Abstrakt
mTOR pathway er afvigende stimuleret i mange kræftceller, herunder bugspytkirtlen duktalt adenokarcinom (PDAC), og det er således et potentielt mål for terapi. Imidlertid mTORC1 /S6K akse medierer også negativ feedback loops der dæmper signalering via insulin /IGF-receptoren og andre tyrosinkinasereceptorer. Undertrykkelse af disse feed-back loops slipper over-aktivering af opstrøms veje, der potentielt opveje de antiproliferative virkninger af mTOR-hæmmere. Her viser vi, at behandling af PANC-1 eller MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller med enten rapamycin eller aktiv-site mTOR inhibitorer undertrykt S6K og S6 phosphorylering fremkaldt af insulin og GPCR-agonist neurotensin. Rapamycin forårsagede en slående stigning i Akt fosforylering ved Ser
473, mens de aktive-site hæmmere af mTOR (KU63794 og PP242) fuldstændigt ophævet Akt fosforylering på dette site. Omvendt aktiv-site hæmmere af mTOR forårsage en markant stigning i ERK-aktivering henviser rapamycin ikke havde nogen stimulerende virkning på ERK-aktivering. Resultaterne betyder, at første og anden generation af mTOR inhibitorer fremme over-aktivering af forskellige pro-onkogene veje i PDAC celler, hvilket antyder, at undertrykkelse af feedback-sløjfer bør være en vigtig overvejelse i anvendelsen af disse inhibitorer til PDAC terapi. I modsætning hertil metformin afskaffet mTORC1 aktivering uden over-stimulerende Akt fosforylering på Ser
473 og forhindrede mitogen-stimuleret ERK aktivering i PDAC celler. Metformin inducerede en mere udtalt inhibering af proliferation end enten KU63794 eller rapamycin, mens den aktive sted mTOR inhibitor var mere effektivt end rapamycin. Således virkningerne af metformin på Akt og ERK-aktivering er markant anderledes end allosteriske eller aktiv-site mTOR-hæmmere i PDAC celler, selvom alle disse midler kraftigt hæmmede mTORC1 /S6K akse
Henvisning:. Soares HP, Ni Y, Kisfalvi K, Sinnett-Smith J, Rozengurt E (2013) forskellige mønstre af Akt og ERK Feedback Aktivering i reaktion på Rapamycin, Active-site mTOR-hæmmere og Metformin i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 8 (2): e57289. doi: 10,1371 /journal.pone.0057289
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
Modtaget: August 28, 2012; Accepteret: 20 Januar 2013; Publiceret: 21 feb 2013
Copyright: © 2013 Soares et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health Tilskud P30DK41301, P01CA163200 og R01DK55003, Institut for Veterans Affair Grant 1I01BX001473 og midler fra begavet Ronald S. hirshberg formand for kræft i bugspytkirtlen Research alle til eR. (https://www.nih.gov/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
pattedyr mål for rapamycin (mTOR) er en meget evolutionært konserveret protein kinase, der spiller en central rolle i integrationen af vækstfaktor, næringsstoffer og energi status [1] celler. mTOR fungerer som en katalytisk subunit i to adskilte multiprotein komplekser, mTOR kompleks en (mTORC1) og mTORC2. mTORC1, kendetegnet ved den regulatoriske subunit Raptor, styrer mindst to regulatorer af proteinsyntese, de 40S ribosomale proteinunderenheden S6 kinase (S6K) og den eukaryote translationsinitiering faktor 4E (eIF4E) -bindende protein 1, omhandlede som 4E-BP1 [1 ], [2]. Heterodimeren af tumorsuppressor TSC2 (tuberin) og TSC1 (hamartin) undertrykker mTORC1 signalering ved at fungere som GTPase-aktivator protein til små G-protein Rheb (Ras-homolog beriget i hjernen), en potent aktivator af mTORC1 signalering i sin GTP- bundne tilstand [3], [4]. Phosphorylering af TSC2 ved Akt og /eller ERK /p90RSK undertrykker sin GTPase aktiverende aktivitet over Rheb, hvilket fører til mTORC1 aktivering [5]. mTORC1 akut og allosterisk inhiberet af rapamycin gennem binding til FKBP12. mTORC2, kendetegnet ved Rictor, ikke hæmmes af kortvarig behandling med dette middel og phosphorylerer adskillige AGC proteinkinaser, herunder Akt ved Ser
