PLoS ONE: Den funktionelle betydning af MicroRNA-29c i patienter med kolorektal cancer: en potentiel Cirkulerende biomarkør for Forudsigelse Tidlig Relapse

Abstrakt

Baggrund

gentagelse af kolorektal cancer (CRC) er hyppig indenfor det første år af helbredende resektion kirurgi og kan være uundgåelig. microRNA er blevet foreslået at spille roller i carcinogenese og kræft tilbagefald. Vi har for nylig identificeret microRNA-29c (miRNA-29c) som en indikator for tidlig tilbagefald i CRC. I den foreliggende undersøgelse, vi yderligere undersøgt funktioner og serum niveau af miRNA-29c i forhold til tidlig gentagelse af CRC.

Metoder

Først skal vi yderligere bekræftet overekspression af miRNA-29c i ikke tidlige tilbagefald emner. Gain-of-function

in vitro Salg undersøgelser blev anvendt til at evaluere effekten af ​​miRNA-29c på celleproliferation, migration, invasion, og cellecyklusprogression. Den coloncancercellelinie Caco2 og en stabil klon overudtrykker miRNA-29c var xenotransplanteret at evaluere

in vivo

virkning af miRNA-29c i null mus. Endelig blev cirkulerende miRNA-29c undersøgt som en potentiel biomarkør for at identificere tidlige tilbagefald.

Resultater

miRNA-29c udtryk faldt betydeligt i den tidlige tilbagefald sammenlignet med ikke-tidlig tilbagefald i UICC stadium II og III CRC patienter (

P

= 0,021).

In vitro

undersøgelser viste, at overekspression af miRNA-29c hæmmede proliferation og migration. Cellecyklus undersøgelser viste også, at miRNA-29c forårsagede en ophobning af G1 og G2 befolkning.

In vivo

, miRNA-29c undertrykte tumorvækst i null mus. Serum miRNA-29c steget betydeligt i begyndelsen af ​​recidiverende patienter sammenlignet med ikke-tidlige Forløbet patienter (

P =

0,012).

Konklusioner

miRNA-29c viser anti-tumorigenese aktivitet, og præoperativ cirkulerende miRNA-29c niveauer kan bruges til at forudsige postoperativt tidligt tilbagefald af CRC

Henvisning:. Yang IP, Tsai HL, Huang CW, Huang MY, Hou MF, Juo S-HH, et al . (2013) Den funktionelle betydning af MicroRNA-29c i patienter med kolorektal cancer: en potentiel Cirkulerende biomarkør for Forudsigelse Tidlig Relapse. PLoS ONE 8 (6): e66842. doi: 10,1371 /journal.pone.0066842

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: December 3, 2012; Accepteret: 10 maj 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Rådet for Republikken Kina (NSC 99-2320 B-037-014-MY3); Kaohsiung Medical University Hospital (KMUH98-8I04, KMUH100-OR16); Biosignatur i tarmkræft, Academia Sinica, Taiwan; og en Excellence for Cancer Research Center Grant finansieret af Department of Health, Executive Yuan, Taiwan, Kina (DOH102 TD-C-111-002). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den høje forekomst og dødelighed af kolorektal cancer (CRC) udgøre en betydelig folkesundhedsproblem på verdensplan [1]. Selvom kirurgisk resektion kan være yderst effektiv til en lokaliseret sygdom, 30-40% af patienterne udvikler recidiv efter kirurgi [2] og 40-50% af gentagelser tilsyneladende inden for det første år efter initial kirurgisk resektion [3], [4]. Tiden fra den første behandling til udviklingen af ​​tilbagefald er blevet rapporteret at være stærkt relateret til overlevelse, især hos patienter inden for et år efter kirurgisk resektion [5]. Der er gjort en vedvarende indsats for at søge efter enkle og pålidelige metoder /biomarkør for tidlig påvisning af tumorer og for CRC prognose for at give tidligt, tilstrækkelig, og effektiv behandling.

