PLoS ONE: Praziquantel synergistisk Paclitaxel Effekt til at hæmme kræft Cell Growth

Abstrakt

De store udfordringer, vi står over for i kræftbehandling med paclitaxel (PTX) er stoffet modstand og alvorlige bivirkninger. Der er gjort en massiv indsats for at overvinde disse kliniske udfordringer ved at kombinere PTX med andre lægemidler. I denne undersøgelse, rapporterede vi de første prækliniske data, praziquantel (PZQ), en anti-parasit middel, kunne i høj grad øge anticancer effekt af PTX i forskellige cancer cellelinjer, herunder PTX-resistente cellelinier. Baseret på kombinationen indeksværdien, demonstrerede vi, at PZQ synergistisk forbedret PTX-induceret cellevækstinhiberingen. Samtidig behandling af PZQ og PTX også fremkaldt betydelig mitosestandsning og aktiveret apoptotiske kaskade. Desuden PZQ kombineret med PTX resulterede i en mere udtalt hæmning af tumorvækst sammenlignet med enten lægemiddel alene i en mus xenograft model. Vi forsøgte at undersøge de mulige mekanismer af denne synergistiske virkning induceret af PZQ og PTX, og vi fandt, at co-behandling af de to lægemidler markant kunne formindske ekspression af X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP), et anti-apoptotisk protein . Vores data yderligere vist, at nedregulering af XIAP var nødvendig for den synergistiske samspil mellem PZQ og PTX. Tilsammen denne undersøgelse antydede, at kombinationen af ​​PZQ og PTX kan repræsentere en hidtil ukendt og effektiv anticancer strategi til optimering PTX terapi

Henvisning:. Wu ZH, Lu Mk, Hu LY, Li X (2012) Praziquantel synergistisk paclitaxel Effekt til at inhibere væksten af ​​cancerceller. PLoS ONE 7 (12): e51721. doi: 10,1371 /journal.pone.0051721

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: Juli 19, 2012; Accepteret: 5. november 2012; Udgivet: 12. december, 2012 |

Copyright: © 2012 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Foundation for Fremme talenter Basic Science, Kina (J1030626) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm); Nøglen projekt af Fujian Provincial Programmer for Videnskab og Teknologi (2011Y0050); og The Technology Innovation Foundation for Videnskab og Teknologi Bureau of Xiamen, Kina (2011S0567). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det blev en ny tendens, som vender en gammel stof til nye anvendelser, især til behandling af cancer, fordi disse rutinemæssigt anvendes gamle lægemidler kan have en skjult talent eller godt potentiale i behandlingen af ​​kræft. Faktum er, at al oparbejdning allerede er sket, hvilket giver os mulighed for at flytte lægemidlet i kliniske hurtigere og reducere omkostningerne for lægemiddeludvikling [1], [2]. Begrebet “nye anvendelsesmuligheder for gamle lægemidler” giver en effektiv måde at genopdage nye anvendelser for eksisterende lægemidler med kendte farmakokinetik og sikkerhedsprofil. Nogle vellykkede eksempler på denne form for udvikling af kræft narkotika blev tidligere rapporteret som Thalidomid [3], C-vitamin [4] – [6], NSAID (steroide anti-inflammatoriske lægemidler) [7] – [11]. For nylig er det blevet rapporteret, at artemisinin, et anti-parasit middel, og dets derivater, havde dyb cytotoksicitet mod cancerceller fra forskellige tumorer [12] – [16], der giver impulser til at udvikle anti-parasit medicin i lægemidler mod cancer. Praziquantel (PZQ), en anden anti-parasit middel, har været meget anvendt til at behandle forskellige schistosomiasis med god effekt [17], [18]. Interessant nok blev det rapporteret, at PZQ kan forbedre de humorale og cellulære immunreaktioner hos værten mod sygdomme [19], [20]. Det ville være interessant at undersøge, om PZQ har anticancer aktivitet, der er stadig uklart hidtil.

