PLoS ONE: et lille molekyle hæmmer af ETV1, YK-4-279, Forhindrer prostatakræft vækst og metastase i en mus xenotransplantat Model

Abstrakt

Baggrund

erythroblastosis virus E26 omdanne sekvenser (

ETS

) familie af transkriptionsfaktorer består af en stærkt bevaret gruppe af gener, der spiller en vigtig rolle i cellulær proliferation, differentiering, migration og invasion. Kromosomtranslokationer fusing ETS faktorer at initiativtagere til androgen responsive gener er blevet fundet i prostatakræft, herunder de mest klinisk aggressive former. ERG og ETV1 er de mest almindeligt translokeres ETS proteiner. Over-ekspression af disse proteiner i prostatakræft celler resulterer i en mere invasiv fænotype. Hæmning af ETS aktivitet af små molekyler hæmmere kan give en ny metode til behandling af prostatacancer.

Metoder og Resultater

Vi har for nylig vist, at det lille molekyle YK-4-279 hæmmer biologisk aktivitet af ETV1 i fusion-positive prostatacancerceller fører til nedsat motilitet og invasion

in vitro

. Her præsenteres data fra en

in vivo

mus xenograftmodel. SCID-beige-mus blev subkutant implanteret med fusion-positive LNCaP-luc-M6 og fusion-negative PC-3M-luc-C6 tumorer. Dyrene blev behandlet med YK-4-279, og dens virkninger på primær tumorvækst og lunge metastase blev evalueret. YK-4-279 behandling resulterede i nedsat vækst af den primære tumor kun i LNCaP-luc-M6 kohorte. Når primære tumorer blev dyrket til sammenlignelige størrelser, YK-4-279 inhiberede tumormetastase til lungerne. Ekspression af ETV1 målgener MMP7, FKBP10 og GLYATL2 blev reduceret i YK-4-279 behandlede dyr. ETS fusion-negative PC-3M-luc-C6 xenografter var ikke reagerer til forbindelsen. Endvidere YK-4-279 er et chiralt molekyle, der eksisterer som en racemisk blanding af R og S-enantiomerer. Vi konstateret, at (S) -YK-4-279 er den aktive enantiomer i prostatacancerceller.

Konklusion

Vores resultater viser, at YK-4-279 er en potent inhibitor af ETV1 og hæmmer både den primære tumorvækst og metastase af fusion positive prostata cancer implanteret. Derfor kan YK-4-279 eller lignende forbindelser vurderes som et potentielt terapeutisk værktøj til behandling af human prostatacancer på forskellige stadier

Henvisning:. Rahim S, Minas T, Hong SH, Justvig S, Çelik H , Kont YS, et al. (2014) et lille molekyle hæmmer af ETV1, YK-4-279, Forhindrer prostatakræft vækst og metastase i en mus xenograftmodel. PLoS ONE 9 (12): e114260. doi: 10,1371 /journal.pone.0114260

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: 21. maj 2014; Accepteret: 5. november 2014 Udgivet: December 5, 2014

