PLoS ONE: neuropilin-2 Expression Fremmer TGF-β1-medieret Epithelial til Mesenchymale Transition i kolorektal cancer Cells

Abstrakt

Neuropilins, oprindeligt karakteriseret som neuronale receptorer, fungerer som co-receptorer for kræftrelaterede vækstfaktorer og blev for nylig involveret i flere signalveje fører til cytoskeletorganisation, angiogenese og cancer progression. Derefter forsøgte vi at undersøge muligheden af ​​neuropilin-2 at orkestrere epitelial-mesenkymale overgang i kolorektale cancerceller. Brug specifikke siRNA at målrette neuropilin-2-ekspression, eller genoverførsel, vi først observeret, at neuropilin-2-ekspression forlener HT29 og Colo320 for xenograft formation. Desuden neuropilin-2 tillagt en fibroblastisk-lignende form for cancerceller, hvilket tyder på en involvering af neuropilin-2 i epitel-mesenkymale overgang. Faktisk var tilstedeværelsen af ​​neuropilin-2 i kolorektale carcinom-cellelinier korreleret med tab af epitel markører, såsom cytokeratin-20 og E-cadherin og med erhvervelse af mesenchymale molekyler, såsom vimentin. Endvidere viste vi ved overfladeplasmonresonans eksperimenter, neuropilin-2 er en receptor for transformerende vækstfaktor-β1. Ekspressionen af ​​neuropilin-2 på colon cancer cellelinjer blev faktisk vist sig at fremme transformerende vækstfaktor-β1 signalering, der fører til en konstitutiv phosphorylering af Smad2 /3-kompleks. Behandling med specifikke TGFp-type1 receptor kinase hæmmere restaurerede E-cadherin niveauer og hæmmet delvist neuropilin-2-induceret vimentin udtryk, hvilket antyder, at neuropilin-2 samarbejder med TGF-type 1 receptor at fremme epitel-mesenkymale overgang i kolorektale cancerceller. Vores resultater tyder på en direkte rolle NRP2 i epitelial-mesenkymale overgang og fremhæve en cross-talk mellem neuropilin-2 og TGF-β1 signalering til at fremme udviklingen af ​​kræft. Disse resultater tyder på, at neuropilin-2 opfylder alle kriterierne for en terapeutisk mål at forstyrre flere onkogene funktioner i solide tumorer

Henvisning:. Grandclement C, Pallandre JR, Valmary Degano S, Viel E, Bouard A, Balland J et al. (2011) neuropilin-2 Expression Fremmer TGF-β1-medieret Epithelial til Mesenchymale Transition i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 6 (7): e20444. doi: 10,1371 /journal.pone.0020444

Redaktør: Hang Thi Thu Nguyen, Emory University, USA

Modtaget: November 17, 2010; Accepteret: 3 maj 2011; Udgivet: Juli 1, 2011

Copyright: © 2011 Grandclement et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Grant API -CHU 2008 af Universitetshospitalet i Besançon; CG modtog et stipendium fra den franske “agence nationale pour la recherche Technologique”; JRP modtog et stipendium fra regionsrådet i Franche Comté; et tilskud fra “Ligue contre le cancer du doubs” støttet dette arbejde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Neuropilins (NRP) er transmembrane ikke-tyrosinkinase glycoproteiner oprindeligt beskrevet i nervesystemet. Neuropilin (NRP) familie består af to gener, neuropilin-1 (NRP1) og neuropilin-2 (NRP2). Under nervesystem udvikling, NRP1 og NRP2 spille en afgørende rolle i axon tilbagetrækning og vejledning af bindende klasse III semaphorins [1]. Oprindeligt karakteriseret som neuronale receptorer, blev NRP sig også at blive udtrykt i endotelceller og efterfølgende blev vist at spille en rolle i udviklingen af ​​det vaskulære system [2].