I denne undersøgelse, drab aktivitet PZQ på kræftceller blev vurderet med forskellige analyser. Vi undersøgte også effekten af ​​kombineret behandling med PZQ og den almindeligt anvendte kemoterapeutiske stof paclitaxel (PTX). PTX er en mikrotubulus-stabiliserende middel, som kan fremme stabilisering mikrotubulus, hvilket resulterer i standsning af celler i G2 /M-fasen af ​​cellecyklus og føre til apoptose [21], [22]. Som en af ​​de mest almindeligt anvendte anticancerlægemidler, har PTX demonstreret stærk virkning mod en lang række af maligniteter, herunder bryst-, hoved og hals, ovarie og ikke-småcellet lungekræft, samt Kaposis sarkom [23]. Men fremkomsten af ​​klinisk resistens og bred vifte af alvorlige bivirkninger stadig væsentlige problemer med PTX terapi [24] – [26]. Følgelig adskillige nylige undersøgelser fokuseret på PTX synergistiske terapi til formål at finde en effektiv løsning til at overvinde PTX-resistent problem og reducere toksicitet induceret af PTX uden at kompromittere lægemiddeleffektivitet [27], [28].

Her vi rapporteret at PZQ synergistisk kan øge væksthæmmende virkning af PTX i forskellige cancercellelinier, herunder PTX-resistente cellelinier, såsom DLD1 og H1299, selvom PZQ behandling alene ikke udøvede cytotoksicitet på disse cancerceller. PZQ kunne også i høj grad øge PTX-induceret mitosestandsning og apoptose. I yderligere undersøgelser, viste vi, at dette cytotoksiske synergi mellem PZQ og PTX involveret nedregulering af XIAP. Evne PZQ at forstærke anticancer effekter af PTX blev efterfølgende bekræftet i en mus xenograft model. Disse resultater forudsat vigtige implikationer for optimering PTX terapi. Kombinere PZQ med PTX kan repræsentere en hidtil ukendt og effektiv anticancer strategi.

Materialer og metoder Salg

cellelinier og cellekultur

human coloncancer cellelinie DLD-1, brystcancer cellelinie ZR-7530, lungecancer cellelinier SPC-a-1 og Ltep-a-2 blev dyrket i RPMI 1640. humant ikke-småcellet lungecancer-cellelinie H1299, livmoderhalskræft cellelinie HeLa og human brystcancer-cellelinie Bcap37 blev opretholdt i DMEM. Alle medier blev suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (GIBCO, Carlsbad, CA), 100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Alle cellelinier blev opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellelinjer var fri for mycoplasma, når de afprøves ved en PCR-baseret mycoplasma test [29], [30].

Reagenser og antistoffer

Paclitaxel (PTX), roscovitin, kanin polyklonale antistof mod Bim, Puma, og det monoklonale muse-antistof (mAb) mod β-actin blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Praziquantel (PZQ) blev venligst stillet til rådighed af Dr. juni Lu (Nanjing Pharmaceutical fabrik co., LTD, Nanjing, Kina). MG132 var fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland). Kaninen polyklonale antistof mod spaltede poly (ADP-ribose) polymerase (PARP; P89) og phospho-histon H3 (Ser-10) (P-H3) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Kaninen polyklonale antistof mod Noxa, bax, bak, caspase-3, survivin, Bcl-2, og Bcl-X

L var fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Musen mAb mod XIAP var fra BD Transduktion Laboratories (San Diego, CA). Gede-anti-kanin og gede-anti-muse peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev købt hos Pierce Biotechnology (Rockford, IL).

Cell Levedygtighed Assay

Cellelevedygtighed blev bestemt ved 3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Celler udplades i 96-brønds plader blev inkuberet med angivne lægemidler ved 37 ° C i forskellige tidsrum. Derefter blev dyrkningsmediet fjernet, og medium indeholdende MTT (0,5 mg /ml) blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i yderligere 2-4 timer i en CO

2 inkubator ved 37 ° C. Formazankrystallerne blev opløst i 100% DMSO, og absorbans ved 570 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser. Hver prøve blev målt i tre eksemplarer og gentaget tre gange. Den procentvise andel af overlevelse blev beregnet ved at dividere absorbansen af ​​behandlede celler ved for kontrollen i hvert forsøg. PTX og PZQ som enkelte agenter og i kombination ved de højeste koncentrationer, der anvendes i de rapporterede forsøg ikke forstyrrer de MTT assay reagenser i vores kontrolforsøg (data ikke vist).