Copyright: © 2014 Rahim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Disse eksperimenter blev primært støttet af en bevilling fra Institut forsvarsministeriums Congressionally Directed Medical Research Program (PC111510, PI: Aykut Uren, http: //cdmrp.army.mil/). De farmakokinetiske forsøg blev støttet af Analytical Farmakologi Kerne af Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center ved Johns Hopkins (NIH tilskud P30 CA006973 og UL1 RR025005, og Shared Instrument Grant (1S10RR026824-01), https://grants.nih.gov/tilskud /oer.htm). Biacore eksperimenter blev udført ved Genomics og Epigenomics Shared Resource, som støttes af CCSG Grant P30 CA051008-16 (Lou Weiner, PI), https://cancercenters.cancer.gov/grants_funding/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: USPTO tildelt for YK-4-279 til Georgetown University, opfindere omfatter. Y.K., M.B., J.T. og A.U. En licensaftale er udført mellem Georgetown University og Tokalas Inc for disse patenter, hvor J.T. er en stiftende aktie-holder. Georgetown University har indgivet patentansøgninger på YK-4279 samt beslægtede forbindelser og derivater af disse molekyler. Nedenfor er en oversigt over de udstedte og verserende patentansøgninger relateret til disse forbindelser. I. “Målretning af EWS-FLI som antitumorterapi” (GU reference # 2006-041) 1. US Midlertidig anvendelse (60 /877.856) indleveret 29. december 2006. 2. PCT /US07 /089.118 indleveret December 28, 2007 . 3. US midlertidig anvendelse (61 /177.932) indleveret 13. maj 2009. 4. US Ikke foreløbig 12 /494.191 indleveret 29. juni, 2009 ((CIP) hævder prioritere både PCT og amerikanske foreløbige applikationer, national indtastning af fase PCT); udstedt som US patent 8.232.310. 5. US Ikke foreløbig 12 /720.616 indleveret 9 marts 2010 (CONT). 6. Europa 07.872.364,0 indleveret December 28, 2007 (national fase indtastning af PCT). 7. Canada 2.711.003 indleveret December 28, 2007 (national fase indtastning af PCT). 8. Australien 2007341977 indleveret December 28, 2007 (national fase indtastning af PCT). 9. USA Foreløbig 61 /405.170 indleveret 20 Oktober 2010 (indeholder yderligere data). 10. Europa 13.186.704,6 afdelte i Europa 07.872.364,0 prioritere 28. december 2007. II. “Metoder og præparater til behandling Ewings sarkom Family of tumorer” (GU reference # 2012-019) 1. US foreløbig patentansøgning 61 /623.349 indleveret 12. april 2012. 2. Patent Cooperation Treaty PCT /US2013 /036.234 indleveret 11. April, 2013. III. “Metoder og præparater til behandling Kræft” (GU reference # 2014-012) 1. US foreløbig patentansøgning 61 /895.308 indleveret 24. oktober 2013. Alle data i manuskriptet er frit tilgængelige. Forfatterne anerkender og følg alle PLoS ONE politikker vedrørende datadeling og materialer. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kromosomal omlejring er en fælles mekanisme kørsel onkogenese i sarkomer og blodkræftsygdomme [1]. For nylig, fusioner involverer erythroblastosis virus E26 transformerende sekvenser (

ETS

) familie af transkriptionsfaktorer er opdaget i prostatakræft tumorer [2].

ETS

familie af transkriptionsfaktorer er en særdeles konserveret gruppe af gener, der består af 27 medlemmer, hvoraf mange har vist sig at spille en vigtig rolle i sygdommens initiering, progression, differentiering, migration, invasion og angiogenese [3] [4]. ETS-proteiner deler signifikant homologi med hinanden og indeholder et C-terminalt

ETS Salg domæne som er involveret i DNA-binding og et N-terminalt PNT domæne er involveret i protein-interaktioner [5]. Kromosomale rearrangementer involverer ETS faktorer i prostata kræftceller placere dem i direkte regulering af androgen responsive genpromotorer og dermed aktivere deres udtryk som reaktion på androgener. I modsætning til de proteinprodukterne af kromosomale translokationer i leukæmier og sarcomer, behøver gen omlejringer i prostatacancer ikke skabe kimære fusionsproteiner. I stedet er de fleste kromosomale translokationer og gen omlejringer involverer ETS faktorer i prostatakræft resultat i ekspression af en fuld længde eller næsten ETS familie proteiner fuld længde.

Translokationer involverer ERG og ETV1 udgør størstedelen af ​​ETS omrokeringer fundet i prostatakræft . Henviser ERG overvejende fusioneret til TMPRSS2 promotor, kan ETV1 omlejres med 5′-området af adskillige gener, såsom TMPRSS2, SLC45A3 og HNRPA2B1 [2], [6].

ETV1

translokation resulterer i ekspressionen af ​​fuldlængde eller N-terminalt trunkeret ETV1 [7]. Over-ekspression af ETV1 i godartet prostata epiteliale cellelinier resulterer i induktionen af ​​en delmængde af gener involveret i migration og invasion [6]. ETV1 øger også ekspression af AR målgener, såvel som gener involveret i steroid biosyntese og metabolisme. Samarbejde med andre onkogene begivenheder, såsom PTEN tab, disponerer ETV1 udtrykker prostatacellerne at udvikle sig til en mere aggressiv sygdom fænotype [8], [9]. Undersøgelser hos murine modeller tyder på, at ETV1 ekspression er en underliggende årsag til prostatakræft indledning. ETV1 transgene mus udvikler prostata intraepitelialneoplasi. Desuden kombinerer ETV1 udtryk med allerede eksisterende genomiske læsioner, såsom PTEN tab, resulterer i udvikling af invasiv adenokarcinom [10], [11].