NRP viser en kort intracytoplasmisk halen, som ikke gør det indeholde en kinase domæne. Indledende undersøgelser af neuropilin-afhængige molekylære veje foreslog, at neuropilins ikke direkte kan overføre intracellulære signaler. Dette førte til forslaget om, at hetero-dimerisering med andre receptorer er forpligtet til at formidle neuropilin-downstream signalering. En af disse co-receptor komplekser hidtil beskrevne involverer vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) [3], [4], [5]. Udover amplifikation af VEGFR-signalering, kan NRP interagere med plexins at mediere klasse 3 semaphorin signaltransduktion via Rho-relaterede G-proteiner, modulerende cytoskeleton organisation [6].

desto mindre er en højt konserveret aminosyresekvens fremme NRP intracellulær hale binding til PDZ-domænet af GAIP-C-terminalen interagerende protein-1 (GIPC-1) blev for nylig rapporteret antyder muligheden for, at NRP kunne regulere alternative biologiske funktioner [7].

de mange funktioner NRP’ernes var nylig fremhævet af identifikation af NRP rolle i onkogenese. Udover tilstedeværelsen af ​​NRP på tumorassocierede fartøjer, blev NRP udtrykt af en lang række tumorer, hvilket antyder en potentiel rolle for denne glycoprotein i cancer progression. Faktisk blev NRP2 udtryk findes i osteosarkom [8], melanom [9], lunge kræft [10], [11], hjernetumorer [12], [13] tyktarmskræft [14], pancreascancer [15], [16 ], [17], brystkræft [18], myeloid leukæmi [19], spyt adenoide cystisk carcinom [20], infantil hemangioma [21], æggestokkene neoplasmer [22] og blære kræftformer [23]. I colon carcinoma, NRP2 direkte fremmer tumorprogression i en celle autonomt (se gennemgang af NRP2 udtryk på kræftceller i tabel S1). Det blev foreslået, at NRP2 onkogene egenskaber er afhængige af en øget VEGFR1 phosphorylering og en aktivering af VEGFR1 /PI3K /Akt signalering. [14] Imidlertid er de præcise molekylære veje drevet af NRP2 og involveret i onkogenese forbliver stort set ukendt.

Epithelial-mesenchymal overgang (EMT) er en af ​​de store molekylære mekanismer der er udført i onkogenese til at fremme udviklingen af ​​kræft. EMT er karakteriseret ved en opdeling af celle vejkryds, tab af epitel egenskaber og cellepolaritet, der bidrager til karcinom progression. Udover gevinsten af ​​mesenkymale markører, EMT forlener kræftcelle for migration, invasionsevne og efterfølgende metastase dannelse [24]. Despites flere undersøgelser vedrørende rolle NRP2 i kræft progression, ingen væsentlig dokumentation etableret en inddragelse af denne molekylære vej hos EMT.

Her brugte vi tyktarmskræft cellelinjer transficeret med NRP2 transgen eller siRNA at undersøge NRP2 involvering i EMT. Disse forsøg dokumenteret, at NRP2 forlener tyktarmskræft cellelinjer til koloni og xenograft formation. Desuden blev en konvertering fra epitel til fibroblast-lignende form udløst af NRP2 udtryk, samt køb af vimentin og EMT specifikke transkriptionsfaktorer. Derefter undersøgte vi indflydelse NRP2 på transformerende vækstfaktor β1 (TGF-p1) signalering, der menes at bidrage til sene karcinom ved at inducere EMT. Vi viste, at NRP2 fremmer en konstitutiv Smad2 /3 fosforylering i tyktarmskræft cellelinjer. Desuden specifikke siRNA målrettet NRP2 eller behandling med farmakologiske hæmmere af TGF-1 type 1-receptoren (TGFβRI) forhindrede Smad2 /3 phosphorylering og den NRP2-medieret EMT af kolorektal cancer celler. Kollektivt, disse resultater tyder på, at NRP2 samarbejder med TGFβRI at fremme EMT i kolorektal cancer.