Cell CycleAnalysis

til analyse af DNA-indhold og cellecyklus ved flowcytometri blev cellerne høstet, vasket en gang med PBS og fikseret i 70% ethanol ved 4 ° C natten over. På tidspunktet for flowcytometrianalyse blev celler vasket med PBS og resuspenderet i farveopløsning (100 ug /ml RNase og 100 pg /ml propidiumiodid i PBS). Efter cellerne blev inkuberet i 30 min ved 37 ° C i mørke, blev fordelingen cellecyklus analyseret med en Coulter EPICS XL flowcytometer (Beckman Coulter, Miami, FL).

Western blot-analyse

Western blot-analyse blev udført som tidligere [31] beskrevne. Kort beskrevet blev celler høstet og lyseret i lysepuffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, 1 mM phenylmethansulfonylfluorid, 10 ug /ml leupeptin, 2 ug /ml aprotinin, 10 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) assay. Cellulære proteiner blev underkastet natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidendifluoridmembran (Millipore, Bedford, MA). Membraner blev blokeret med TBS-Tween 20 (0,5%) indeholdende 5% fedtfri mælk i 2 timer ved stuetemperatur og inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Efter tre vaske med TBS-Tween 20 blev membranerne inkuberet med gede-anti-kanin eller gede-anti-muse peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Membranerne blev vasket med TBS Tween-20 igen og udviklet af forøget kemiluminescens (Pierce, Rockford, IL). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. De primære antistoffer blev anvendt i en 1:1000 fortynding, undtagen for anti-β-actin, der blev anvendt ved en 1:5000 fortynding. De anti-kanin eller anti-muse peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev anvendt i en fortynding på 1:5000.

DAPI Staining

Efter lægemiddelbehandling, celler dyrket i plader med 6 brønde var vasket med PBS og fikseret med 3,7% formaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, derefter inkuberet med farveopløsning (0,3% Triton-X 100 og 1 ug /ml DAPI i PBS) i 5 minutter undgå lys ved stuetemperatur. Celler blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi (Nikon). Celler med fragmenterede og ensartet kondenserede kerner blev betragtet som apoptotiske celler, og apoptose blev udtrykt som en procentdel beregnes ud fra antallet af celler med apoptotisk cellekernemorfologi divideret med det totale antal celler undersøgt.

kolonidannelse Assay

celler blev podet i plader med 6 brønde ved 1,5 x 10

3 celler per brønd og udsat for lægemiddelbehandling. Efter 10 dage blev cellerne fikseret og farvet med krystalviolet (0,5% krystalviolet og 20% ​​methanol) i 30 minutter. Derefter blev pladerne vasket med destilleret vand og fotograferet. Kolonier, der indeholdt mere end 50 celler blev talt. Værdier for hver betingelse blev udtrykt i procent i forhold til vehikelbehandlede kontroller. Hvert assay betingelse blev udført i mindst tre uafhængige forsøg.

immunfluorescensfarvning

Celler på dækglas blev fikseret i 4% paraformaldehyd i PBS ved stuetemperatur i 10 minutter, vasket med PBS, permeabiliseret med 0,2% Triton-X100 i PBS i 10 minutter, og derefter blokeret med 3% bovint serumalbumin i PBS ved stuetemperatur i 30 min. Anti-Phospho-histon H3 (Ser-10) (P-H3) antistof (fortynding 1:100) blev tilsat og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS indeholdende 0,02% Triton X-100 og 1,5% BSA, blev dækglassene inkuberet med Alexa Fluor 647-konjugeret gede anti-kanin IgG (fortynding 1:200) i 30 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev cellerne inkuberet med 1 ug /ml DAPI i PBS i 5 minutter før monteret i 90% glycerol og forseglet med neglelak. Mitoseindekset blev udtrykt som en procentdel af P-H3-positive-celler i forhold til det samlede antal celler undersøgt.

Plasmider, Cell Transfektion og RNA Interference

XIAP-udtrykkende plasmid pcDNA3- myc-XIAP var en gave fra Dr. John C. Reed (The Burnham Institute, La Jolla, USA) og det tomme pcDNA3 blev anvendt som en negativ kontrol. Celletransfektion blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner.