Et modent microRNA (miRNA) er en lille, ikke-kodende RNA, som indeholder ca. 20 nukleotider og kan sende-transkriptionelt regulere ekspressionen af ​​adskillige målgener på samme tid [6]. Den tumorigenese af CRC involverer flere trin genomiske ændringer, herunder aktivering af onkogener og inaktivering af tumorsuppressorgener [7]. miRNA er blevet foreslået at spille roller i udviklingen af ​​cancere, herunder carcinogenese, progression, og fornyet [7] – [10]. De fleste offentliggjorte undersøgelser har fokuseret på væv-baseret miRNA udtryk [8], [11], [12], og kun få studier har undersøgt cirkulerende miRNA i patienter med CRC [13] – [15]. Nylige undersøgelser har vist, at serum niveauer af visse miRNA kan tjene som potentielle biomarkører for forskellige kræftformer [16] – [18]

Vi har for nylig brugt en kombination af bioinformatik og eksperimentelle metoder til at forudsige og validere miRNA-29c. som kandidat biomarkør forbundet med CRC recidiv [19]. I den aktuelle undersøgelse, vi først brugt en stor datasæt for at bekræfte forholdet mellem miRNA-29c udtryk og tidlig CRC gentagelse. En serie af

in vitro

in vivo blev udført

eksperimenter for at illustrere den funktionelle rolle af miRNA-29c i CRC tumorigenese. Efterfølgende undersøgte vi, om serum niveau af miRNA-29c kan bruges som en biomarkør til at forudsige tidligt CRC gentagelse.

Metoder

Patienter og prøver

For at undgå de potentielle indflydelse neoadjuverende behandling på miRNA udtryk blev patienterne udelukket, hvis de havde gennemgået neoadjuverende behandling med enten kemoterapi eller strålebehandling før operationen. De CRC tumor prøver blev indhentet fra 107 patienter med primær CRC på UICC stadium II /III (56 ikke-tidlige recidiverende patienter og 51 tidlige-recidiverende patienter efter radikal resektion). Blandt disse 107 patienter, har miRNA-29c data for 68 forsøgspersoner (27 ikke-tidlige recidiverende patienter og 41 tidligt tilbagefald patienter) er rapporteret hos vores gennemtrængelig papir [19]. CRC tidligt tilbagefald blev defineret som lokalt recidiv eller fjernmetastaser, der opstår inden for 1 år efter radikal resektion [5], [20], [21], og de patienter, der fik tilbagefald efter det første år og ikke fik tilbagefald i den tid af undersøgelsen var klassificeret i den ikke-tidlig recidiverende gruppe. Fordi CRC recidivraten i fase I er forholdsvis lav, og patienter med stadie IV CRC allerede har metastatiske enheder [19], [20], nærværende undersøgelse kun rekrutteret CRC patienter på trin II og fase III. CRC væv blev hurtigt nedfrosset i flydende nitrogen efter kirurgisk resektion. De serumprøver fra 61 CRC patienter med primær CRC på UICC iscenesætter II /III (41 ikke-tidlig recidiverende og 20 tidligt tilbagefald patienter), før de modtog kirurgi blev indsamlet og serum miRNA-29c niveauer blev målt. Serum miRNA-29c niveauer blev også målt i 23 raske forsøgspersoner (14 kvinder og ni mænd). Både serum- og CRC tumor prøver blev opnået fra 38 individer i denne undersøgelse. Alle emner var ubeslægtede etniske kinesere bosat i Taiwan. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver genstand for at hente deres kliniske prøver og at offentliggøre disse case detaljer og alle patientdata blev anonymiseret. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Kaohsiung Medical University Hospital Institutional Review Board (Protokol nummer: KMUH-IRB-990.343)

RNA ekstraktioner fra Tissue

Ca. 100 mg af hver væv blev homogeniseret bruger. en bench-top homogenisator (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Lucerne, Schweiz) og total RNA, herunder mRNA og miRNA, blev oprenset ved anvendelse af et Qiagen RNAeasy-system (Qiagen, Hamburg,

Tyskland

) ifølge producentens instruktioner.

miRNA-29c Expression niveauer i tidlige og ikke-tidlige recidiverende CRC Patienter

for at måle miRNA-29c ekspressionsniveauerne blev miRNA-29c cDNA syntetiseret fra 20 ng af total RNA med en unikke primer (Applied Biosystems Inc., CA) og TaqMan miRNA RT-qPCR assay (Applied Biosystems Inc.) blev anvendt. De relative ekspressionsniveauer af miRNA-29c i væv blev normaliseret til den for U6b som en intern kontrol ved hjælp af ligningen: log

10 (2

-ΔCt), hvor ACt = (Ct

miRNA-29c – ct

U6b). Gennemsnittet og standardafvigelsen (SD) værdier af log

10 (2

-ΔCt) blev beregnet.