473 [6], [7]. Den mTORC1 pathway spiller en central rolle i insulin /IGF-receptor signalering [8], [9] og er aberrerende aktiveret i mange cancertyper, herunder pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), en af de mest dødelige sygdomme hos mennesker. Følgelig PDAC celler udtrykker insulin og IGF-1-receptorer og over-express IRS-1 og IRS-2 [10] – [12] og PDAC (men ikke normal) væv display aktiveret (phosphoryleret) IGF-1R [13]. Gene variationer i IGF-1 signalsystem er blevet forbundet til værre overlevelse hos patienter med PDAC [14]. Inaktivering af p53, som set under progression af 50-70% af PDAC, opregulerer insulin /IGF-1 /mTORC1 pathway [15]. Krydstale mellem insulin /IGF-1 receptorer og G-protein-koblede receptorer (GPCR) signalsystemer kraftigt stimulerer mTORC1, DNA-syntese og celleproliferation i et panel af PDAC celler [16] – [20]. mTORC1 signalering spiller en central rolle i udbredelsen og overlevelse af PDAC celler [21] og aktiveres i bugspytkirtelkræft væv [20], [22] – [24]. Derfor har mTORC1 dukket op som et attraktivt terapeutisk mål i PDAC og andre almindelige maligne sygdomme.
Udover vækstfremmende signalering, mTORC1 /S6K medierer også negativ feedback loops at begrænse signalering gennem insulin /IGF-receptoren og andre tyrosin -receptorer via phosphorylering og transkriptionel repression af IRS-1 [25] – [30] og phosphorylering af Grb10 [31], [32]. Følgelig undertrykkelse af mTORC1 aktivitet ved rapamycin forhindrer inhibitoriske IRS-1 phosphoryleringer og nedbrydning, hvorved forøgende PI3K /Akt aktivering i flere cancer celletyper [30], [33] – [35]. Disse undersøgelser indebærer, at den potentielle anti-cancer aktivitet af rapamycin (eller analoger) kan modsvares af frigivelse af feedback-hæmning af PI3K /Akt aktivering [25], [30], [33] – [35]. Endvidere rapamycin ufuldstændigt inhiberer 4E-BP-1 phosphorylering [36] – [40]. Følgelig den kliniske antitumoraktiviteten af rapamycin og dets analoger (rapalogs) har været temmelig begrænset i mange typer cancer [41], [42], herunder PDAC [43], [44]. I et forsøg på at målrette mTOR pathway mere effektivt, har nye hæmmere af mTOR, der virker på det katalytisk aktive site (aktiv-site mTOR-hæmmere) blevet identificeret, herunder PP242 [37], Torin [45], KU63794 [38] og dens analog AZD8055 [46]. Disse forbindelser hæmmer 4E-BP-1-phosphorylering på rapamycin-resistente sites (fx Thr
37/46) og blokere Akt fosforylering ved Ser
473 ved hæmning af mTORC2. Men aktiv-site mTOR inhibitorer også eliminere tilbagekoblingssløjfer at begrænse PI3K-aktivering [25] og følgelig kan deres terapeutiske effektivitet også formindskes ved aktivering af opstrøms veje, der modarbejder deres anti-proliferative virkninger.
mTORC1 er også negativt reguleret af metformin, den mest anvendte lægemiddel til behandling af type 2-diabetes mellitus (T2DM). Metformin fremstår som et potentielt nyt middel i kræft kemoforebyggelse. Nylige epidemiologiske undersøgelser i tilknytning administration af metformin til reduceret forekomst, gentagelse og dødelighed af en række forskellige cancere i T2DM patienter [20], [47] – [56], herunder PDAC [54], [56]. På celleniveau, metformin indirekte stimulerer AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) aktivering [57], selv om andre virkningsmekanismer er blevet foreslået ved meget høje koncentrationer af denne biguanid. AMPK hæmmer mTORC1 aktivering via stimulering af TSC2 funktion [58] – [60], hvilket fører til ophobning af Rheb-BNP (den inaktive form) og ved direkte phosphorylering af Raptor, der forstyrrer dens samarbejde med mTOR, hvilket fører til dissociation af mTORC1 kompleks [61]. Den præcise konsekvens af undertrykkelse af negative feedback-sløjfer medieret af de mTORC1 /S6K akse som reaktion på metformin forbliver dårligt defineret, og især, vides det ikke, om rapamycin, aktiv-site mTOR-hæmmere og metformin føre til over-aktivering af tilsvarende opstrøms veje i PDAC celler.
