

2 formodentlig samlet ekspression af kodende mRNA’er uanset de første og sidste exoner), samt husholdning genet

GAPDH

. De QRT-PCR assays blev udført som tidligere beskrevet på en Roche LightCycler 2.0-system [37], med tærskelcyklus (Ct) værdier være ansat at beregne udtrykket ændringen mellem parrede væv eller celler ved 2

-ΔΔCt tilgang [ ,,,0],38]. PCR-reaktioner blev kørt in duplo. For E

1a /E

4 junction, som udtrykkes ved lave niveauer i de fleste tilfælde kun SYBR Green I assayet er til rådighed, og de Ct-værdierne sandsynligvis forvirret af primer-dimer dannet af overdrevne resterende primere, så udførte vi QRT -PCR ved anvendelse af produktet fra den 1

st trin PCR som template. På grund af den høje sekvensidentitet mellem 3′-enderne af E

2 og E

3, QRT-PCR-assay specifikt for E

2 /E

4 junction var ikke opnåeligt.

Bioinformatik og dataanalyse

Forudsigelse af den åbne læseramme (ORF) af specifik

REST

varianter blev udført ved anvendelse af StarORF programmet (https://star.mit.edu/orf /runapp.html), og epigenetisk information på

REST

locus blev hentet fra UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). Sammenligninger af QRT-PCR-analyseret ekspressionsniveauer af specifikke exon-exon overgange mellem parrede væv eller celler blev udført af 2

-ΔΔCt tilgang med passende henvisning, og dobbelt ændring blev betragtet som signifikant.

Resultater

Identifikation af E

2 /E

3 springe udtrykt i en art-afhængig måde

Vi udførte standard og indlejrede PCR med cDNA prøver stammer fra en lang række humane væv (lever, nyre, lunge, hypofyse, hippocampus, amygdala og pons) og cellelinier (HEK293, HEK293T, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, A549, MCF7 og iPS). Ved hjælp af en reverse primer E

4R

1 målrette den proksimale exon 4 (E

4) parret med den forreste primere E

1AF

1 og E

2F

1 målretning exons 1a (E

1a) og 2 (E

2) (figur 1A og tabel 2), henholdsvis identificerede vi flere

REST

splejsning varianter med E

2 og /eller E

3 sprunget (figur 1B og 1C). Varianten med E sprunget

2 er rigeligt til udtryk i alle testede cellelinjer og væv undtagen amygdala, mens varianter med E

3 alene eller plus E

2 sprunget blev udtrykt på et lavt niveau i en delmængde af væv og cellelinier. Især E

2 /E

3 skipping er overvejende forbundet med E

1a, men sjældent med E

1b og E

1c (figur 1B). Derudover E

2 /E

3 skipping blev observeret i yderligere 7 humane cellelinier og de mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) (figur S1).

(A) Illustration af kommenteret

REST

exons og placeringer af primere anvendt til identifikation af

REST

splejsningsvarianter. De konstitutive exons (1a, 2, 3 og 4) og alternative exons (1b, 1c og N) er vist i åbne og grå felter, hvorimod de fremadrettede og bagudrettede primere er angivet med højre og venstre pile, henholdsvis. (B) Påvisning af E

2 /E

3 skipping i humane væv og cellelinier ved indlejrede PCR’er med specifikke primer sæt. E

2 /E

3 skipping er ofte forbundet med E

1a, men sjældent forbundet med E

1b og E

1c. (C) Trace kromatogrammer for exon-exon vejkryds involveret i E

2 /E

3 skipping. (D) Påvisning af E

2 /E

3 skipping i væv og cellelinjer fra ikke-humane primater og gnavere ved nested PCR. Af de mange rhesus væv, E

2 springe alene blev kun observeret i amygdale (a) og pinealkirtlen (b).