Cell Culture

Den menneskelige koloncarcinomcellelinie Caco2, Lovo, SW480 og SW620 (ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS; Gibco-BRL) og 100 U /ml penicillin [21]. Cellerne blev opretholdt ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2.

Konstruktion af et plasmid for Over-ekspressionen af ​​miRNA-29c

pCDH vektor (System Biosciences, Mountain View, CA) blev anvendt til at vurdere de funktionelle konsekvenser af miRNA-29c overekspression. Vi konstruerede den pCDH- miRNA-29c plasmidet ved at indsætte miRNA-29c PCR-produkt ind i det multiple kloningssite regioner pCDH. Sekvenserne for de anvendte primere til amplifikation miRNA-29c var tcctgaattcgaggatgccctggagtattcgg og ctaggcggccgcgcatgatcttccttccctattc. Den fremadrettede primer blev forlænget ved 5′-enden for at inkludere GAATTC-sekvens for at skabe et

EcoR1

restriktionssite, og den reverse primer blev forlænget i 5′-enden for at inkludere gcggccgc sekvens for at skabe en

Not1

restriktion site. Konstruktionen blev bekræftet ved direkte DNA-sekventering.

Etablering af stabile kloner

Caco2 celler (5 x 10

5) var seedet og transficeret med 400 ng af konstruktioner (enten negativ scrambled pCDH vektor eller den pCDH-miRNA-29c plasmid) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). De stabilt transficerede Caco2 celler indeholdende pCDH-NC-plasmidet (NC: negativ kontrol) eller pCDH-miRNA-29c plasmid (O miRNA-29c: overekspression af miRNA-29c) blev udvalgt i løbet af en periode på 4 uger ved anvendelse af standard dyrkningsmedium suppleret med 12 mg /ml puromycin (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MI). Stabil transfektion af plasmiderne blev bekræftet ved at udføre en miR QRT-PCR-assay.

Analyse af celleproliferation

Caco2 stabile kloner Celler blev podet og inkuberet i 22 timer, derefter yderligere inkuberet i yderligere 2 h med 1/10 volumen WST-1 reagens (Roche Diagnostics, Corp., Indianapolis, IN), før absorbansen ved 450 nm blev kvantificeret ved hjælp af et spektrofotometer [21].

for yderligere at undersøge, hvilken rolle miRNA -29c i spredning, vi evaluerede effekten af ​​miRNA-29c overekspression på væksten af ​​3 forskellige cancer cellelinjer (Lovo, SW480 og SW620). Vi overgang transficeret har-miRNA-29c miRNA (miR-29c efterligner, Ambion, USA) eller negativ kontrol (NC, Mirvana miRNA mimic, Ambion, USA) i Lovo, SW480 og SW620 celler. Celler blev podet, inkuberet i 22 timer, og derefter yderligere analyseret som gennemtrængelig beskrevet.

Cell Cycle Analysis

Efter inkubation i 36 timer blev cellecyklusprogression kvantificeret ved propidiumiodid (PI, Sigma -Aldrich Co.) farvning og efterfølgende analyse på en FACScan cytofluorimeter (Becton Dickinson, NJ) med CellQuest software (BD Biosciences), ifølge producentens instruktioner.

analyse af cellemigrering

Cell migration blev vurderet ved anvendelse Transwell polycarbonatmembran indsatser (Millipore, GmbH, Schwalbach, Tyskland) i 24-brønds plader. Cellerne (2 x 10

4) blev udpladet på 24-brønds millicells og fik lov til at migrere i 24 timer ved 37 ° C. Indsatsene blev skyllet i 1 x PBS, og cellerne blev fjernet fra membranerne med 1% trypsin i cellekultur-lysereagens (Promega, Corp., Madison, WI, USA). Cellemigrering vurderet ved kvantificering af grønne fluorescens af pCDH vektoren som tidligere beskrevet [21].

sårheling Assay

Efter dannelse af et monolag, et sår blev skabt i cellelaget ved manuel skrabning med en 200-pi mikropipettespids. Dyrkningsmediet blev derefter erstattet, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C. Sårlukning blev overvåget og fotograferet på forskellige tidspunkter (0, 24, og 48 h) under et mikroskop.