Vi har for nylig rapporteret, at YK-4-279, en inhibitor af EWS-FLI1 oncoprotein i Ewings sarkom, hæmmer også ERG og ETV1 aktivitet i prostata kræftceller

in vitro

, hvilket resulterer i reducerede vandrende og invasive fænotyper [12], [13]. Baseret på vores forudgående

in vitro

undersøgelser, vi testede anti-metastatisk evne YK-4-279 i en mus xenograft model. Dyr behandlet med YK-4-279 havde nedsat tumorvækst og reduceret metastaser af tumoren fra primære sted til lungerne. Vi viser også, at virkningerne af YK-4-279 på ETV1 og prostatakræft-cellelinier er enantiospecifik og (S) -YK-4-279 enantiomer er den aktive komponent, der bekræfter lignende resultater i andre tumormodeller [14].

Resultater og diskussion

YK-4-279 er et lille molekyle antagonist af ETV1

Vi første omgang fokuseret på at vurdere virkningerne af YK-4-279 på tumormetastaser

i -vivo

, da vores

in vitro

eksperimenter med prostatakræft-cellelinier foreslog, at det primært hæmmer motilitet og invasion [13]. For at teste effektiviteten af ​​YK-4-279

in vivo

, vi udnyttet en mus xenotransplantationsmodel [15], [16]. LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 prostatakræft-cellelinier frembringes ved stabil transfektion af parental LNCaP og PC-3-celler med en vektor, der udtrykker luciferasegenet. Cellerne injiceret subkutant under den dorsale flanke i 8-10 uger gamle SCID /beige hanmus. Lunge metastase kan ses så tidligt som 6-7 uger efter tumorimplantation i disse dyr [15], [16].

Vi har tidligere demonstreret, at inhibering af ETV1 biologisk aktivitet i LNCaP-celler resulterer i nedsat invasion og migration uden at påvirke væksten i kultur [13]. De cellelinier, der anvendes i aktuelle undersøgelse blev kommercielt erhvervet fra en anden kilde end vores tidligere arbejde og gennemgik selektivt pres for at opnå stabile luciferase udtrykke kloner. Vi først valideret effekten af ​​YK-4-279 på disse celler, før du fortsætter til

in vivo

modeller. LNCaP-celler indeholder en genetisk translokation hvor der er indsat hele ETV1 locus i den sidste intron af prostata-specifikt MIPOL1 region på kromosom 14. Vi verificerede tilstedeværelsen af ​​ETV1 translokation i LNCaP-luc-M6-celler ved genomisk DNA PCR ved anvendelse af primere, der flankerer rekombinationssted (fig. 1a). ETV1 omlejring var eksklusivt til LNCaP-luc-M6-celler og ikke til stede i PC-3M-luc-C6-celler. Således blev PC-3M-luc-C6-cellelinien valgt som en negativ kontrol for vores studier.

a) Genomisk DNA fra prostata celler blev analyseret for ETS omlejring status ved at udføre PCR under anvendelse rearrangement specifikke primere. LNCaP-luc-M6-celler nærede ETV1 omlejring henviser PC-3M-luc-C6-celler var fusion-negative. b) LNCaP-luc-M6-celler blev behandlet med 1 uM YK-4-279 i 48 timer og ETV1 målgen niveauer blev evalueret ved real-time kvantitativ PCR. YK-4-279 behandling resulterede i reduceret genekspression af MMP7, MMP13, GLYATL2 og FKBP10 uden væsentlig reduktion i ETV1 niveauer. *; p 0,01, n.s .; ikke-signifikant, uparret t-test. c) LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 blev forbehandlet med 1 pM YK-4-279 i 48 timer. En elektrisk impedans baseret kemotaksi assay blev anvendt til at overvåge cellemigrering under tilstedeværelse af YK-4-279 mod den nedre kammer med 10% FBS-gradient. YK-4-279 hæmmede migration af LNCaP-luc-M6, men ikke PC-3M-luc-C6-celler. *; p 0,005, n.s .; ikke-signifikant, uparret t-test. d) Motilities af cellerne ved udløb af 24 timer periode blev beregnet på grundlag af deres relative celle indeksværdier. *; p 0,01, n.s .; ikke-signifikant, uparrede t-test.