Vi testede, om E

2 /E

3 skipping udtrykkes i ikke-humane primater og gnaver væv og cellelinier. Som vist i figur 1D, springer af E

2 alene blev kun observeret i amygdala og pineal ud af 17 væv fra 1 rhesus makak, mens springer af både E

3 blev kun observeret

2 og E i macaque PBMC’er og COS-7-celler (afledt fra afrikansk grøn abenyre); dog springer af E

3 alene blev observeret i de fleste macaque væv og COS-7-cellelinje. Hos gnavere springe af E

2 (alene og plus E

3) blev observeret i RN46A men ikke PC12-celler, mens springer af E

2 alene blev observeret i hippocampus fra 2 af 4 mus testet, antyder en inter-individuel forskel. Ligeledes individuel forskel i

REST

præ-mRNA splejsning blev også observeret i pons og raphe fra 4 makakaber (Figur S2).

Fund af en roman sidste exon, der fordobler menneske

REST

gen grænsen

Vi udførte RACE at bestemme de 5 ‘og 3’ ender af menneskelig

REST

mRNA. Uventet, vi identificeret en roman polyadenyleret exon (E

5), der lokaliserer -30 kb nedstrøms for E

4 og delvist overlapper i modsat retning med exon 5 i nitrogenoxid forbundet-1 (

NOA1

) genet (figur 2A), som koder for et GTPase afgørende for mitokondrie proteinsyntese [39]. Ved indlejrede PCR’er bruger en E

5-specifikke reverse primer (E

5R

1) parret med E

1AF

1 og E

2F

1 hhv vi fandt, at E

5 inklusion, lejlighedsvis i kombination med E

2 /E

3 skipping, er udtrykt i de fleste humane væv og cellelinjer (figur 2B, 2C og figur S1). Ligesom E

2 /E

3 skipping, E

5 inklusion er primært forbundet med E

1a, men sjældent med E

1b og E

1c. Især fandt vi ingen varianter indeholder både E

5, hvilket tyder på

4 og E, at E

4 og E

5 er gensidigt udelukkende, og at E

4, ligesom tilfældet for E

2 og E

3, kan være helt springes over. Derfor romanen sidste exon E

5 doubler den menneskelige

REST

gen grænsen fra -28 kb til ~59 kb (figur 3A). E

5 inklusion blev ikke observeret i ikke-humane primater og gnavere.

(A) Sekvens af E

5 og dets delvise (81 bp) overlapper med

NOA1

gen i modsatte retning. (B) Påvisning af E

5 optagelse i humane væv og cellelinier af nested PCR. (C) Trace kromatogrammer for vejkryds i E

5 med E

1a, E

2 og E

3. Bemærk, at 3 ‘ender af E

2 og E

3 aksjer høj sekvens identitet.

(A) identificeret

REST

exons og deres 5′ /3 ‘SS eller ender. Den UCSC gener sporet blev brugt til kortvarigt indikere den kromosomale placering af

REST

gen locus, mens den genomiske sekvens NG_029447 var ansat som en reference til at afklare de nøjagtige positioner af exons. Større domæner af REST-proteinet (NP_005603) blev illustreret parallelt med den tilsvarende kodende regionen for at forudsige konsekvenser af de Pr

REST

præ-mRNA på proteinniveauet. De konstitutive og alternative exoner samt deres 5 ‘/3’ SS eller ender, er farvekodede som angivet. Bemærk, at: 1) exon N i figur 1 er omdøbt til N

3c her; 2) E

2k er en udvidelse af E

2a uden splejsning; og 3) E

5 og N4b er faktisk ikke præsenteret i NG_029447. (B) Mønstre af

REST

præ-mRNA splejsning og resulterende mRNA varianter. Formodede kodning varianter er farvekodede (blå-ingen aminosyre ændring forudsagt, rød-afkortet protein) eller skygget (tab af ZFM-5). (C) Forudsigelse af C-terminale trunkerede REST proteiner til specifikke mRNA varianter. De exon-exon kryds og præmature stopkodoner er understreget.

Omfattende AS af

REST

præ-mRNA

Ved at undersøge ovennævnte primat væv og cellelinier samt parrede tumor og tilstødende normale væv fra cancerpatienter nævnt i det følgende, vi afslørede et omfattende AS fra

REST

præ-mRNA. Som vist i figur 3A, foruden E

5 og tidligere rapporterede exon N (nu omdøbt til N

3c) identificerede vi yderligere 7 roman alternative exons (N

1, N

2a, N

2b, N

3a, N

3b, N

4a og N

4b), sammen med talrige 5 ‘/3’ SS og ender i de konstitutive exoner E

2 og E

4. Uanset den 5 ‘/3’ enderne i E

2 og E

4, mindst 45 varianter (S1-S45) er dannet af forskellige splejsning mønstre herunder exon skipping, alternative 5′- /3 ‘SS, gensidig udstødelse og alternativ anvendelse af de første og sidste exoner (figur 3B). Sekvenser af de nye varianter er blevet deponeret i GenBank med tildelte numre tiltrædelse JX896957-JX896993 og KC117262-KC117266.