For at knockdown XIAP blev shRNA targeting XIAP sekvens (GTGGTAGTCCTGTTTCAGC) klonet ind i en lentiviral vektor Lenti-Lox3.7 (PLL3 .7). En sekvens med nogen tilsvarende del i det humane genom (GATCATGTAGATACGCTCA) blev anvendt som kontrol. Til produktion af infektiøse shRNA-udtrykkende lentivirus blev 293 T-celler transficeret med pLL3.7 lentiviral vector sammen med pakkevektorer pVSV-G, pRSV-Rev og pMDL gag /pol RRE. 48 timer efter transfektion blev virusholdige supernatant medier høstet, passeres gennem et 0,45 um filter og anvendes til inficerede celler efter tilsætning af 10 ug /ml Polybrene.

Real-time Reverse Transcription-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Første-streng cDNA blev syntetiseret fra det totale RNA under anvendelse af en oligo-dT primer og Moloney leukæmivirus revers transkriptase (Takara, Shiga, Japan). Real-time PCR blev udført på rotoren-Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Australien) og SYBR green (BIO-V, Xiamen, Kina) blev anvendt som et påvisningsreagens. Primersekvenserne for XIAP og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) var: XIAP (fremadrettet: 5′-GACAGTATGCAAGATGAGTCAAGTCA-3 ‘; revers: 5′-GCAAAGCTTCTCCTCTTGCAG-3′), GAPDH (fremadrettet: 5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3 «revers: 5’-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3 ‘). Hver prøve blev kørt tredobbelt. Dataanalyse blev udført med Rotor-Gene 6000-serien software 1.7 (Corbett Research, Mortlake, Australien). De relative RNA mængder blev normaliseret til GAPDH mRNA.

xenograft og behandlingsprocedurer

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Xiamen University. Tumorceller (DLD-1, 2 × 10

6) injiceret subkutant i athymiske nøgne mus (BALB /c, 4-5 uger gamle). Når tumor volumen nåede 25-35 mm

3, dyr blev randomiseret til forskellige behandlingsgrupper (n = 6 i hver gruppe). Dyr blev injiceret intraperitonealt med PZQ alene (100 mg /kg), PTX alene (30 mg /kg), eller en kombination af PZQ (100 mg /kg) og PTX (30 mg /kg). PTX blev opløst i lige store volumener af Cremophor EL og ethanol, og yderligere fortyndet med PBS inden injektion. PTX blev givet på dag 5, 9 og 13 efter tumorcelle-injektion. PZQ opløst i majsolie blev givet på dag 5, 7, 9, 11, og 13 efter tumorcelle-injektion. For monoterapi behandling blev køretøj givet i stedet for PZQ eller PTX med den samme tidsplan. Tumorstørrelse blev bestemt ved anvendelse skydelære. Tumorvolumen (mm

3) blev beregnet ved formlen: (a) × (b

2) × 0,5, hvor a er tumorlængde og b er tumor bredde i millimeter

Statistisk analyse.

Værdier blev udtrykt som middel ± SEM. For at bestemme væsentlige forskelle i dataene, den tosidede uparrede Students

t

test blev anvendt. Forskelle blev anset for at være statistisk signifikant ved P 0,05. Lægemiddelinteraktioner blev undersøgt for synergisme eller antagonisme hjælp Median Dose Effect analyse. (CalcuSyn, Biosoft, Ferguson, MO)

Resultater

PZQ ikke udøve nogen cytotoksicitet på tumorceller

cytotoksiciteten af ​​PZQ på forskellige tumorceller blev først undersøgt med tumorcellelinier herunder lungekræft celler (SPC-a-1, Ltep-en-2 og H1299), brystcancerceller (Bcap37 og ZR7530), cervikale carcinomceller (HeLa ) og coloncancer-celler (DLD-1). Imidlertid PZQ inducerede hverken vækstinhibering eller apoptose selv ved koncentrationer så høje som 100 uM (fig. S1), hvilket indikerer, at PZQ ikke udøve nogen cytotoksicitet på tumorceller.