Her viser vi, at behandling af PANC-1 eller MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller med enten rapamycin eller aktiv-site mTOR inhibitorer undertrykt S6K og S6 phosphorylering fremkaldt af insulin, en kombination af insulin og GPCR-agonist neurotensin eller serum. Rapamycin forårsagede en slående forøgelse af Akt fosforylering på Ser
473, mens de aktive-site mTOR-hæmmere KU63794 og PP242 helt ophævet Akt fosforylering på dette site. Et iøjnefaldende træk ved resultaterne præsenteret her er, at aktivt sted inhibitorer af mTOR, i modsætning til rapamycin, forårsager en markant stigning i ERK-aktivering i PDAC celler. Resultaterne betyder, at første og anden generations mTOR inhibitorer fremme over-aktivering af forskellige pro-onkogene omsætningsveje i PDAC celler, nemlig Akt og ERK. Metformin afskaffet også mTORC1 aktivering, men uden over-stimulerende Akt fosforylering på Ser
473. Endvidere metformin forhindret ERK-aktivering som respons på tværs af tale agonister i PDAC celler. Vores resultater viser, at effekten af metformin på Akt og ERK-aktivering er slående forskellige fra dem, der fremkaldes af allosteriske eller aktiv-site mTOR-hæmmere, selvom alle disse midler kraftigt hæmmede mTORC1 /S6K akse.
Materialer og metoder
Cellekultur
de humane pancreascancer cellelinier Panc-1 og MiaPaCa-2 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Disse cellelinjer havnen aktiverende mutationer i
KRAS
onkogen. Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 2 mM glutamin, 1 mM Na-pyruvat, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 10% CO
2.
Western blot-analyse
Konfluente kulturer af Panc-1 eller MIA Paca-2 celler dyrket på 3 cm skåle blev vasket og derefter inkuberet i 24 timer med DMEM indeholdende 5 mM glucose og 1% FBS. Cellerne blev vasket to gange med DMEM indeholdende 5 mM glucose og inkuberet i serumfrit medium i 4 timer og derefter behandlet som beskrevet i individuelle forsøg. Kulturerne blev derefter direkte lyseret i 2 × SDS-PAGE-prøvebuffer [200 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 mM EDTA, 0,1 M Na
3VO
4, 6% SDS, 10% glycerol, og 4% 2-mercaptoethanol], efterfulgt af SDS-PAGE på 10% geler og overførsel til Immobilon-P-membraner (Millipore, Billerica, MA). Western blots blev derefter udført på membraner inkuberet natten over med de angivne antistoffer i phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,1% Tween-20. De immunreaktive bånd blev påvist med ECL (forøget kemiluminescens) reagenser (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). De anvendte antistoffer detekteret det phosphorylerede tilstand S6K på Thr
389, S6 hos Ser
235/236, 4E-BP1 på Thr
37/46 og Thr
70, Akt ved Ser
473 og Thr
308 og ERK1 /2 ved Thr
202 og Tyr
204 eller de samlede niveauer af disse proteiner.
Anchorage-afhængig celleproliferation.
PANC -1 celler (10
5) blev udpladet på 35 mm vævskulturskåle i DMEM indeholdende 10% FBS. Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev grupper af kulturer inkuberet med neurotensin og insulin med eller uden metformin i DMEM indeholdende 0,25% FBS eller Rapamycin, KU63794 eller Metformin i DMEM indeholdende 2,5% FBS. Kulturerne blev derefter inkuberet i 4 d, og det totale celletal blev bestemt fra et minimum på seks brønde pr tilstand under anvendelse af en Coulter-tæller, efter celleklumper blev opdelt ved at lede cellesuspensionen 10 gange gennem en 19-gauge, og efterfølgende, en 21-gauge nål.