Materialer og Metoder

Cell kultur

Humane cellelinjer HT29, Colo320, SW620, MCF7 , Caki, A498, HEK293 blev indkøbt fra American Type Cell Culture Collection og blev dyrket i RPMI1640 eller DMEM (Lonza, Paris, Frankrig) suppleret med 10% varmeinaktiveret endotoksinfrit føtalt kalveserum (FCS), (Invitrogen, Cergy-Pontoise , Frankrig). Bes-PAC01, Bes-PAC03, Bes-PAC04 og Bes-PAC05 (bugspytkirtlen Adeno-Carcinoma) cellelinjer blev oprindeligt isoleret fra ascitesvæsker afledt af fire patienter med pancreas adenokarcinomer, i vores universitetshospital. R3III cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Nathalie Labarriere, Inserm (Nantes, Frankrig). Jijoye og Raji cellelinjer (human Burkitt lymfom) blev leveret af Diaclone (Besançon, Frankrig). Cellelinier anvendt i denne undersøgelse blev autentificeret under anvendelse af DNA-profilering (korte tandemgentagelser analyse), i overensstemmelse med ATCC anbefalinger (se tabel 1). Short tandem repeat (STR) analyse er et molekylærbiologisk metode anbefales til cellelinje identifikation. Cellelinier anvendt i denne undersøgelse blev genotypebestemt før frysning og hver anden måned. STR-analyse blev udført med AmpFISTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems). Højde specifikke loci herunder tandemgentagelser på DNA fra cancerpatienter cellelinier blev analyseret. STR-analyse måler det nøjagtige antal gentagne enheder for hver allel (D7S820 8,20 betyder, at 8 og 20 gentagelser identificeres på hver allel af D7S820 locus for cellelinien Jijoye). Hvis en variant vises der indeholder en delvis gentagelse, at delvis gentagelse enhed er udpeget af en decimal efterfulgt af antallet af baser i den delvise gentagelse.

pcDNA Ekspressionsplasmider

Indflydelsen af NRP2 på coloncancercelle progression blev bedømt ved at overføre NRP2 gen i HT29-cellelinien. Vi genererede HT29

NRP2 cellelinjer bruger to ekspressionsplasmider koder hNRP2 (pcDNA3.1-NRP2, venligst stillet til rådighed af M. Klagsbrun) og pCMV6-XL5-NRP2 (købt fra Origene (Rockville, MD, USA). Kontrol HT29-celler blev dannet ved anvendelse pcDNA3.1 eller pCMV6-XL5 vektorer. 1.5 × 10

6 HT29-celler blev podet i en 60 mm

3 kolbe i 4 ml medium og inkuberet i 24 h. cellerne blev stabilt transficeret med 1 ug pcDNA3.1-NRP2 eller pCMV6-XL5-NRP2 ekspressionsvektorer eller styrevektorer vha Effectene (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig) ifølge producentens anvisninger. Celler transficeret med pcDNA3.1 vektorer blev selekteret med 0,8 mg /ml geneticin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrig), 48 h efter transfektion.

Små interfererende RNA

Brug af Ambion siRNA webdesign værktøj, vi identificeret en potentiel NRP2-specifikt mål sekvens. specifik NRP2 siRNA (sense 5′-AAA GGC TGG AAG TCA GCA CTA ATT T-3 ‘og anti-sense-5′-AAA AAT TAG TGC TGA CTT CCA GCT T-3′) og scramble siRNA (sense 5’-AAAGGAGGGGCATGCCACGTTGG- 3 ‘og anti-sense 5′-AAAACCAACGTGGCATGCCCCTC-3′) sekvenser blev annealet og klonet ind i BbsI-stedet i 3’-LTR af pFIV-H1 /U6 vektor ifølge producentens anvisninger (System Biosciences, Mountain View, CA). Sekvenser blev bekræftet ved NIH BLAST analyse at have nogen væsentlig homologi med sekvenser i andre hvirveldyr gener. Lentivirale supernatant produktion og efterfølgende infektion af celler blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger (System Biosciences, Mountain View, CA). Colo320 stabilt transficeret blev udvalgt med 3 ug /ml puromycin (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrig), 48 timer efter transfektion.

Flowcytometri

Anti-NRP2, anti-NRP1, anti-pSmad2 /3, anti-TGFp1, anti-TGFβR1 var fra Santa-Cruz Biotechnology (Heidelberg, Tyskland). Anti-Smad2 /3 og anti-TGFRII, var fra RD-system (Lille, Frankrig). Alexafluor488-mærkede sekundære antistoffer blev købt fra Fluoprobes (Interchim, Montluçon, Frankrig). Ti tusinde celler fra hver prøve blev bedømt for fluorescens påvisning ved BD FACSCanto cytometer. (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Frankrig) til intracellulær farvning, celler blev fikseret i 20 minutter ved 4 ° C i 2% paraformaldehyd. Farvning blev derefter indså ved stuetemperatur i 30 minutter i en buffer indeholdende 0,4% saponin og 5% FCS. Vaskepuffer indeholdt 0,1% saponin, 5% FCS. For flowcytometrianalyse blev Relativ fluorescensintensitet (RFI) beregnet.