Matrigel Invasion Assay

Cell invasion blev analyseret under anvendelse 24 brønde Transwell permeable understøtninger ( BD Biosciences, San Jose, CA) med 8-um pore polycarbonatmembran skær. Cellerne (1 x 10

4) blev placeret på den øverste kammer og lov til at invadere i 24 timer. Cell invasion blev analyseret som beskrevet tidligere [21]

In vivo dyreforsøg

Fire uger gamle Balb /c nøgne mus (kropsvægt: 12,6-15,6 g). Blev købt fra BioLasco Taiwan Co, Ltd (Taipei, Taiwan) og holdes i en SPF-frit miljø (certifikat nr .: 26-99S029). Ved 6 ugers alder, blev hver nøgen mus injiceret subkutant med 1 x 10

7 Caco2-celler (enten NC eller OMIR-29c;

N

= 4 pr transficeret cellelinie) i halsområdet. Tumoren diameter blev målt, og tumorvolumen (cm

3) blev beregnet ud fra følgende formel: volumen = (bredde x længde x højde) /2 [22]. Dyr blev aflivet 3 uger efter injektion af tumorceller, og tumorerne blev undersøgt og talt umiddelbart uden forudgående fiksering. Inden ofre, en noninvasiv billeddannende system (Ultra Sensitive Molecular Imaging System Berthold Nightowl, Berthold Technology, Oak Ridge, TN) blev anvendt til at spore kræft celler

in vivo

at bekræfte, at miRNA-29c overekspression plasmider stadig var til stede i cancercellerne. Denne billeddannelse strategi tilvejebringer en ikke-invasiv og ultrasensitiv fremgangsmåde til påvisning af transficerede plasmider, der udtrykker GFP. De anvender dyr protokoller godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Kaohsiung Medical University (IACUC Godkendelse nr: 99.052). I overensstemmelse med de ledende principper med Pleje og anvendelse af forsøgsdyr

Serum Forberedelse, RNA Extraction og miRNA-29c Expression Niveauer

veneblod blev opnået før operation. Blodprøverne blev centrifugeret ved 3000 rpm i 15 min, og serummet blev opdelt i alikvoter i 1,7 ml Eppendorf-rør. I mangel af en veldokumenteret stabilt udtrykte endogene cirkulerende miRNA at tjene som normalisering kontrol,

C. elegans

syntetisk

lin-4

miRNA (Cel-lin-4, varenummer: 4.398.988, Invitrogen), der blev føjet til forberedelse serum før RNA-ekstraktion blev brugt som en normalisering kontrol som i tidligere undersøgelser [ ,,,0],23], [24]. For RNA isoleret fra serum, blev 300 pi serum homogeniseret i 900 pi Trizol LS i henhold til producentens anvisninger (Invitrogen) med små modifikationer: 6 pi 1 nM Cel-lin-4 blev tilføjet i serumprøver. Derefter blev 250 pi chloroform til prøven og den blandede opløsning blev centrifugeret. Efter yderligere chloroformekstraktion og udfældning med isopropanol blev pelleten vaskes to gange ved centrifugering med 70% ethanol. RNA-pelleten blev tørret i 10 minutter ved stuetemperatur og opløst i 30 pi destilleret vand. DNase-behandling (Qiagen) blev udført til fjernelse af eventuelt kontaminerende DNA.

For at måle miRNA-29c ekspressionsniveauer, miRNA-29c cDNA blev syntetiseret og TaqMan miR RT-qPCR assay blev udført som gennemtrængelige beskrevet. De relative ekspressionsniveauer af miRNA-29c i serum blev normaliseret til den for Cel-lin-4 ved hjælp af ligningen: log

10 (2

-ΔCt), hvor ACt = (Ct

miRNA-29c – ct

Cel-lin-4). Gennemsnittet og standardafvigelsen (SD) værdier af log

10 (2

-ΔCt) blev beregnet.