Materialer
DMEM blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Neurotensin og insulin blev opnået fra Sigma Chemical (St. Louis, MO). Rapamycin, KU63794 og PP242 var fra R & D Systems, Inc. Minneapolis. Alle antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin-IgG og anti-mus IgG var fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ). Alle andre reagenser var af højeste kvalitet til rådighed.
Resultater
Stimulering af p70S6K og S6 fosforylering i respons på insulin og neurotensin i PDAC celler er fuldstændig afskaffet ved rapamycin eller KU63794
i første omgang vi bestemt indflydelse rapamycin og KU63794 på mTORC1-medieret fosforylering af S6K i PDAC celler. Rapamycin er en allosterisk inhibitor af mTORC1, der fungerer via FKBP-12 hvorimod KU63794 er en meget specifik hæmmer af mTOR ATP-konkurrence, der hæmmer både mTORC1 og mTORC2. Kulturer af PANC-1 (fig. 1) eller MiaPaCa-2 (fig. 2) celler blev inkuberet i 2 timer i fravær eller nærvær af rapamycin (ved 10 eller 100 nM) eller KU63794 (ved 1 eller 5 uM). Derefter blev kulturerne stimuleret med en kombination af insulin (10 ng /ml), og GPCR-agonist neurotensin (5 nM) i 2 timer for at fremkalde positiv krydstale [18], [20]. Phosphorylering af S6K på Thr
389, et direkte mål for mTORC1 og phosphorylering af S6 (Ser
235/236), et substrat af S6K, blev overvåget ved hjælp af specifikke antistoffer, der registrerer det phosphorylerede tilstand af disse rester. Stimulering af enten PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler med insulin og neurotensin induceret robust phosphorylering af S6K på Thr
389 og S6 (fig. 1 og 2). Udsættelse for enten rapamycin eller KU63794 fuldstændig forhindret stigningen i phosphorylering af disse proteiner som respons på stimulering med insulin og neurotensin i enten PANC-1 (fig. 1) eller MiaPaCa-2-celler (fig. 2). Vi verificerede, at de samlede niveauer af S6K og S6 ikke ændrede i respons på behandlingerne. Resultaterne indikerer, at allosteriske eller aktiv-site hæmmere af mTOR kraftigt blokerede mTORC1 /S6K akse ved koncentrationerne anvendt i PDAC celler
Kulturer af Panc-1-celler blev inkuberet i fravær. (-) Eller i tilstedeværelse af KU63794 (Ku) ved 1 uM eller 5 uM eller rapamycin (Rap) ved 10 eller 100 nM i 2 timer i DMEM indeholdende 5 mM glucose, som angivet. Derefter blev cellerne stimuleret i 2 timer med 5 nM neurotensin (NT) og 10 ng /ml insulin (Ins) og lyseret med 2 × SDS-PAGE-prøvebuffer. Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer, der registrerer den phosphorylerede tilstand af S6K på Thr
389, S6 ved Ser
235/236, 4E-BP1 på Thr
37/46 og Thr
70, Akt ved Ser
473 og Thr
308 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunblotting med antistoffer, der genkender total S6K blev S6, 4E-BP1, Akt og ERK bruges til at kontrollere, at celle behandlinger ikke ændrede det samlede niveau for disse proteiner og bekræft lige gel lastning. Fold stigning i ERK phosphorylering blev kvantificeret ved hjælp af Multi Gauge V3.0 og plottet som barer. Lignende resultater blev opnået i 3 uafhængige forsøg
Kulturer af MiaPaCa-2-celler blev inkuberet i fravær. (-) Eller i nærvær af KU63794 (Ku) ved 1 uM eller 5 uM eller rapamycin ( Rap) ved 10 eller 100 nM i 2 timer i DMEM indeholdende 5 mM glucose, som angivet. Derefter blev cellerne stimuleret i 2 timer med 5 nM neurotensin (NT) og 10 ng /ml insulin (Ins) og lyseret med 2 × SDS-PAGE-prøvebuffer. Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer, der registrerer den phosphorylerede tilstand af S6K på Thr
389 (pS6K), S6 ved Ser
235/236 (PS6), 4E-BP1 på Thr
37/46 og Thr
70, Akt ved Ser
473 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunblotting med antistoffer, der genkender total S6K blev S6, 4E-BP1, Akt og ERK bruges til at kontrollere, at celle behandlinger ikke ændrede det samlede niveau for disse proteiner og bekræft lige gel lastning. Fold stigning i ERK phosphorylering blev kvantificeret ved hjælp af Multi Gauge V3.0 og plottet som barer. Lignende resultater blev opnået i 3 uafhængige forsøg.