celleproliferationsassay

Celleproliferation in vitro blev analyseret med tetrazoliumsaltet 3- (4,5-dimethylthiazol-2- yl) -2,5 diphenyltetrazoliumbromid (MTT). Kort fortalt blev 4000 celler per brønd podet i 96-brønds mikro-plader indeholdende 100 pi medium per brønd. Til analyse blev 10 pi MTT substrat (af en 5 mg /ml stamopløsning i phosphatpufret saltvand) til hver brønd, og pladerne lodes faste væv incubator betingelser i yderligere 2 timer. Celler blev solubiliseret i 200 pi dimethylsulfoxid, og kolorimetriske analyser blev udført (bølgelængde, 570 nm). Pladerne blev analyseret hver 24. time for næste 3 dage i træk.

ELISA-assay

Celler blev inkuberet i RPMI eller DMEM-1% FCS i 24 timer. Derefter blev cellerne talt og 10000 celler pr brønd blev podet i 96-mikroplade i 200 pi DMEM-0,1% FCS i 24 timer. VEGF-produktion blev vurderet på supernatanter anvendelse af human VEGF ELISA Kit (Strathmann Biotec, Hamborg, Tyskland).

flowcytometrianalyse af DNA Content

Celler blev høstet ved trypsinisering, vasket med iskoldt PBS , fikseret i 70% ethanol. Forud for DNA-analyse blev celler farvet med 50 pg /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrig) og 2 pg /ml DNase-fri RNase (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrig) i 15 minutter ved 37 ° C i mørket. DNA-indholdet blev målt under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, Frankrig) og analyseret med CellQuest program.

xenograft eksperimenter

Nøgne mus blev opnået fra Janvier (Le Genest St Isle, Frankrig), og vedligeholdes i vores dyr facilitet i overensstemmelse med Animal Eksperimentelle Etik retningslinjer Udvalg. 1 × 10

6 celler af HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

si-RNA-NRP2 og Colo320

siRNA-ctrl cellelinjer resuspenderes i 100 pi PBS blev podet subkutant i nøgne mus og tumorvækst blev monitoreret hver anden uge i hver gruppe. Tumor volumen blev beregnet ved formlen

V

= 1/2

en

×

b

2, hvor

en

er den længste tumor aksen, og

b

er den korteste tumor akse. Når tumorerne nåede 1 cm i diameter blev musene aflivet, og tumorerne blev fikseret i formol til efterfølgende immunohistokemisk analyse.

Kolonidannelse assay

Virkning af NRP2 ekspression på kolonidannelse in vitro blev evalueret ved blød agar koloni-dannelse assay. 5000 celler per brønd blev podet i 500 pi 2% agarose medium i en 24-brønds plade. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C blev 5% CO2 og billeder taget efter 10 dages dyrkning.

Invasion assay

Invasion blev vurderet ved anvendelse 96W QCM Invasion Assay (Millipore, USA). Kort fortalt lige antal (100000) af kontrol- celler (HT29

ctrl) eller NRP2 udtrykkende celler (HT29

NRP2) resuspenderes i serum-frit medium blev placeret i top rum i en standard 8 uM pore Boyden kammer. Feederen brønde indeholdt serum gratis medium eller medium 10% FCS. Efter 16 timer invasion (37 ° C, 5% CO2), blev invasive celler inkuberet med Cellefrigørelse buffer, lyseret og mærket med CyQuant GR farvestof. (QCM 96W Assay, Millipore, International). Fluorescens blev derefter evalueret med en fluorescenspladelæser (Cell Lab Quanta, Beckman-Coulter) med en 480-520 nm filter sæt.

Cell Behandlinger

TGF-β1 signalering blev hæmmet ved hjælp SD- 208 eller SB-431.542 (TGFRI kinase inhibitor) fortyndet i DMSO (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrig). DMSO tjente som kontrol medium i alle eksperimenter. I nogle eksperimenter Avastin (Pharmacy af CHU Jean Minjoz, Besançon, Frankrig) blev anvendt til at inhibere VEGF-A. TGF-β1 blev anskaffet fra RD System (Lille, Frankrig).