Vi behandlede LNCaP-luc-M6 celler med en sub dødelig dosis (1 uM) af YK-4-279 i 48 timer og evalueret udtryk for endogene ETV1 target gener ved real time kvantitativ PCR. Vi fokuserede på kendte ETV1 mål, der er impliceret i prostata patogenese [17] – [19]. Eksponering af LNCaP-luc-M6-celler til 1 uM YK-4-279 resulterede i signifikant reducerede mRNA-niveauer i flere ETV1 målgener, herunder MMP7, MMP13, FKBP10 og GLYATL2, uden at påvirke ekspressionen af ​​ETV1 (fig. 1b).

Dernæst udførte vi en elektrisk impedans-baserede kemotaksi assay til bestemmelse af virkningerne af YK-4-279 på motiliteten af ​​LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6-celler. Denne teknik indebærer anvendelse af et Boyden kammer-lignende opsætning med mikroelektroniske sensorer integreret under en mikroporøs polyethylenterephthalat (PET) membran. Sensorerne registrerer elektrisk impedans som celler migrerer fra det øverste kammer, gennem membranen og ind i bundkammeret som reaktion på en kemoattraktant. Denne teknik tillader realtidsovervågning af cellemigration som stigninger i elektrisk impedans korrelerer med stigende antal af migrerede celler til bunden kammer. YK-4-279 behandling af LNCaP-luc-M6-celler resulterede i et signifikant fald i cellemigrering, mens ingen virkning blev observeret på motiliteten af ​​den negative kontrol-cellelinje, PC-3M-luc-C6 (fig. 1c og 1d). Disse resultater bekræftede, at kommercielt tilgængelige LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6-celler havde de samme fænotyper og YK-4-279 respons profiler som LNCaP- og PC-3 celler, som vi brugte i vores tidligere undersøgelser.

YK-4-279 hæmmer tumorvækst

In-vivo

YK-4-279 eksperimenter behandling blev udført i to forskellige formater: 1) Tidlig behandling eksperimenter, hvor YK-4 -279 administration blev startet dagen efter xenograft implantation. 2) Sent behandling eksperimenter, hvor YK-4-279 administration startet først efter den primære xenograft tumor nået til en håndgribelig størrelse (-200 mm

3). Disse to tilgange tilladt os at vurdere virkningerne af YK-4-279 på tumor op tage, vækst og lunge metastase både før dannelsen af ​​veletablerede tumorer samt efter håndgribelig tumordannelse.

Vi har etableret prostata xenotransplantater efter subkutan injektion af LNCaP-luc-M6 eller PC-3M-luc-C6-celler i den dorsale flanke af SCID /beige-mus. I den tidlige behandling studiet, vi startede intraperitoneal lægemiddelbehandling med 75 mg /kg YK-4-279 eller køretøj kontrol dagen efter tumorceller injektion. Dyr blev behandlet 3 gange om ugen og tumorvolumener målt ugentligt. Undersøgelsen blev afsluttet efter 14 uger for LNCaP-luc-M6-gruppen og 6 uger til PC-3M-luc-C6-gruppe på grund af det relativt hurtigere vækst i PC-3M-luc-C6-celler. Mens kun 4 af de 13 mus, som blev subkutant injiceret med LNCaP-luc-M6-celler og behandlet med YK-4-279 udviklede tumorer, i skarp kontrast, 9 af de 13 dyr i bærerkontrolgruppen udviklet tumorer. Ingen sådan forskel var til stede i fusion-negative PC-3M-luc-C6 kohorte (fig. 2). Hos dyr, der udviklede tumorer, var der en signifikant reduktion i tumorstørrelse i YK-4-279-behandlede gruppe sammenlignet med DMSO-kontrol. Reduktion i tumor størrelse var kun til stede i LNCaP-luc-M6-gruppe og ikke observeret med PC-3M-luc-C6-xenografter (Fig. 3a). Vores tidligere

in vitro

undersøgelser viste, at ETV1 hæmning af YK-4-279 medfører reduceret motilitet og invasion uden at påvirke cellevækst og overlevelse. Derfor har vi ikke forvente at se en forskel i tumor optagelse eller primær tumor vækst i disse dyr. Tidlig behandling forsøg blev designet til at måle lunge metastase, og alle dyr blev aflivet ved den forudbestemte endepunkt (6 uger til PC-3M-luc-C6 og 14 uger for LNCaP-luc-M6) at høste væv til yderligere analyse.