Co-behandling af PZQ og PTX Synergistisk hæmmer tumorcellevækst

Vi næste vurderet, om PZQ kunne påvirke følsomheden af ​​tumorceller over for kemoterapeutiske midler, såsom paclitaxel (PTX) ved MTT-assayet. Vi fandt, at PZQ langt mere vækstinhibering af PTX i forskellige tumorcellelinier, herunder to PTX-resistente cellelinier, DLD-1 og H1299 (fig. 1A, Fig. S2). Vi gjorde de fleste af vores følgende eksperimenter med disse to PTX-resistente cellelinier. For at få yderligere indsigt i denne kombination effekt, blev dosis-respons undersøgelser udføres som vist i fig. 1B. PZQ kan øge følsomheden af ​​DLD-1-celler til PTX ved forskellige koncentrationer af PTX og PZQ. Kolonidannelse assayet viste også, at kombinationen af ​​PZQ og PTX bemærkelsesværdigt undertrykt kolonidannelse i forhold til hvert middel behandling alene (fig. 1C). Median Dose Effect analyse blev anvendt til at karakterisere interaktioner mellem PZQ og PTX i forbindelse med at falde i cellelevedygtighed. Kombination indeksværdier 1,0, afledt af effekten af ​​en række PZQ og PTX-koncentrationer i DLD-1 og H1299 cellelinier, viste en synergistisk virkning mellem PZQ og PTX

(A (figur 1D.). ) cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assay efter forskellige cancercellelinier blev behandlet med PZQ alene, PTX alene eller kombineret begge lægemidler i koncentrationer og tidspunkter som angivet følgende: HeLa, ZR7530, DLD-1 og H1299-celler blev behandlet med 20 pM PZQ alene, 10 nM PTX alene eller kombineres begge i 48 timer; Bcap37 og SPC-A-1-celler blev behandlet med 30 pM PZQ, 5 nM PTX alene, eller begge i 48 timer; Ltep-A-2-celler blev behandlet med 30 pM PZQ alene, 5 nM PTX alene, eller begge i 60 timer. (B) DLD-1 blev behandlet med de angivne koncentrationer af PTX i fravær eller nærvær af 20 eller 40 uM PZQ i 48 timer. Cellelevedygtighed blev derefter bestemt ved MTT-assayet. (C) DLD-1 og H1299-celler blev behandlet med 20 pM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller kombinationen i 10 dage. Kolonier blev derefter farvet med krystalviolet og talt. (D) DLD-1 og H1299-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af PZQ og PTX på et fast forhold (2000:1) i 48 timer. Efter cellelevedygtighed blev bestemt i hver betingelse blev kombinationen indeks (Cl) beregnet som beskrevet i “Materialer og metoder”. Cl-værdier 1,0 foreslå en synergistisk vekselvirkning mellem de to lægemidler. Alle værdier repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre separate forsøg.

Effekt af kombinationen af ​​PZQ og PTX på Apoptose Induktion

For yderligere at bekræfte potensering af PTX-induceret celledød ved PZQ, analyserede vi celleekstrakter for ekspression af apoptotiske markører, såsom poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning. Kombinationen resulterede i markant spaltning af PARP i en række forskellige cellelinjer, hvorimod indgivelse af PZQ eller PTX alene ikke (fig. 2A), hvilket indikerer betydelig aktivering af den apoptotiske kaskade af denne kombination. Desuden blev procentdelen af ​​sub-G1 population bestemt ved flowcytometri. Som vist i fig. 2B, sammenlignet med behandling med enten agent alene, co-behandling af PZQ med PTX markant øget ophobning af celler i sub-G1 fasen. Vi bekræftede også disse resultater ved kernemagnetisk farvning med DAPI, en alternativ celle apoptose assay. Procentdelen af ​​celler med apoptotiske kerner var signifikant højere i kombinationen gruppen end i single-behandlingsgruppe (data ikke vist). Vi undersøgte dernæst bidrag caspaser til apoptose induceret af co-behandling af PZQ og PTX. Som vist i fig. 2C, caspase 3-aktivering og PARP-spaltning blev blokeret ved den bredspektrede caspaseinhibitor zVAD-fmk. Behandling med zVAD-fmk også i høj grad blokeret apoptose induceret af co-behandling af PZQ og PTX (fig. 2D). Disse resultater antydede, at celle apoptose induceret af co-behandling af PTX og PZQ afhang caspase aktivitet.