Western Blot-analyse

Kort beskrevet efter to vasketrin blev celler høstet og solubiliseret i lysepuffer containing1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM vanadat og en komplet mini proteaseinhibitorcocktail Tablet (Complete Mini EDTA Free, pr 10 ml lysepuffer, Roche, Frankrig). 30 ug af hel-cellelysater blev adskilt ved natrium duodecyl sulfat-polyacrylamid-gelelektroforese og overført til polyvinylidendifluorid-membraner ved elektroblotting. Blottene blev derefter blokeret i 1 time i 5% mælk før inkubation med specifikke antistoffer som følger: anti-NRP2 og anti-twist1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland), anti-Smad2 /3 (R tilstedeværelsen eller fraværet af subcellulære specifikke proteiner (såsom β-actin eller histon H1) bevidnet subcellulær adskillelse.

Co-immunpræcipitationsanalyse

Celler blev lyseret i PBS indeholdende 200 mM tris- HCI pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% volumen /volumen tritonX100, 1 mM DTT, 15 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM vanadat og en komplet mini proteaseinhibitorcocktail Tablet (Complete Mini EDTA Free, pr 10 ml lysepuffer Roche, Frankrig). Kanin-anti-TGFRI polyklonale antistoffer (Santa-Cruz Biotechnology) og kanin IgG polyklonale antistoffer blev tilsat til lysaterne i en endelig fortynding på 1/100 og inkuberet natten over ved 4 ° C. Protein-G magnetiske perler (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrig) tilsat til blandingen og inkuberet i yderligere to timer ved 4 ° C. Proteiner blev derefter elueret ved magnetisk separation og denatureret. Western-Blot blev derefter udført under anvendelse af anti-NRP2 antistof (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland).

Histopatologisk analyse og immunhistokemisk farvning af væv

Vævsprøver opnået fra xenotransplantater blev fikseret i 4 % formalin og paraffin indlejret. Derefter blev blokke skåret serielt ved 4-um tykkelse. HES (Hematoxyline eosin Safran) farvning blev anvendt til at vurdere morfologi. En standard immunohistokemisk teknik blev udført ved anvendelse af en Ventana BenchMark XT (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona) immunostainer med de følgende primære antistoffer: anti E-cadherin (Zymed, San-Francisco, USA), anti-cytokeratin-20 ( Zymed, San-Francisco, USA).

overfladeplasmonresonans analyse

design og fabrikation af hjemmelavede chips er kompatible med SPR (overfladeplasmonresonans) er blevet udført som tidligere udgivet med hjælp fra MIMENTO teknologisk platform, Besançon, Frankrig [25]. De NRP2 chips fremstillet i denne undersøgelse består i kovalent podning af Fc-NRP2 enheder på kemisk aktiveret self samlet monolag følge fremgangsmåden ifølge proteinchippen bygning nyligt offentliggjort [26]. Fc-NRP2 var fra RD System (Lille, Frankrig). Denne fremgangsmåde fører til en dækning på 7,4 +/- 0,1 femtomole /mm

2 i NRP2. Injektioner af BSA (kontrol -), VEGF (Kontrol +) og TGFp1 udføres ved 250 nM i PBS-Tween 0,05%, pH 7,4. BIAcore forsøg blev udført med apparat Biacore 2000 ved 25 ° C med en strømningshastighed omfatte mellem 2 og 30 pl /min.

Real Time-kvantitativ PCR (RT-qPCR)

Total RNA blev ekstraheret ved anvendelse Kit RNeasy mini (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig) og revers transkriberet under anvendelse af vilkårlige hexamerer og Moloney leukæmivirus revers transkriptase (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Dobbelte prøver blev underkastet RT-qPCR. mRNA blev kvantificeret ved anvendelse af primere angivet nedenfor:. NRP2 (Hs00187290_m1), Snail1 (Hs001955991_m1), TGF-β1 (Hs00171257_m1), Gli1 (Hs00171790_m1), Twist1 (Hs00361186_m1) (Applied Biosystems)

ABL mRNA fra hver prøve blev kvantificeret som en endogen kontrol med intern RNA. Relativ mRNA ekspression blev beregnet ved hjælp af Delta-Delta-Ct-metoden og ubehandlede celler blev anvendt som kalibrator.