Prostata xenografter blev oprettet ved subkutant injektion celler under dorsale flanke i 8-10 uger gamle SCID /beige hanmus. Dyr blev behandlet med 75 mg /kg legemsvægt YK-4-279 tre gange ugentligt, startende dagen efter xenograft injektioner. LNCaP-luc-M6 dyr behandlet med forbindelse vises nedsat tumordannelse (4/13) sammenlignet med køretøj kontrol (9/13). PC-3M-luc-C6 dyr ikke vise signifikant forskel i tumordannelse mellem forbindelsen behandlet (12/13) og kontrol køretøj (13/13) dyr. *; p 0,05, n.s .; ikke-signifikant, uparret t-test.

a) SCID /beige-mus blev subkutant injiceret med LNCaP-luc-M6 eller PC-3M-luc-C6-celler under den dorsale flanke. I den tidlige behandling studiegruppe, blev dyrene injiceret med 75 mg /kg YK-4-279 start dagen efter xenograft injektion. b) Et andet sæt af dyr begyndte at modtage YK-4-279 behandling, når tumorerne var palpable (-200 mm

3). Disse dyr blev yderligere delt op i 2 separate kohorter: én gruppe blev behandlet tre gange om ugen med 75 mg /kg YK-4-279 (sen behandling studie lav dosis). c) En anden gruppe blev behandlet 5 gange om ugen med 150 mg /kg forbindelse (sen behandling højdosis-studiet). Tumorvolumener blev målt ugentligt. YK-4-279 reducerede tumorvækst i LNCaP-luc-M6 dyr, men ikke i PC-3M-luc-C6 dyr. *; p 0,01, **; p 0,001, ***; p 0,0001, n.s .; ikke-signifikant.

De sene behandling studier begyndte med xenograft implantation og tæt opfølgning. Når dyrene udviste en håndgribelig tumor (-200 mm

3), blev de randomiseret til YK-4-279 og vehikelkontrolgruppe (DMSO) grupper. Endepunktet for den sene behandling undersøgelsen blev valgt som den primære tumor størrelse nå 2 cm

3 i alle grupper, så metastatisk byrde mellem grupperne kunne evalueres med samme primær tumor størrelse i alle grupper. Endvidere blev det sene behandling undersøgelsen gentages to gange med to forskellige YK-4-279 doser; 75 mg /kg YK-4-279 tre gange om ugen og 150 mg /kg YK-4-279 fem gange om ugen.

Primær tumorvækst blev signifikant reduceret i sen behandling studiet samt (fig. 3b ). Denne forskel blev forøget, når lægemidlet dosis og frekvens blev forøget (fig. 3c). I højdosisgruppen dog begyndte dyrene viser tegn på hyperventilation og sløvhed, hvilket fik en dosis reduktion til 150 mg /kg givet 4 dage en uge efter uge 4 og 3 dage en uge efter uge 8. Drug behandling påvirkede ikke vækst sats for fusion-negative PC-3M-luc-C6 xenografter enten dosis.

En gruppe af primære tumor prøver blev også evalueret for histopatologiske parametre (fig. S1). Områder af tumor nekrose blev identificeret i H E farvede lunge sektioner, når de er store nok (figur 4a.). Men denne fremgangsmåde er ikke kvantitativ og kan brænde mikro metastaser især i unsectioned dele af organet tilbage i paraffinblokken. Det er afgørende at have et assay følsomme nok til at påvise tilstedeværelsen af ​​selv det lille antal prostata tumorceller i lungerne. Vi konstruerede en standardkurve ved at kombinere seriefortyndinger af luciferase udtrykkende prostatacancerceller dyrket i kultur med lungevæv fra sunde mus (fig. 4b). Anvendelse af dette assay, var vi i stand til at påvise så lidt som 1 celle pr milligram lungevæv. Overvejer en gennemsnitlig lunge masse på 140 mg, dette assay har en nedre detektionsgrænse på 140 prostatacancerceller pr lunge [20]. Da luciferase udtryk er den primære metode, der bruges til at kvantificere tumor metastase, vi udførte en