(A) De angivne cellelinier blev behandlet som i fig. 1A, og apoptose blev undersøgt ved Western-analyse af den spaltede PARP (cle-PARP) niveau. (B) DLD-1 og H1299-celler blev behandlet med 20 pM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller kombinationen i 48 timer. Derefter sub-G1 fraktion blev bestemt ved flowcytometri. (C) DLD-1-celler blev behandlet med 20 pM PZQ og 10 nM PTX i fravær eller nærvær af 20 uM caspaseinhibitor zVAD-fmk i 48 timer, og ekspressionen af ​​caspase 3 og cle-PARP blev undersøgt ved Western blot. (D) Efter DLD-1-celler blev behandlet som i C, blev procentdelen af ​​apoptotiske celler bestemt ved DAPI-farvning. Alle Værdier repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre separate forsøg.

Co-behandling af PZQ og PTX kunne Fremkald mitosestandsning i tumorceller

Flowcytometri blev brugt til at undersøge virkningerne af PZQ og PTX på cellecyklusfordeling af tumorceller. Co-behandling af PZQ og PTX dosisafhængigt øget G2 /M population sammenlignet med PTX-behandling alene i DLD-1-celler (fig. 3A). At tydeliggøre profilen af ​​G2 /M-akkumulerede celler induceret af kombinationen, undersøgte vi mitotisk indeks i DLD-1 celler behandlet med PTX i fravær eller nærvær af PZQ. Som forventet PTX-behandling alene dosisafhængigt øget mitotisk indeks (fig. 3B). PTX i kombination med PZQ yderligere ført til en stigning i mitotisk indeks (fig. 3B). Vi fandt også, PZQ dramatisk kunne fremme PTX-medieret stigning i ekspressionsniveauet af phosphoryleret histon H3 (Ser-10) (P-H3), en mitotisk markør (fig. 3C). Disse resultater antydede, at PZQ forbedret PTX-induceret mitosestandsning i tumorceller.

(A) DLD-1 celler blev behandlet med 10 nM eller 20 nM PTX i fravær eller nærvær af 20 uM PZQ i 12 timer, og cellecyklus blev analyseret ved flowcytometri. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Efter DLD-1-celler blev behandlet som ovenfor blev mitoseindeks bestemt som beskrevet i “Materialer og metoder” (B), og ekspressionsniveauet af phospho-histon H3 (Ser-10) (P-H3) blev overvåget ved Western blot ( C). Værdier repræsenterer middel ± SEM fra tre separate forsøg.

En tidsforløbsforsøg baseret på flowcytometri viste, at stigningen i G2 /M population forud den for sub-G1 population i DLD-1 celler behandlet med kombinationen af ​​PZQ og PTX (fig. 4A), hvilket indikerer vedvarende G2 /M arrest sandsynligvis ført til apoptose. Vi undersøgte derefter, om der var en sammenhæng mellem mitosestandsning og apoptose induceret af co-behandling af PZQ og PTX. En inhibitor af CDK, roscovitin, blev anvendt. Roscovitin kunne selektivt hæmmer CDK1, CDK2 og CDK5 og blokere cellecyklusprogression ved at forhindre celler i at komme ind S og M faser [32]. Som vist i fig. 4B, inhiberede roscovitin næsten fuldstændigt G2 /M standsning induceret af co-behandling af PZQ og PTX i DLD-1-celler. Stigningen i mitotisk indeks skyldtes co-behandling af PZQ og PTX også returneres til kontrolniveauet efter tilsætning af roscovitin (fig. 4C), hvilket indikerer, at roscovitin inhiberede mitosestandsning induceret af denne kombination. Slående, roscovitin også inhiberede PZQ-forstærket PTX-medieret apoptose næsten fuldstændigt som bestemt ved apoptotisk sub-G1 population og Western-analyse af spaltet PARP (Fig. 4D og E). Lignende resultater blev opnået med H1299 celler (data ikke vist). Disse data antydede, at øget apoptose induceret af co-behandling af PZQ og PTX sandsynligvis skyldtes øget mitosestandsning induceret af denne co-behandling.