Differential regulering af 4EBP1 phosphoryleringssteder som reaktion på mitogen stimulering, rapamycin og KU63794 i PDAC celler
fosforylering af 4EBP1 blev også overvåget af hjælp stedspecifikke 4E-BP1 antistoffer, der registrerer p-Thr
37/46 eller p-Thr
70 i lysayes af PANC-1 (fig. 1) eller MiaPaCa-2 (fig. 2) celler. Disse celler viste et højt basalt niveau af 4E-BP1 fosforylering på Thr
37/46, der ikke var yderligere forøget ved stimulering med insulin og neurotensin. Men celle stimulation reduceret mobilitet 4E-BP1 i SDS /PAGE, en reaktion tyder på øget fosforylering på andre sites. Faktisk behandling af PANC-1 eller MiaPaCa-2 celler med neurotensin og insulin markant stimuleret 4E-BP1phosphorylation på Thr
70. Den constituve fosforylering af 4E-BP1 på Thr
37/46 blev ophævet ved behandling med KU63794 men blev ikke påvirket af rapamycin på enten 10 eller 100 nM, efter aftale med rapporter om, at rapamycin og dets analoger ikke hæmmer 4E-BP1 fosforylering på disse steder i andre celletyper. I modsætning hertil blev det signal responsive phosphorylering af 4E-BP1 på Thr
70 forhindres ved behandling med enten KU63794 eller rapamycin ved 100 nM. Vi verificerede, at de samlede niveauer af 4E-BP1 ikke ændrede som reaktion på de treatments.These resultater afslørede en unappreciated regulering af 4E-BP1 phosphorylering på forskellige rester som reaktion på eksterne signaler og vise, at rapamycin hæmmer inducerbar men ikke konstitutiv 4E-BP1 fosforylering i PDAC celler mens aktiv-site mTOR-hæmmere undertrykker fosforylering af 4E-BP1 på alle lokaliteter.
Rapamycin og KU63794 fremkalde overstimulering af forskellige opstrøms veje i PDAC celler stimuleret med insulin og neurotensin eller insulin alene
for at afgøre, om allosteriske og aktiv-site mTOR-hæmmere eliminere feedback-sløjfer, der hæmmer aktiviteten af opstrøms signalveje i PDAC celler undersøgte vi effekten af disse inhibitorer på phosphorylering af Akt reaktion på mitogen signalering i PANC -1 og Mia PaCa-2-celler. Stimulering af disse celler med insulin og neurotensin inducerede en markant stigning i Akt phosphorylering på Ser
473 (fig. 1 og fig. 2). Behandling med enten 10 nM eller 100 nM rapamycin fremmes overstimulering af Akt fosforylering på Ser
473, i overensstemmelse med undertrykkelse af mTORC1 /S6K akse feedback. I modsætning hertil forud eksponering for det aktive-site mTOR-hæmmer KU63794, som hæmmer både mTORC1 og mTORC2, blokerede Akt fosforylering på Ser
473 i PANC-1 (fig. 1) og MiaPaCa-2-celler (fig. 2), på linje med forestillingen om, at mTORC2 er den største protein kinase, der phosphorylerer Akt på Ser
473 i PDAC celler. KU63794 forhindrede ikke Akt fosforylering på Thr
308.