in vitro

luciferaseanalyse, hjælp doser af YK-4-279, der undertrykker invasion, at vise, at sammensatte behandling dosis ikke påvirke ekspressionen af luciferase i LNCaP-luc-C6 eller PC-3M-luc-C6-celler. Vi målte også luciferase udtryk i primære tumorer udvundet fra dyr behandlet med den højeste dosis af YK-4-279 eller køretøj kontrol. Forbindelse behandling påvirkede ikke luciferase udtryk enten

in vitro

eller

in vivo

(Fig S3.)

a) H . E farvede lunge sektioner viser en mikro -metastatic læsion i DMSO behandlede LNCaP-luc-M6 dyr. b) En standardkurve blev konstrueret for at måle detektionsgrænse luciferase assay. Assayet er særdeles følsom, hvilket tillader detektion af en enkelt prostatacancer celle pr milligram lungevæv. c) Lunger blev høstet fra xenograft dyr 15 minutter efter den sidste forbindelse eller behandling køretøj. Proteinlysater blev opnået fra væv og anvendes til at udføre en luciferase assay. Resultater blev normaliseret til vævsvægt. Sammensatte behandlet LNCaP-luc-M6 xenograft dyr de viste signifikant reduceret lunge metastase sammenlignet med kontroller af køretøjer. PC-3M-luc-C6 lunge metastase var upåvirket af behandling med forbindelsen. *; p 0,05, **; p 0,005, ***; p 0,0001, n.s .; ikke-signifikant, uparret t-test.

Vi derefter udført samme luciferase assay på lungerne af xenograft transporterer dyr behandlet med YK-4-279 eller vehikelkontrol. I alle 3 forsøg (tidlig behandling undersøgelse, sen behandling undersøgelse lav dosis, sen behandling studie høj dosis), sammensatte behandling resulterede i en betydelig reduktion i lunge metastase i LNCaP-luc-M6 xenograft dyr, men ikke i PC-3M-luc- C6 dyr (fig. 4c). Vi brugte også en PCR assay til at kvantificere lunge metastase i slutningen behandling studiet højdosis kohorte ved hjælp af humane specifikke primere for Ribonuclease P-RNA-komponent H1 (RPPH1) og mus primere, der registrerer transferrin receptor genet (Tfrc). Dette assay bekræftede vores tidligere observationer afslører signifikant reduceret lunge metastase i YK-4-279 behandlet LNCaP-luc-M6-gruppen (fig. S4) og valideret, at luciferase måling i lungevæv var en pålidelig metode. I to forsøg (tidlig behandling studie- og sen behandling studie høj dosis), blev lunger høstet fra LNCaP-luc-M6 xenograft dyr, de viste reducerede primære tumor størrelser i behandlingsgruppen på anskaffelsestidspunktet væv (fig. 3a og fig. 3c ). Derfor er det muligt, at forskellene i lunge metastase kan være et direkte resultat af mindre tumorvolumener hos behandlingsgrupper. Men den sene behandling studiet lav dosis gruppe havde lignende primær tumor volumen (2 cm

3), når væv blev høstet fra dyrene (fig. 3b). YK-4-279 reducerede lunge metastase i disse dyr samt, tyder på, at lægemiddelbehandlingen påvirker tumormetastase ved at inhibere ETV1 aktivitet, uafhængigt af den primære tumor størrelse.