Slide forberedelse og konfokal mikroskopi

Celler blev spredt ud på Labteck kammer slides (Sigma-Aldrich, Lyon, Frankrig) og efterfølgende behandles med de passende reagenser. Celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,1% Triton X100. Efter 20 minutter af blokering i 20% føtalt bovint serum og vask blev cellerne farvet med egnede antistoffer Stacks of konfokal billeder blev indsamlet med et Olympus FV1000 laser scanning konfokal mikroskop. Cellekerner blev modfarvet med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol). Til fluorescens kvantificering, blev forholdet mellem fluorescensintensiteten beregnet i hver tilstand. Forholdet mellem fluorescensintensiteten blev beregnet i dividere nukleare fluorescens af cytoplasmaet-membran-fluorescens. Fluorescensintensitet på 50 celler er blevet analyseret i hver tilstand.

Smad reporter assay

Vi har benyttet TGF-β reporter assay fra SABiosciences (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig) til kvantificering af TGF -β-induceret SMAD2 /3 signaleringen. Kvantificering af den ildflueluciferase blev realiseret ved anvendelse af en dobbelt-Luciferase Reporter Assay System (Promega Co., Madison, USA) ifølge producentens protokol. Alle transfektioner blev udført in triplo under anvendelse af lipofectamin kit. (Invitrogen, Cergy-Pontoise, Frankrig). Efter 24 timers transfektion blev mediet skiftet, og celler blev behandlet med 50 ng /ml TGF-β1 i yderligere 24 timer. Resultaterne er præsenteret som forholdet mellem den

ildflueluciferase

aktivitet og

renilla luciferase

aktivitet (Ren /Luc) for hver betingelser. Derefter blev værdier rapporteret til værdierne af den negative kontrol.

Statistisk analyse

Resultater er udtrykt som middelværdien plus eller minus standardfejl på middelværdien (SEM). Gruppe sammenligninger blev udført under anvendelse af Student

t

test. Forskelle blev betragtet som signifikante ved

s

. 0,05

Resultater

NRP2 udtryk i menneskelige kræftceller

Vi først søgte at undersøge ekspressionen af NRP2 glycoprotein i forskellige cancercellelinier. Immunofluorescens analyse bekræftede, at NRP2 udtrykkes ved membranen af ​​adskillige humane cancercellelinier (figur 1A). Humane umbilical vene-endotelceller (HUVEC), isoleret fra normal human navlevene, blev anvendt som en positiv kontrol for NRP2 ekspression. Vi observerede NRP2 udtryk ved membranen i 2 ud af 3 tyktarmskræft cellelinier (SW620, Colo320 men ikke HT29). NRP2 blev også udtrykt i alle testede nyrekræft cellelinjer (HEK 293, Caki, R3III og A498), i to af fire bugspytkirtelkræft cellelinier (Bes-PAC03 og Bes-PAC04, der stammer fra patientens ascitesvæske i vores institut), i NCIH441 lungecancer-cellelinie og i 5637 blærecancer-cellelinje (figur 1A). MDAMB231 brystkræft-cellelinie udtrykte NRP2 hvorimod ingen NRP2 farvning blev fundet på Burkitt lymfom cellelinjer (Raji, Jijoye) (figur 1A).

A,

Flowcytometrianalyse af NRP2 udtryk i humane cancercellelinjer.

B,

immunhistokemisk farvning af NRP2 i humane colon væv og bryst væv (brun). Formalin-fikserede paraffin-indlejrede væv blev inkuberet natten over ved stuetemperatur med anti-humant NRP2 antistof. Repræsentative mikrografer blev taget på en original forstørrelse x1000; NRP2 udtrykkes ved membranen af ​​human colon og brystcarcinomer, mens det ikke er udtrykt i raske væv.