ERK /RSK vej, som spiller en central rolle i PDAC celledeling også fører til mTORC1 aktivering [5], [62]. I bryst- og blærekræft celler, hæmning af mTORC1 /S6K aksen ved rapamycin induceret feedback-aktivering af ERK [63]. Derfor undersøgte vi effekten af rapamycin og KU63794 om ERK aktivering i PDAC celler. Efter aftale med tidligere undersøgelser [16], [64], [65], stimulering af enten PANC-1 eller MiaPaCa-2 celler med insulin og neurotensin markant aktiveret ERK (ERK phosphoryleret på Thr
202 og Tyr
204 ), som illustreret i fig. 1 og 2. I modsætning til resultaterne opnået i andre celletyper [63], behandling med enten 10 eller 100 nM rapamycin i 2 timer ændrede ikke den basale eller stimulerede niveau af ERK phosphorylering i PANC-1 og MiaPaCa-2-celler . Lignende resultater blev opnået, når disse PDAC celler blev behandlet med rapamycin i 4 eller 24 timer (resultater ikke vist). Derimod udsættelse for KU63794 (1-5 uM) øgede basisniveauet af ERK phosphorylering og påfaldende forbedret stimulering af ERK-phosphorylering fremkaldt af insulin og neurotensin i enten PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler. Kvantificering af resultaterne med ERK er illustreret i de nedre paneler af fig. 1 og 2 (søjler). Disse resultater viser, at rapamycin, en allosterisk inhibitor af mTORC1, og KU63794, et aktivt-site hæmmer af mTOR, føre til over-aktivering af forskellige opstrøms pro-onkogene veje i PDAC celler.
Stimulering af PANC-1 celler eller MiaPaCa-2 med insulin alene induceret robust stigning i PI3K /Akt /mTORC1 men inducerer ikke signifikant stigning i ERK phosphoryleret på Thr
202 og Tyr
204 (fig. 3). Derfor bestemte vi, om de forskellige virkninger af rapamycin og KU63794 afbildet i PDAC stimuleret med kombinationen af insulin og neurotensin (fig. 1 og 2) kan også fremstilles når PANC-1 og MiaPaCa-2 celler udfordret med insulin alene. Kulturer af disse celler blev inkuberet i 2 timer i fravær eller nærvær af rapamycin (10-100 nM) eller KU63794 (1-5 uM) og derefter stimuleret med insulin (10 ng /ml). Vi overvågede phosphorylering af S6K på Thr
389, S6 på Ser
235/236, Akt om Ser
473 og Thr
308 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Forudgående eksponering for enten rapamycin eller KU63794 afskaffede stigning i phosphorylering af S6K og S6 i respons på insulin i enten PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler (fig. 3). Udsættelse for rapamycin over-aktiveret hvorimod behandling med KU63794 afskaffet Akt fosforylering på Ser
473 i insulin-stimulerede PDAC celler. Rapamycin gav ikke nogen påviselig effekt på ERK aktivering i un-stimulerede eller insulin-behandlede celler. Et iøjnefaldende træk ved resultaterne vist i fig. 3 er, at udsættelse for KU63794 inducerede en markant stigning i phosphorylering af ERK på Thr
202 og Tyr
204. Disse resultater underbygges at allosteriske inhibitor af mTORC1 og aktive sted sted hæmmer af mTOR fremme over-aktivering af forskellige opstrøms veje i PDAC celler provokeret med insulin eller insulin og neurotensin, en kombination, der fremkalder krydstale mellem insulin /IGF og GPCR signalsystemer .
kulturerne af PANC-1 (øvre paneler) og MiaPaCa-2 (nedre paneler) inkuberet i fravær (-) eller i nærvær af KU63794 (Ku) ved 1 uM eller 5 uM eller rapamycin (Rap) ved 10 eller 100 nM i 2 timer i DMEM indeholdende 5 mM glucose, som angivet. Derefter blev cellerne stimuleret i 2 timer med 10 ng /ml insulin og lyseret med 2 × SDS-PAGE-prøvebuffer. Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer, der registrerer den phosphorylerede tilstand af S6K på Thr
389, S6 ved Ser
235/236, Akt ved Ser
473 og Thr
308 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunoblotting med total S6K blev S6, Akt og ERK bruges til at kontrollere lige gel lastning. Fold stigning i ERK phosphorylering blev kvantificeret ved hjælp af Multi Gauge V3.0 og plottet som barer. Lignende resultater blev opnået i 3 uafhængige forsøg.