Vi evaluerede også ETV1 målgenekspression i primære tumorer på YK-4-279 behandling. ETV1 inhibering med YK-4-279 resulterede i reduceret MMP-7, FKBP10 og GLYATL2 ekspression uden at påvirke ETV1 ekspressionsniveauer (fig. 5a og Fig. 5b). For at bestemme om forskellene i lægemiddelrespons mellem LNCaP-luc-M6 og PC-3M-luc-C6 dyr er en faktor af differentieret tumor penetration af forbindelsen mellem de to kohorter, målte vi koncentrationen af ​​YK-4-279 i plasmaet og tumorer i dyr efter den sidste dosis af YK-4-279. LNCaP-luc-M6-mus viste en gennemsnitlig koncentration på 106,9 ± 64,1 ug /mL YK-4-279 i plasmaet og 27,8 ± 14,5 pg /g i tumoren for en tumor: plasma-forhold på 0,30 ± 0,20. PC-3M-luc-C6 dyr demonstrerede 174,8 ± 53,5 ug /mL YK-4-279 i plasmaet og 23,3 ± 12,3 pg /g i tumoren for en tumor: plasma-forhold på 0,15 ± 0,10. Der var ingen statistisk signifikant forskel i udbredelsen af ​​YK-4-279 mellem de to grupper i sammenligning med en chi-square test.

a) RNA blev ekstraheret fra tumorer af forbindelse og vehikel behandlede LNCaP-luc- M6 dyr (sen behandling undersøgelse lav dosis) 15 minutter efter den sidste injektion. Genekspressionsniveauer blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR. Resultaterne blev normaliseret til 18s rRNA udtryk. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer med 5 mus analyseret pr gruppe. YK-4-279 behandling resulterede i reduceret genekspression af MMP7, GLYATL2 og FKBP10 uden væsentlig reduktion i ETV1 niveauer. *; p 0,05, n.s .; ikke-signifikant, uparret t-test. b) ETV1 target genekspression niveauer i sen behandling undersøgelse højdosisgruppen. *; p 0,05, n.s .; ikke-signifikant, uparret t-test.

enantiospecifik virkninger af YK-4-279

YK-4-279 har et chiralt center og den racemiske forbindelse kan adskilles i sit konstituerende R og S enantiomerer ved højtryks-væskekromatografi (HPLC), eller hver enantiomer kan syntetiseres individuelt. I Ewings sarkom modeller, har S-enantiomeren blevet etableret som den aktive komponent, som inhiberer EWS-FLI1, hvorimod R-enantiomeren har næsten ingen specifik aktivitet [14], [21]. Vi testede, om det samme fænomen gælder for inhibering af ETV1 i prostatacancerceller. Overfladeplasmonresonans (SPR) eksperimenter blev udført for at bestemme bindingen af ​​racemisk YK-4-279 og hver individuel enantiomer til ETV1. Forbindelser blev injiceret over en Biacore chip overflade indeholdende rekombinant ETV1. Racemisk YK-4-279 og S-enantiomeren bundet til ETV1 henviser R-enantiomeren viste en svagere binding til ETV1 (fig. 6a). Vi derefter evalueret YK-4-279 af virkninger for ETV1 transkriptionel aktivitet under anvendelse af en transient transficeret luciferase reporter konstrukt, som indeholder en minimal Id2 promotorregion med to bindingssteder for ETV1. Co-transfektion af ETV1 og Id2 reporter i COS-7-celler resulterede i en stigning i luciferaseaktivitet. Promotoraktivitet blev reduceret ved behandling af cellerne med racemisk YK-4-279 og (S) -YK-4-279. Dog (R) -YK-4-279 hæmmede ikke ETV1 transkriptionel aktivitet (fig. 6b).

a) Racemisk YK-4-279, (R) -YK-4-279 og (S ) -YK-4-279 blev injiceret over en Biacore chip overflade indeholdende rekombinant ETV1. Racemisk YK-4-279 og S-enantiomeren bundet til ETV1 henviser R-enantiomeren havde en lavere bindingsaffinitet til ETV1. b) En luciferase assay blev udført i COS-7-celler co-transficeret med ETV1 og en Id-2 reporter luciferase-konstruktion. Id-2-promotor-aktivitet blev reduceret ved behandling med racemisk YK-4-279 og (S) -YK-4-279. *; p 0,0005, n.s .; ikke-signifikant, uparrede t-test.

Chiral forskelsbehandling enantiomerer er et vigtigt element i mange stof lignende molekyler, som enkelte aktive enantiomerer kan give større selektivitet for deres biologiske mål, forbedre terapeutiske indeks, og vise bedre farmakokinetik end den racemiske blanding [22]. Det kan også reducere den totale dosis lægemiddel og reducere lægemiddelinteraktioner og toksiske bivirkninger. Når du indsender et nyt lægemiddel til godkendelse, den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) kræver udviklere til at begrunde valget af at anvende en racemisk blanding i single-enantiomer formuleringer.