(A) Efter DLD-1-celler blev co-behandlet med 20 pM PZQ og 10 nM PTX for angivne tidspunkter blev G2 /M og Sub-G1 fraktioner bestemt ved flowcytometri. (B) DLD-1 celler blev behandlet med en kombination af PZQ (20 uM) og PTX (10 nM) med eller uden 12,5 pM roscovitin i 12 timer, og derefter cellecyklussen blev analyseret ved flowcytometri. (C) DLD-1-celler blev behandlet som i (B), og mitotisk indeks blev bestemt. Efter DLD-1 blev behandlet med en kombination af PZQ (20 uM) og PTX (10 nM) i nærvær eller fravær af 12,5 pM roscovitin i 48 timer blev Apoptose vurderet ved flowcytometri analyse af Sub-G1 population (D) og Western-analyse af cle-PARP niveau (E). Alle værdier er vist som gennemsnit ± SEM fra tre separate forsøg.

Co-behandling af PZQ og PTX kunne nedregulere XIAP Protein

For at vurdere den underliggende mekanisme af synergistisk cytotoksicitet mellem PZQ og PTX, vi vurderet virkningerne af de to agenter, enten alene eller i kombination, om forskellige apoptose regulatoriske proteiner i DLD-1 celler. Som vist i fig. 5A, behandling med PZQ eller PTX alene ændrede ikke udtryk for XIAP. Men eksponering af celler for kombinationen af ​​PZQ og PTX resulterede i en bemærkelsesværdig nedgang i niveauet af XIAP. Ingen væsentlige ændringer i ekspressionen af ​​andre proteiner, såsom Bcl-X

L, overlevende, Puma, Bim, Noxa, Bax og Bak, blev observeret i celler udsat for PTX alene, PZQ alene eller kombinationen.

(A) DLD-1-celler blev behandlet med 20 pM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller kombinationen i 24 timer. Derefter ekspression af Bd-XL, Bcl-2, Survivin, XIAP, Bim, Puma, Noxa, Bax og Bak blev overvåget ved Western blot. (B) efter eksponering af DLD-1-celler til en kombination af 20 pM PZQ og 10 nM PTX i nærvær eller fravær af 20 uM zVAD-fmk i 24 timer blev ekspression af XIAP bestemt ved Western blot. (C) H1299-celler blev behandlet med 20 pM PZQ alene, 10 nM PTX alene, eller kombinationen i 24 timer, hvorefter ekspression af XIAP blev undersøgt. (D) Efter DLD-1-celler blev behandlet som i (A), total RNA blev isoleret og XIAP-mRNA blev kvantificeret ved real-time RT-PCR. Efter normalisering til GAPDH mRNA, de XIAP mRNA ekspression værdier for hver tilstand var i forhold til bærerbehandlede kontrol celler. (E) DLD-1-celler blev behandlet med en kombination af 20 pM PZQ og 10 nM PTX i fravær eller nærvær af 10 uM MG132 i 24 timer, og derefter ekspression af XIAP blev overvåget ved Western-blot. Værdier repræsenterer middel ± SEM fra tre separate forsøg.

For at bestemme, hvorvidt ændringer i ekspression af XIAP var afhængige af caspaseaktivering behandlede vi DLD-1-celler med lægemiddelkombinationen i nærvær eller fravær af caspaseinhibitor zVAD-fmk. Som vist i fig. 5B, zVAD-fmk havde ringe virkning på nedregulering af XIAP induceret af kombinationen af ​​PZQ og PTX, hvilket indikerer, at ændringer i ekspression af XIAP var caspase-uafhængig. Nedregulering af XIAP blev også observeret i H1299-celler co-behandlet med PZQ og PTX (fig. 5C), hvilket antyder, at modulering af dette protein kan ikke være cellelinie specifikke.

Vi forsøgte at identificere den mekanisme, som XIAP blev nedreguleret som reaktion på co-behandling af PZQ og PTX. For at undersøge om den fælles behandling af PZQ og PTX kunne regulere XIAP ekspression på det transskriptionelle niveau, anvendte vi revers transkription-PCR. Sammenlignet med kontrolgruppen, havde kombineret behandling med PZQ og PTX ikke føre til væsentlige ændringer i mRNA-niveauerne af XIAP (fig. 5D).

En anden mulig forklaring på XIAP nedregulering kunne være nedbrydning af XIAP ved proteasomet. For at teste denne hypotese, behandlede vi DLD-1-celler med medikamentet kombination i nærværelse af en proteasominhibitor, MG132. Undertrykkelse af XIAP i DLD-1 celler behandlet med kombinationen af ​​PZQ og PTX blev næsten fuldstændig afskaffet ved MG132 (fig. 5E). Disse resultater viste, at PZQ og PTX kunne fremkalde XIAP nedbrydning via proteasomet-medieret vej.