29 af de 45 splejsningsvarianter indebærer hel eller delvis skipping af E

2, hvor oversættelse indviede, såsom at de kan fungere som ncRNAer grund af mangel på translationsstartstedet (TSS), bortset fra at adskillige varianter (S16, S19 og S28), hvis TSS blev bevaret forudsiger N-terminale trunkerede REST proteinisoformer. Tilsvarende delvis eller fuldstændig springe af E

4, som ofte ledsaget af E

2 skipping og /eller E

5 inklusion, producerer mange ncRNAer eller kodning mRNA prædiktive af trunkerede REST proteinisoformer. I modsætning hertil springe den 84-bp E

3 (S4 og S34) forårsager ingen ramme skift, men tabet af ZFM-5. Især varianter med intakt E

2 (eller plus E

3) efterfulgt af alternative exons (men ikke E

4) forudsiges at kode C-terminale trunkerede REST proteiner, hvoraf 8 varianter med E

3 indkode REST4 (S3 og S12) eller REST4-lignende (S2, S21, S31, S33, S39 og S41) proteiner med RD1 og ZFMs 1-5, mens en anden 4 varianter (S34, S39-S41) med E

3 sprunget encode REST1 med RD1 og ZFMs 1-4 (figur 3C)

de fleste af de 45 splejsningsvarianter udtrykkes i lave niveauer i en celletype /vævsspecifik måde.; blev dog mindst én variant observeret i alle de testede væv og cellelinier (figur 1, 2 og figur S3).

Link mellem

REST

præ-mRNA splejsning og kræft

Vi sammenlignede ekspressionen af ​​specifikke splejsnings- mønstre og varianter mellem parret tumor (T) og tilstødende normale (N) væv fra 27 patienter med nyre (Ki), lever (Li) og lunge (Lu) cancere (9 par for hver kræft, tabel 1) af nested PCR og QRT-PCR-analyser med fokus på E

2 /E

3 skipping og alternativ brug af de første og sidste exons. De QRT-PCR-assays blev udformet rettet mod specifikke exon-exon junctions (figur 4A), og ekspressions ændringer i specifik splejsning mellem T og N er vist i folder (T over N) for hver genstand (figur 4B). Med undtagelse af E

1a /E

3 og E

1a /E

4, som repræsenterer S5 og S6 varianter, henholdsvis exon-exon overgange repræsenterer ikke nødvendigvis en enkelt specifik splejsning variant , som imidlertid kan påvises ved nestede PCR’er (figur 4C). Følgelig blev både QRT-PCR og nested PCR-analyser tages i betragtning ved sammenligning af

REST

præ-mRNA splejsning profil mellem parrede T og N væv. Mens den brede udtryk for E

2 /E

3 skipping og E 5 inklusion i menneskelig blev yderligere valideret, fandt vi, at alle de 27 patienter uden undtagelse viste forskellen udtryk for talrige

REST

br > splejsningsvarianter forårsaget af specifikke splejsning mønstre mellem parrede T og N væv, med en slående vævstype-og individuel forskel.

(a) strategi for udformning af QRT-PCR assay for specifikke exon-exon junctions. (B) Expression ændringer (T over N, i fold) af specifikke exon-exon junctions analyseret ved QRT-PCR assay; (C) Angivelse af specifikke

REST

splejsning varianter opdaget af nested PCR. De forlæns og reverse primere er angivet med højre og venstre pile, henholdsvis. Parret t og N væv blev indsamlet fra 27 patienter med nyre (Ki), lever (Li) og lunge (Lu), og den basiske diagnose vist i tabel 1 blev kort givet som dets første 3 bogstaver for hver patient. Ekspressionssystemer ændringer (T over N, i fold) af bestemte varianter eller splejsning (fx exon–forbindelsespunkter) blev analyseret ved QRT-PCR og beregnet af 2

-ΔΔCt tilgang med E

2 som reference. Data er vist som gennemsnit ± SEM. QRT-PCR analyse er ikke opnåeligt for E

3 springer alene (dvs. E

2 /E

4 junction), men kan observeres synlige ændringer mellem T og N væv til de fleste personer ved nested PCR under anvendelse af E

2F

1 /E

4R

1 primer sæt.