I vores

in vivo

eksperimenter, LNCaP-luc-M6 tumorvækstinhibering var større ved 150 mg /kg YK-4-279 sammenlignet med 75 mg /kg. Imidlertid dyr, der fik en højere dosis lægemiddel kunne ikke behandles i længere tid end 10-12 uger på grund af manifestation af nekrotiske tumorer, hvilket krævede, at dyrene aflives. Således, i tillæg til metastaseinhibering kan YK-4-279 har en direkte effekt på proliferation i ETS-positive prostata kræftceller. Den eneste ulempe ved behandling af dyr med højere doser af YK-4-279 var forekomsten af ​​narkotika toksicitet symptomer, der startede på 4 uger. I denne undersøgelse, lykkedes symptomerne ved at nedsætte narkotikabehandling frekvens, og dermed give dyrene mere restitutionstid mellem injektionerne. Men for at bevæge denne sammensatte ind på klinikken, er yderligere undersøgelser nødvendige for at forbedre

in vivo

effekt og løse de symptomer, der opstår ved højere doser. Vi undersøger i øjeblikket doseringsregimer og formuleringer for at finde den ideelle behandling scenarie, der maksimerer på mål og samtidig minimerer off-target narkotika toksiciteter. På grund af dets hydrofobe struktur, biotilgængeligheden af ​​YK-4-279 er kun 2% -15%, når den administreres til mus ved oral sondeernæring [14]. Desuden har de seneste farmakokinetiske eksperimenter i vores laboratorium vist, at intra-peritoneal administrationer på 75 mg /kg YK-4-279 indledningsvis fører til en kraftig stigning i plasmakoncentrationer, men det væsentlige er ryddet fører til ~ 1 uM niveauer med 2 timer [ ,,,0],14]. De farmakokinetiske egenskaber af YK-4-279, sammen med den manglende evne til at levere en vedvarende høj dosis over tid gennem bolusinjektioner tyder på et behov for at udvikle en kontinuerlig infusion model for at sikre tilstrækkelig lægemiddeladministration. Vi har testet dette paradigme i et Ewings sarkom xenograft model i nøgne rotter. Disse dyr får kontinuerlig infusion stof via et centralt venekateter og vise bedre respons på YK-4-279 behandling end daglige intraperitoneal eller intra-venøs injektioner [21]. Yderligere kombinere farmakokinetiske målinger,

in vivo

modellering og laboratorieundersøgelser vil give os mulighed for at skabe en optimal drug delivery formulering, der er egnet til klinisk brug. Desuden vellykket validering af (S) -YK-4-279 som den aktive komponent i YK-4-279 kan tillade drastisk reduceret dosis behandling

in vivo.

En voksende krop af beviser tyder på, at ETS fusioner fungerer sammen med andre genomiske ændringer i initiering og vedligeholdelse af prostata maligniteter. Androgen-inducerbar prostataspecifikt overekspression af ETV1 i transgene mus inducerer prostata intraepitelialneoplasi (PIN), men fører ikke til carcinom formation. Indlægget disse transgene mus i en PTEN

+/- baggrund eller konstitutivt aktiv prostataspecifikt PI3K /Akt pathway inducerer invasiv carcinoma inden for 6 måneder, hvilket antyder, at ETS translokationer samarbejder med andre genetiske læsioner at inducere prostatacancer hos mennesker [10 ], [11]. Nylige resultater har også identificeret Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), et centralt DNA-reparation protein, til at interagere med ETS faktorer i en DNA uafhængig måde [23]. PARP1 er vist at være vigtigt for ETS proteinfunktion, og inhibering af PARP1 forringer ETS medieret tumorigenese og celleinvasion. PARP og PI3K /Akt pathway hæmmere såsom olaparib, rucaparib, perifosine, og miltefosin er i en fremskreden tilstand af klinisk afprøvning [24] – [26]. En vigtig klinisk fordel af disse fund er muligt, at kombinere YK-4-279 med andre lægemidler for at opnå en mere robust og synergistisk respons, åbner et bredt spektrum af nye strategier til at målrette ETS faktorer.

Transskription faktorer