Statistisk analyse

De kontinuerlige variabler blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) værdier og de dikotome variabler blev analyseret af Pearsons chi-square test og præsenteres som nummer og procentværdier. Kovariansanalyse blev udført ved anvendelse af JMP software (version 7.0.1, SAS Institute Inc., Cary, NC) for at sammenligne de gennemsnitlige miRNA-29c niveauer mellem tidlig og ikke-tidligt tilbagefald CRC patienter. Alder, blev køn, og stadium af CRC inkluderet som covariables i de statistiske modeller. En 2-tailed

P

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Den statistiske magt blev beregnet ved hjælp af online DSS Research Statistisk Power Calculator (https://www.dssresearch.com/Home.aspx), på følgende grundlag: ensidet test, en alfa på 0,05, serum på 20 tidligt tilbagefald patienter og 41 ikke-tidlige recidiverende patienter og de empiriske ekspressionsniveauerne i hver gruppe.

Resultater

demografiske data

de kendetegn for 107 uafhængige CRC patienter (56 ikke- tidligt tilbagefald og 51 tidligt tilbagefald patienter) er sammenfattet i tabel S1. De gennemsnitlige alder (år) af de tidlige recidiverende og ikke-tidlige recidiverende patienter var 67,20 og 64,90 henholdsvis med som skal være fra 24 til 88 år. Oplysninger om sygdommen stadium, køn og alder af de tidlige tilbagefald og ikke-tidlige recidiverende patienter er vist i tabel 1. Tidlig tilbagefald var signifikant associeret med tumortype og perineural invasion (

P

0,05, tabel 2), men alder, køn, tumorstørrelse, UICC stadium af patienter eller histologiske distributioner var ikke signifikant forskellig mellem tidlige og ikke-tidlige recidiverende patienter (

P

0,05, tabel 2)

Vi indsamlede serumprøver fra 61 CRC patienter (41 ikke-tidlige recidiverende og 20 tidligt tilbagefald patienter), før de har modtaget kirurgi. Kendetegnene for de 61 CRC patienter til serum undersøgelse er opsummeret i tabel S2. Af de 61 patienter, som donerede præoperative serumprøver, CRC tumorprøver var også tilgængelige for 38 patienter (30 non-tidligt recidiverende og 8 tidligt tilbagefald patienter). Derfor blev både serum og CRC prøver samtidigt analyseret for 38 patienter i nærværende undersøgelse.

miRNA Expression i tidlige og ikke-tidlige recidiverende Patienter

De miRNA-29c ekspressionsniveauerne i 107 CRC tumor prøverne var forskellige mellem tidlige og ikke-tidlig patienter med tilbagefald. Middelværdien af ​​log

10 (2

-ΔCt) var 0,67 i den ikke-tidlig Recidiverende gruppe og 0,37 i de tidlige recidiverende gruppe (

P =

0,021, fig. 1A). Derfor miRNA-29c var lavere i prøverne fra tidligt tilbagefald patienter ved 2,00 gange sammenlignet med at i prøver af ikke-tidlige recidiverende patienter. Dette svarer til vores tidligere rapport fra en 2,04-gange ændring [19]. Tidlig tilbagefald var signifikant associeret med perineural invasion, tumortype og lavere ekspression af tumor miRNA-29c ved univariate og multivariate analyser (tabel 2), men de miRNA-29c ekspressionsniveauer blev ikke signifikant forbundet med nogen klinisk-patologisk variabel (tabel 3). Derfor ekspressionen af ​​miRNA-29c er en uafhængig prædiktor faktor til detektering af tidlig tilbagefald af CRC. Disse resultater igen kontrollere vores tidligere oplysninger [19], og støtte miRNA-29c som en potentiel indikator for den tidlige tilbagefald af CRC efter operationen.

(A) miRNA-29c ekspressionsniveauerne i 56 ikke-tidligt og 51 tidlige tilbagefald CRC tumorprøver. Udtrykket niveauet faldt betydeligt i de tidlige tilbagefald tumorer (

P =

0,021). (B) WST-1 analysen viser, at miRNA-29c undertrykker tumorcelleproliferation (

P =

0,006). OMIR-29c viser Caco2 celleklon stabilt overudtrykker miRNA-29c, og NC angiver den negative kontrol stabil klon. (C) Overekspression af miRNA-29c bevirker en betydelig akkumulering af celler i G2 fase (

P =

0,02). Sort: G1 /G0 fasen; lysegrå: S-fasen; og mørkegrå: G2 fase. (D) Transwell assay viser, at overekspression af miRNA-29c undertrykker tumor-celle migration (

P

0,0001). (E) Overekspression af miRNA-29c påvirker ikke tumor-celle invasion (

P =

0,349). (F) Overekspression af miRNA-29c falder cellemigrering, som angivet ved en forskel på øget bredde i O miRNA-29c sammenlignet med NC ved 24 og 48 timer. Fotografierne viser hæmning af tumor celle migration blev opnået fra såret helbredende analysen.