XIAP spiller en vigtig rolle i den synergistiske cytotoksicitet PZQ og PTX

På baggrund af ovenstående resultater, vi undersøgte om nedregulering af XIAP faktisk medieret celledød induceret af kombinationen af ​​PZQ og PTX. Vi transient transficeret DLD-1-celler med et plasmid indeholdende epitop-tagget XIAP (myc-XIAP) og en tom plasmid, der tjente som kontrol. Transfektion blev bekræftet ved Western blot (fig. 6A). Overekspression af XIAP i DLD-1 celler betydeligt svækket PZQ-forstærket PTX-induceret cytotoksicitet, som bestemmes ved analyse af cellernes levedygtighed og sub-G1 befolkning (fig. 6B og C).

(A) Western blot viste XIAP-ekspression i DLD-1-celler ved 24 timer efter transfektion med pcDNA3-myc-XIAP eller kontrol vektor. (B) 24 timer efter transfektion med pcDNA3-myc-XIAP og styrevektor blev DLD-1-celler behandlet med 20 pM PZQ alene, 10 nM PTX alene eller kombinationen i 48 timer, og derefter cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assayet. (C) 24 timer efter transfektion med pcDNA3-myc-XIAP og styrevektor blev DLD-1-celler behandlet med en kombination af 20 pM PZQ og 10 nM PTX. Derefter fraktion sub-G1 blev bestemt ved flowcytometri. (D) DLD-1 celler blev inficeret med et lentivirus kodende kontrol shRNA eller XIAP shRNA i 48 timer, og ekspression af XIAP blev analyseret ved Western blot. (E) DLD-1 celler blev inficeret med et lentivirus kodende kontrol shRNA eller XIAP shRNA i 48 timer og derefter behandlet med 20 pM PZQ alene, 10 nM PTX alene eller kombinationen i 48 timer. Cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assayet. Alle værdier er vist som gennemsnit ± SEM fra tre separate forsøg.

For yderligere at studere rolle XIAP i synergien mellem PZQ og PTX, vi brugte lentivirus-medieret kort hårnål RNA (shRNA) til knockdown XIAP i DLD-1-celler. Celler blev høstet ved 48 timer efter infektion, og XIAP-ekspression blev analyseret ved Western blot. Sammenlignet med DLD-1-celler inficeret med kontrol shRNA, de viste celler inficeret med XIAP shRNA dramatisk undertrykt XIAP-ekspression (fig. 6D). Vi næste vurderede effekten af ​​XIAP knockdown på celle levedygtighed. Som vist i fig. 6E, blokering ekspression af XIAP havde ingen virkning på følsomheden af ​​DLD-1-celler til PZQ behandling. Imidlertid XIAP knockdown betydeligt sensibiliseret DLD-1-celler til PTX-induceret cytotoksicitet (Fig. 6E). Endvidere cytotoksicitet induceret af co-behandling af PZQ og PTX blev også forbedret i XIAP-knockdown DLD-1-celler (fig. 6E). Disse data tyder på, at XIAP spiller en væsentlig rolle i at mediere den synergistiske cytotoksicitet forårsaget af co-behandling af PZQ og PTX.

Kombinationen af ​​PZQ og PTX Undertrykker Tumor Vækst

in vivo

for at teste, om co-behandling af PZQ og PTX har nogen virkning på tumorvækst

in vivo

, vi etableret en xenograftmodel i nøgne mus med PTX-resistente DLD-1 celler. Subkutant injiceret DLD-1-celler gav anledning til eksponentielt voksende tumorer i athymiske nøgne mus (fig. 7A). Kombineret behandling med PZQ og PTX spænder undertrykt tumorvækst i forhold til PTX behandling alene, mens PZQ indgivet alene ikke var i stand til at inhibere tumorvækst i DLD-1 xenograft-bærende mus (fig. 7A og B). Sammenlignet med kontrolgruppen, behandling med PZQ og PTX kombination resulterede i et reduktion i tumorvægt (Fig 7C.) 50%.