Immunhistokemi undersøgelser blev derefter foretaget for at bestemme om NRP2 udtrykkes ved membranen af ​​forskellige paraffinindlejret-humant cancer eksemplar. NRP2 blev udtrykt på 3 ud af 10 coloncarcinom, 5 ud af 15 brystcarcinoma og 4 ud af 12 pancreatisk carcinom. Af note, blev NRP2 ikke fundet på prostatakræft (n = 10) og B-celle lymfom (n = 10) (data ikke vist). Desuden viste immunohistokemisk farvning at NRP2 udtrykkes ved membranen af ​​human coloncarcinom og brystcarcinom mens det ikke udtrykkes i ikke maligne væv (figur 1b). Vores resultater er overensstemmende med tidligere offentliggjorte rapporter. Faktisk, i en nylig undersøgelse, Gray et al observeret, at NRP2 ikke var påviselig i ikke-malign colon mucosa men var tydelig i 10 (83%) af 12 i nærheden colonadenocarcinom og i fem (71%) af syv levermetastaser ved IHC-farvning. Endvidere i en anden undersøgelse blev NRP2 ekspression fundet i 5 ud af 6 (83%) almindeligt anvendte pancreas cellelinier [15] og i 7 ud af 11 (64%) kirurgiske prøver af pancreas adenocarcinom ved IHC-farvning [14]. Endelig i brystcancer, Yasuoka et al rapporterede Nrp2 ekspression i 60 ud af 113 invasive brystcarcinomer (53,1%) [18]. Ud fra disse forskellige undersøgelser fremgår det, at NRP2 synes at være specifik for adskillige tumorvæv, mens ingen ekspression af dette glycoprotein er almindeligt observeret hos raske væv, der bekræfter, at NRP2 er et attraktivt mål for innovative antitumorbehandlinger (se tabel S1 til gennemgang af NRP2 udtryk i kræft).

for at undersøge nøjagtige rolle NRP2 i kræft progression, besluttede vi at generere tyktarmskræft cellelinjer, der udtrykker eller ikke NRP2, hjælp NRP2 genoverførsel eller NRP2 specifik siRNA. Derfor NRP2 blev transficeret ind i HT29 og et specifikt siRNA blev anvendt til at Knockdown NRP2 ekspression i Colo320. Flowcytometri blev udført eksperimenter for at bekræfte modulering af NRP2 ekspression i HT29 og Colo320 (figur 2A). Ingen graduering af NRP1 ekspression blev observeret i HT29 eller Colo320 transficerede celler. Caki-1 nyrecancer celler blev anvendt som positiv kontrol for NRP1 farvning. NRP2 tilstedeværelse i HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl, Colo320

siRNA-NRP2 blev kontrolleret af western blotting (figur 2B).

Transficerede celler blev analyseret for NRP1 og NRP2 udtryk ved flowcytometri analyse (

A

) eller ved western blotting (

B

). For flowcytometrianalyse blev Relativ fluorescensintensitet (RFI) beregnet. Caki1 og HUVEC-celler blev anvendt som positiv kontrol for NRP1 og NRP2 farvning henholdsvis.

C,

spredning af HT29 og Colo320 celler, ifølge NRP2 udtryk blev vurderet ved hjælp MTT assays. 4000 celler blev Lad kultur under 24, 48 eller 72 timer før analyse. NRP2 ekspression er associeret med en forøget proliferation i colon cancerceller. Dataene repræsenterer hjælp af tre eksemplarer plus eller minus standardfejlen (SE) af et repræsentativt forsøg ud af tre udført. (

**, P 0,01). D, Salg Lignende MTT eksperimenter blev gentaget i nærvær af bevacizumab (0,25 og 1 mg /ml, 72 h). HMEC-1 mikrovaskulære endotelceller blev anvendt som en positiv kontrol for bioaktiviteten af ​​bevacizumab. Faktisk bevacizumab signifikant nedsætter HMEC-1 proliferation hvorimod der observeres noget fald af celleproliferation med HT29

NRP2 og Colo320 kræftceller. Erfaringerne blev gjort 3 gange, og for hver gang i tre eksemplarer.

E,

Flowcytometrisk analyse af DNA-indholdet af transficerede kolon kræftceller. NRP2 ekspression er associeret med en forbedret antal celler i fase S. Data viser resultaterne af et repræsentativt eksperiment ud af 3 udtrykkes som gennemsnit af dobbeltbestemmelser assays (*,

P 0,05; **, P 0,01, ** * P. 0,001)

NRP2 fremmer tumor spredning

Vi benyttede sig af de tidligere cellelinjer at studere rolle NRP2 om kræft spredning in vitro og tumorvækst in vivo. Proliferation blev overvåget ved anvendelse af MTT-assays. HT29