For at klarlægge, hvilken rolle af miRNA-29c udtryk i begyndelsen af ​​recidiverende patienter, vi yderligere i forhold miRNA-29c udtryk mellem recidiverende

vs.

ikke-recidiverende grupper. Syv patienter i den ikke-tidlige recidiverende gruppe blev tilbagefald efter første år; derfor blev re-klassificeret i recidiverende gruppe. De miRNA-29c udtryk niveauer mellem recidiverende og ikke-tilbagefald patienter og gennemsnittet af log

10 (2

-ΔCt) var 0,65 i den ikke-recidiverende gruppe og 0,43 i recidiverende gruppe (

P

= 0,099, fig. ikke vist).

Overekspression af miRNA-29c påvirkninger Cell Proliferation og cellecyklusprogression

for at undersøge, hvilken rolle miRNA-29c i tumorigenese, vi evaluerede effekten af miRNA-29c på væksten af ​​Caco2 celler. Vi har etableret en Caco2 stabil klon (OMIR-29c) overekspression miRNA-29c. Den gennemsnitlige miRNA-29c niveau i OMIR-29c var 0,45 (udtrykt som log

10 (2

-ΔCt)), hvilket var højere end det gennemsnitlige niveau af miRNA-29c i den negative kontrol (NC) klon af 2,82-fold. Som vist i fig. 1B, spredning på OMIR-29c var kun 58,7% af satsen for NC efter 24 timer (

P =

0,006). Fordi nogle af de forudsagte miRNA-29c target gener er relateret til cellecyklusprogression og cellevækst, vi vurderet om miRNA-29c påvirket cellecyklussen ved flowcytometri. Vores data viser, at OMIR-29c signifikant øget ophobning af G2 cellepopulationen (19,4% i OMIR-29c

vs

14,7% i NC,

P =

0,02;.. Fig 1C) , let øget ophobning af G1 /G0 befolkning (47,1% i OMIR-29c

vs

. 43,1% i NC,

P =

0,43), og faldt ophobning af S- fase befolkning (33,48% i OMIR-29c

vs

. 42,21% i NC,

P

= 0,14). Disse resultater antydede, at overekspression af miRNA-29c hæmmer væksten af ​​tyktarmskræft celler på grund af den nedsatte S-fasen og fremkalde G2 anholdelse.

Ved spredning analyse med overgang transficeret har-miRNA-29c miRNA (miRNA-29c efterligner ) eller negativ kontrol (NC, Mirvana miRNA mimic) i Lovo, SW480 og SW620 celler, fandt vi, at spredningen på miRNA-29c overekspression celler var signifikant ned til 50,9% (Lovo) og 51,9% (SW480) af det sats på NC efter 24 timer (

P =

0,016 og 0,009 henholdsvis fig. S1). Imidlertid blev spredning på SW620 ikke vist signifikant forskellige (ned til 92,4%) i de miRNA-29c overekspression celler. Derfor, i tillæg til Caco2, miRNA-29c ville også undertrykke væksten af ​​tyktarmskræft cellelinjer:. Lovo og SW480, men ikke SW620

Virkninger af miRNA-29c Overekspression på Cell Migration

dataene fra transwell assay (. figur 1D) indikerede, at OMIR-29c vises langsommere migration end gjorde NC med 56% (

P

0,0001). Inhibering af migration blev også evalueret i en sårhelende assay, hvor bredden af ​​såret var 800 um. Bredden af ​​hullerne i NC og OMIR-29c var 100 og 180 um på 24 timer, henholdsvis og var 0 og 100 um ved 48 t. Disse resultater antydede, at celle migration blev signifikant reduceret i OMIR-29c. Disse analyser konsekvent viste, at cellemigration dramatisk blev nedsat, når miRNA-29c blev overudtrykt (fig. 1 F).

Virkninger af miRNA-29c Overekspression på Tumor Cell Invasion

Dataene fra Matrigel invasion assay viste ingen signifikante forskelle mellem OMIR-29c og NC-kloner vedrørende deres evne til invasion. Dette fund antydede, at overekspression af miRNA-29c ikke påvirkede invasion af tumorceller (

P =

0,349, Fig. 1E).