Som vist i figur 4B og 4C, varianter med E

2 /E

3 sprunget blev differentielt udtrykt mellem parrede T og N væv for de fleste patienter. Af varianter bruger E

4 som den sidste exon, S6 (både E

2 og E

3 sprunget) viste påfaldende differentieret udtryk for alle de patienter med undtagelse af Lu # 4 og 7. Konkret 7, 5 og 1 patienter med nyre-, lever- og lungekræft henholdsvis viste øget S6 ekspression, hvorimod 2, 4 og 6 patienter med nyre-, lever- og lungekræft henholdsvis udviste nedsat S6 ekspression. Selvom QRT-PCR analyse til E

3 springer alene (dvs. E

2 /E

4 junction) er ikke opnåeligt, indlejret PCR med E

2F

1 /E

4R

1 viste tilsyneladende differentiel ekspression af S4 mellem parrede T og N for en del af patienterne. I mellemtiden, differential udtryk for E

2-sprunget varianter S5 og S15 mellem parret T og N fra nogle patienter blev vist ved QRT-PCR og nested PCR hhv. Desuden er nogle andre varianter (fx S14, S16 og S17) med E

1b som det første exon og E

2 delvist sprunget blev differentielt udtrykt mellem parret T og N for nogle få patienter. For eksempel blev S14 og S16 kun observeret i T væv af 4 patienter (Ki # 5, 6 for S14 og Ki # 4, Lu # 9 til S16 henholdsvis). Ligeledes varianter anvender E 5 som den sidste exon, S34 (E

3 springes over), S35 (E sprunget

2)

og S38 (både E

2 og E

3 sprunget ) viste tilsyneladende differentieret udtryk mellem parret T og N som angivet af indlejrede PCR’er med E

1AF

1 /E

5R

1 og E

2F

1 /E

5R

1. Derfor E

2 /E

3 (især E

3) skipping er generelt, men differentieret knyttet til forskellige typer af kræft med slående celle-type /væv og individuelle forskelle.

Som vist i figur 4C, med undtagelse af 3 patienter (li # 5, 6 og Lu # 6) uden påviselig ekspression af E

5 inklusion udviste alle andre patienter differentiel ekspression af E

5-inkluderet varianter mellem parret T og N væv. Især udtryk for S33 /S39 uden E

2 /E

3 skipping blev vundet og tabt i T væv af 6 (Ki # 2, 9, Li # 1, 3, 7 og Lu # 3) og 4 (Ki # 1, 4, 7, 8 og Lu # 1) patienter. Især indlejret PCR med E

2F

1 /E

5R viste

1, at alle 9 nyre kræftpatienter udtrykte E

5 i deres N væv, af dem 3 (Ki # 1, 7, 8) mistede E

5 udtryk i deres T væv. Derimod alle 9 patienter med leverkræft viste ingen E

5-ekspression i deres N væv, og af dem, 4 (Li # 1, 2, 3, 7) fik E

5-ekspression i deres T væv. Den differentielle ekspression af E

5-inkluderet varianter mellem parret t og N væv vist ved nested PCR blev understøttet af QRT-PCR-analyse af E

3 /E

5 junction (figur 4B).

Desuden varianten S18 som bruger E

1c som den første exon blev differentielt udtrykt mellem parret t og N væv for de fleste (22/27) patienter, med 12 og 10 patienter, der viser forøget og nedsat ekspression henholdsvis (figur 4B og 4C). I mellemtiden QRT-PCR-assay indikerede, at varianterne S1 og S11, der anvender E

1a og E

1b som det første exon henholdsvis udviste større end 2-fold ekspressionssystemer ændringer mellem parrede T og N væv for nogle patienter (figur 4B).