PP242, ligesom KU63794, øger ERK aktivering i PANC-1 celler stimuleret med insulin og neurotensin
Efterfølgende bestemmes vi, om den slående løbet -activation af ERK af aktive sted mTOR inhibitor KU63794 kunne også fremstilles ved en strukturelt ubeslægtet aktivt sted mTOR inhibitor. Kulturer af PANC-1 blev inkuberet i 2 timer i fravær eller nærvær af PP242 (1-5 uM), en nylig identificeret aktive sted mTOR inhibitor [37], og stimuleret i 2 timer med insulin og neurotensin. Vi overvågede phosphorylering af S6K på Thr
389, S6 på Ser
235/236, 4EBP1 på Thr
37/46, Akt om Ser
473 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Som vist i fig. 4 A, før udsættelse for PP242 afskaffet fosforylering af S6K, S6, 4EBP1 og Akt i PANC-1 celler. Det centrale element i resultaterne er, at PP242, ligesom KU63794, inducerede en markant stigning i phosphorylering af ERK på Thr
202 og Tyr
204 (fig. 4A og kvantificering i fig. 4B). Fordi PP242 er en mindre selektiv mTOR-hæmmer [66], bestemte vi, om koncentrationerne af PP242 der fremmes ERK-aktivering sammenfaldende med dem, der hæmmer mTORC1 aktivitet. Som vist i fig. 4C, PP242 forbedret ERK aktivering og hæmmede S6 fosforylering på næsten identiske koncentrationer
En
, Kulturer af PANC-1 celler blev inkuberet i fraværet. (-) Eller i nærværelse af PP242 på 1 uM eller 5 uM i 2 timer i DMEM indeholdende 5 mM glucose, som angivet. Derefter blev cellerne stimuleret i 2 timer med 5 nM neurotensin (NT) og 10 ng /ml insulin (Ins) og lyseret med 2 × SDS-PAGE-prøvebuffer. Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer, der registrerer den phosphorylerede tilstand af S6K på Thr
389, S6 ved Ser
235/236, 4E-BP1 på Thr
37/46, Akt på Ser
473 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunblotting med antistoffer, der genkender total S6K blev S6, 4E-BP1, Akt og ERK bruges til at kontrollere, at celle behandlinger ikke ændrede det samlede niveau for disse proteiner og bekræft lige gel lastning. Lignende resultater blev opnået i 3 uafhængige eksperimenter.
B
, Søjlerne repræsenterer stigningen i ERK fosforylering induceret af insulin (Ins) og neurotensin (NT) i celler uden eller med forudgående eksponering for PP242. Kvantificering blev udført under anvendelse Multi Gauge V3.0
C, Salg Kulturer af PANC-1-celler blev inkuberet som i panel A, men i nærvær af stigende koncentrationer af PP242. Prøverne blev analyseret for at detektere phosphoryleret tilstand af S6 ved Ser
235/236 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Immunoblotting med total ERK og S6 (ikke vist) blev anvendt til at verificere lig gel loading. Kvantificering blev udført ved hjælp af Multi Gauge V3.0.
D
, Kulturer af PANC-1-celler blev inkuberet i fravær (-) eller i nærvær af enten KU63794 (Ku) eller PP242 ved 5 uM i 2 timer. Derefter blev cellerne stimuleret i 2 timer med 5 nM neurotensin (NT) og 10 ng /ml insulin (Ins) og lyseret med 2 × SDS-PAGE-prøvebuffer. Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer, der registrerer den phosphorylerede tilstand af ERK på Thr
202 og Tyr
204, Akt ved Ser
473 og Thr
308. Immunoblotting med total Akt og ERK blev brugt til at verificere lige gel lastning.
Vi kontrolleret, at de aktive-site mTOR-hæmmere KU63794 og PP242, ved koncentrationer, der markant forbedrede ERK aktivering og hæmmet Akt fosforylering på Ser
473 forhindrede ikke Akt fosforylering på Thr
308 i PDAC celler (fig. 4D). Faktisk er den specifikke mTOR inhibitor KU63794 lidt forbedret Akt phosphorylering ved Thr
308, i overensstemmelse med undertrykkelse af tilbagekoblingssløjfer at begrænse PI3K-aktivitet (Fig. 4D). PP242 var mindre effektivt end KU63794 i styrkelsen Akt fosforylering på Thr
308, sandsynligvis afspejler off-target hæmning af PI3K [66]. Således bestemt aktivt sted stedet mTOR-hæmmere KU63794 og PP242 undertrykte Akt fosforylering på Ser
473, ikke falde Akt fosforylering på Thr
308 og stimuleret over-aktivering af ERK fosforylering på Thr
202 og Tyr
204 i PDAC celler.