Effekt af Overekspression af miRNA-29c i nøgne mus

for yderligere at validere anti-tumorigenese effekt af miRNA-29c, vi undersøgte effekten af ​​miRNA-29c overekspression på tumorvækst

in vivo

. Efter subkutan injektion af OMIR-29c og NC-kloner i halsen på nøgne mus, tumormasserne blev palpable 7 dage efter inokulering og lodes vokse indtil udgangen af ​​tredje uge (fig. 2A). Mus, der modtog OMIR-29c celler havde signifikant mindre kræft klumper end gjorde dem, der modtog NC-celler (

P =

0,018;. Figur 2B og 2C). Data fra Ultra Sensitive Molecular Imaging strategi bekræftede overekspression af miRNA-29c i OMIR-29c klon 3 uger efter såning tumorceller via detektering af grøn fluorescens

protein

(fig. 2D). Resultaterne fra

in vivo

eksperiment gav yderligere støtte, at overekspression af miRNA-29c resulterer i en reduktion af tumor spredning i forsøgsdyr.

OMIR-29c er Caco2 klon stabilt overekspression miRNA-29c, og NC er kontrol stabil klon. (A) Fotografier af null mus subkutant injiceret med NC-celler (

N =

4, øverste panel) eller med OMIR-29c celler (

N =

4, nederste panel) blev taget 21 dage efter injektion. (B) tumoren klumper var mindre i OMIR-29c gruppe (nederste panel) end i NC-gruppen (øverste panel) efter 21 dage. (C) Tumoren (cm

3) vækstkurver for OMIR-29c (- – -, grå) og NC-celler (-; sort) over 21 dage (

P =

0,018). (D) Brug af Ultra Sensitive Molecular Imaging strategi, luciferaseaktiviteten i klumper kan scannes uden invasion fra fotografier af null mus subkutant injiceret med OMIR-29c celler taget 21 dage efter injektion.

Cirkulerende miRNA Expression i tidlige og ikke-tidlige recidiverende patienter

Præoperativ serum miRNA-29c niveauer signifikant forskellig mellem tidlige og ikke-tidlige recidiverende patienter. Gennemsnittet af log

10 (2

-ΔCt) var -3,841 i den ikke-tidlig-tilbagefald gruppe og -3,216 i tidlige tilbagefald gruppe (fig. 3A). Serum miRNA-29c niveauer var ikke signifikant forskellig mellem raske gruppe og ikke-tidlig-tilbagefald gruppe (

P

= 0,256), men miRNA-29c steget betydeligt i begyndelsen af ​​recidiverende patienter sammenlignet med den raske forsøgspersoner gruppen og ikke-tidligt recidiverende gruppe (

P

0,0001 og

P =

0,012 henholdsvis). Baseret på de serum data, vores stikprøvestørrelse på 61 opnåede en statistisk styrke på 83,1%. Gentagelse analyse af tidlig recidiverende (tom linie) og ikke-tidlige tilbagefald (grå linie) grupper blev vurderet af Kaplan-Meier-metoden og fornyet mønstre blev vist i fig. 3B.

(A) Udtrykket niveauer af cirkulerende miRNA-29c er dereguleret i serumprøver fra 23 raske forsøgspersoner, 41 ikke-tidligt og 20 tidlige-tilbagefald CRC patienter. Serum miRNA-29c niveauer var ikke signifikant forskellig mellem raske gruppe og ikke-tidlig-tilbagefald gruppe (

P

= 0,256). Ekspressionsniveauet er steget betydeligt i serum prøver af tidlig relaps patienter sammenligne med den sunde forsøgspersoner gruppe (

P

0,0001) og ikke-tidlig-tilbagefald gruppe (

P =

0,012 ). (B) Den tilbagefald analyse i CRC patienter blev vurderet af Kaplan-Meier-metoden og mønstrene for tidligt tilbagefald (blank linie) og ikke-tidlige tilbagefald (grå linje) grupper blev vist.