NRP2 celler viste en overlegen spredning hastighed ved 24, 48 og 72 timer i forhold til HT29

ctrl (Figur 2C). Omvendt NRP2 knockdown via bestemte siRNA, negativt modulerede spredning af Colo320 tumor cellelinje (Figur 2C). Disse forsøg viste, at NRP2 ekspression forøger coloncancercellelinie proliferation in vitro (den significativity på hvert tidspunkt af disse MTT-assays er angivet i tabel S2). For at bekræfte indflydelse NRP2 på celleproliferation, har vi evalueret i to yderligere eksperimenter Fordoblingen-tider af HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl og Colo320

siRNA-NRP2 kræft celler. NRP2 udtrykkende celler HT29

NRP2 og Colo320

siRNA-ctrl havde en fordoblingstid på 8 og 11 timer, hvorimod en fordobling tider med NRP2 mangler celler HT29

ctrl og Colo320

siRNA-NRP2 var 13 og 14 timer. Da de nationale reformprogrammer er VEGF co-receptorer, vi overvågede VEGF-A produktion i HT29 og Colo320 kulturer ved ELISA. Disse celler producerede lave niveauer af VEGF-A. NRP2 udtryk påvirkede ikke VEGF produktion (figur S1). Desuden neutraliserende mAb bevacizumab, kendt for at inhibere proliferationen af ​​mikrovaskulære endotel cellelinie HMEC-1 [27], blev anvendt til at behandle en mulig rolle VEGFA i NRP2-medieret tumorcellevækst. Disse forsøg viste, at VEGFA neutralisering ikke påvirkede NRP2-medieret HT29 eller Colo320 spredning. (Figur 2D)

Desuden NRP2 er en funktionel receptor for semaphorin 3F, der blev beskrevet som en inhibitor af angiogenese, tumorudvikling og metastase [28]. Western blotting-forsøg viste, at HT29

ctrl og HT29

NRP2 udtrykke det samme niveau af semaphorin 3F, hvorimod der ikke semaphorin 3F blev fundet i Colo320 celler, hvilket antyder, at NRP2-medieret tumorproliferation ikke indebærer semaphorin 3F (figur S2) . Derefter blev fordelingen af ​​DNA-indhold nukleare studeret ved flowcytometri i HT29

ctrl, HT29

NRP2, Colo320

siRNA-ctrl og Colo320

siRNA-NRP2 cancerceller. NRP2 ekspression blev forbundet med en øget antal celler i fase S (Figur 2E). Serum deprivation i dyrkningsmedium inducerede en stigning i subG1 fraktion kun i NRP2 negative betingelser (data ikke vist). Kollektivt, viste disse resultater, at NRP2 udtryk i kolorektal celle karcinom fremmer kræft celledeling og overlevelse.

NRP2 ablation ved hjælp siRNA hæmmer xenograft dannelse

Den præcise rolle NRP2 om kræft progression blev først karakteriseret

in vivo

. For at undersøge effekten af ​​NRP2 udtryk på

in vivo

tumorvækst, vi podet lige antal (1,10

6 celler pr mus) af HT29

NRP2 eller HT29

ctrl subkutant i nøgne mus. Tumorforekomst og volumen blev vurderet hver anden uge. Tumorer dukkede op i alle mus podet med HT29

ctrl og HT29

NRP2. NRP2 forbedret betydeligt tumorvækst in vivo (figur 3A). For at bekræfte disse resultater, besluttede vi at undersøge om NRP2 målrettet via bestemte siRNA kunne hæmme tumor dannelse. Mens 1.10

6 Colo320

siRNA-ctrl celler injiceres subkutant i nøgne mus induceret tumor transplantation i alle mus, NRP2 hæmning via bestemte siRNA forhindrede Colo320 transplantation i alle dyr tyder en kritisk rolle NRP2 i de tidlige begivenheder bidrager til tumor dannelse (figur 3B) .Den indflydelse NRP2 hæmning via bestemte siRNA på Colo320 tumorgenicitet blev bekræftet

in vitro

. Til dette formål blev Colo320 celler behandlet med NRP2 siRNA eller ctrl siRNA og dyrkes i en blød agar-assay. NRP2 knockdown i Colo320 faldt antallet af kolonier iagttaget i blød agar eksperimenter (figur 3C). Da HT29 ikke danne kolonier i blød agar kulturer, besluttede vi at undersøge indflydelsen af ​​NRP2 på HT29 invasion og migration.