Den mekanisme, der aktivt-site hæmmere øge ERK aktivering er ikke godt forstået. Vores resultater støtter ikke, at der i PDAC celler af en formodet mTORC1 /S6K /PI3K /ERK feedback loop, der foreslås i andre celletyper [63], da potent hæmning af mTORC1 /S6K akse ved enten rapamycin eller everolimus gav ikke overstimulation af ERK i PDAC celler. For at underbygge denne konklusion blev PANC-1-celler behandlet med KU63794 eller PP242 og stimuleret med insulin og neurotensin i fravær eller nærvær af A66 [67], en selektiv inhibitor af 110α katalytiske underenhed af PI3K. Som vist i fig. 4D, udsættelse for A66 forhindrede ikke forøgelse af ERK-aktivering som reaktion på udsættelse for enten KU63794 eller PP242. Vi bekræftede, at A66, ved den anvendte koncentration, potent inhiberede PI3K inden Panc-1-celler, da det forhindrede insulin-induceret Akt phosphorylering ved Thr
308, nøglen rest i Akt aktivering loop phosphoryleret af PI3K-afhængig PDK1.
for at få yderligere indsigt i den mekanisme, hvormed behandling med KU63794 inducerer over-aktivering af ERK vi også bestemt effekten af dette aktive-site mTOR-hæmmer på aktivering af MEK, opstrøms kinase, der phosphorylerer ERK. MEK-aktivering blev scoret ved at vurdere phosphorylering af Ser
217 og Ser
221 i sin aktivering loop. Som vist i fig. S1, behandling af PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler med KU63794 markant forbedret MEK phosphorylering fremkaldt af insulin og neurotensin. Kollektivt Resultaterne viser, at aktiv-site mTOR inhibitorer førte til MEK /ERK hyper-aktivering via en PI3K /S6K-uafhængige tilbagekoblingssløjfe i PDAC celler.
Differential mønstre af Akt og ERK-aktivering i respons på rapamycin, everolimus, KU63794 og PP242 i PANC-1 celler stimuleret med serum
De foregående resultater blev opnået med PDAC celler stimuleret med definerede mitogener, der virker gennem specifikke receptorer. At strække sig længere disse resultater har vi også testet, om differentielle mønstre af Akt og ERK-aktivering produceres, når cellerne stimuleres med føtalt bovint serum. Kulturer af PANC-1-celler blev inkuberet i 2 timer i fravær eller nærvær af rapamycin (100 nM), everolimus (100 nM), KU63794 (1 uM) eller PP242 (1 uM) og stimuleret med medium indeholdende føtalt bovint serum. Vi overvågede phosphorylering af S6 på Ser
235/236, Akt om Ser
473 og ERK på Thr
202 og Tyr
204. Forudgående eksponering for rapamycin, everolimus, KU63794 eller PP242 afskaffede stigning i phosphorylering af S6 som reaktion på serum (fig. 5). Udsættelse for rapamycin eller everolimus over-aktiveret hvorimod behandling med KU63794 eller PP242 afskaffet Akt fosforylering på Ser
473 i serum-stimulerede PDAC celler. Rapamycin eller everolimus gav ikke nogen påviselig effekt på ERK aktivering mens udsættelse for KU63794 eller PP242 inducerede en markant stigning i phosphorylering af ERK på Thr
202 og Tyr
204 i serum-behandlede celler (fig. 5). Disse resultater bekræftede, at allosteriske og aktive sted stedet inhibitorer af mTOR fremme over-aktivering af forskellige opstrøms veje i PDAC celler under forskellige eksperimentelle betingelser, herunder celler provokeret med insulin, insulin og GPCR’en agonist neurotensin eller med frisk kalvefosterserum.
kulturerne blev inkuberet i fravær (-) eller i nærvær af 5 pM KU63794 (Ku), 5 uM PP242, 100 nM rapamycin (RAP) eller 100 nM everolimus i 2 timer i DMEM indeholdende 5 mM glucose, som angivet. Derefter blev cellerne stimuleret i 2 timer med føtalt bovint ved en slutfortynding på 2% (serum) og lyseret med 2 × SDS-PAGE-prøvebuffer. Prøverne blev analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting med antistoffer, der registrerer den phosphorylerede tilstand af Akt ved Ser
473, S6 ved Ser
235/236, og ERK på Thr
202 og Tyr
204 . Som vist i fig. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.