Diskussion

Stigende undersøgelse funktionen af ​​miRNA har skabt en ny æra, hvor tumorigenese kan blive bedre forstået. Men den rolle miRNA i gentagelse af CRC, især i begyndelsen af ​​recidiverende CRC, er fortsat uklart. For nylig, ved hjælp af beregningsmæssig analyse af mRNA-ekspression profiler, rapporterede vi, at miRNA-29c er en prædiktor for tidlig recidiverende CRC [19]. I den foreliggende undersøgelse, brugte vi en øget stikprøve at bekræfte, at miRNA-29c udtryk i tumorvæv og serum kan forudsige CRC tidlig tilbagefald, og vi gennemført en række

in vitro

in vivo

funktionelle studier for yderligere at præcisere, hvilken rolle af miRNA-29c i CRC tumorigenese.

In vitro

vi viste, at miRNA-29c fremtrædende hæmmer tyktarmskræft proliferation og migration, men ikke invasion. Overekspression af miRNA-29c kan standse cellecyklussen i G2-fase, hvilket fører til inhibering af celleproliferation. I nøgne mus, colon cancerceller overudtrykker miRNA-29c viste en signifikant langsommere vækst end gjorde kontrol cancerceller. Desuden blev de præoperative serumniveauer af miRNA-29c fremtrædende forbundet med postoperative tidlig recidiv. Derfor vores resultater fra cellulære, dyr, og humane undersøgelser konsekvent angivet, at miRNA-29c udøver en anti-tumorigenese effekt, og det kan være et nyttigt biomarkør til forudsigelse af tidlig tilbagefald i CRC patienter efter operationen.

Nylige undersøgelser har vist, at miRNA-29c er involveret i en række biologiske processer, herunder carcinogenese af forskellige humane cancere, såsom kronisk lymfatisk leukæmi [25], lungecancer [26], prostatacancer [27], og invasiv brystcancer [ ,,,0],28]. Men bortset fra vores seneste publikation [19], undersøgelser vedrørende rollen som miRNA-29c i CRC patogenese og tilbagefald er begrænsede. forbliver den kritiske rolle af miRNA-29c i reguleringen af ​​genekspression i tumorigenese at blive udforsket via målrettet mRNA profilering. Tumor nekrose faktor alfa-induceret protein 3 (TNFAIP3), en central regulator i inflammation og immunitet, viste sig at være omvendt korreleret med miRNA-29c niveauer og blev identificeret som et mål for miRNA-29c [29]. Overekspression af miRNA-29c i hepatitis B-virus-relaterede hepatocellulære carcinomceller undertrykkes effektivt TNFAIP3 ekspression og HBV-DNA-replikation, såvel som inhibering af celleproliferation og inducere apoptose [29]. miRNA-29c kan påvirke tumorigenese ved at arbejde inden for rammerne af velkendte tumorsuppressor (dvs. p53) veje. Den tumorsuppressor p53, kodet af

TP53

gen, indregnes som vogter af det menneskelige genom, fordi det regulerer mange nedstrøms gener at udøve sin funktion i cellecyklusprogression og celledød. Kumar

et al

påpegede, at mennesket

TP53

gen kan blive negativt reguleret af flere miRNA:. MiRNA-125b, miRNA-504, miRNA-25, og miRNA-30d [30] . En nylig undersøgelse har vist, at miRNA-29 også er involveret i p53 pathway, og miRNA-29 familiemedlemmer (miRNA-29a, miRNA-29b, og miRNA-29c) kan opregulere p53 niveauer og inducerer apoptose i en p53-afhængig måde ved direkte undertrykke p85 alpha (den regulerende underenhed af PI3-kinase) og cdc42 (a Rho familie GTPase [31]. Vores seneste arbejde på miRNA-29c målgener foreslog, at DNMT3A, DNMT3B, og p53 sandsynligvis er involveret i den potentielle pathway af CRC udvikling [19]. de ovennævnte undersøgelser giver bevis for den rolle af miRNA-29c i at undertrykke CRC progression eller tilbagefald. Ligeledes en nylig undersøgelse viste, at miRNA-29c ofte blev nedreguleret i væv ramt af esophageal planocellulært karcinom, og miRNA-29c kunne undertrykke tumorvækst ved at inducere cellecyklus G (1) /G (0) standse hovedsagelig gennem modulering af cyclin E-ekspression [32]. Ligeledes har vi vist, at overekspression af miRNA-29c kan inhibere proliferationen af ​​coloncancerceller ved at reducere ophobning af S-fasen befolkning.

Vores data viser, at miRNA-29c fremtrædende hæmmer proliferation og migration af tyktarmskræft celler, men har ingen effekt på celle invasion.