PLoS ONE: Screening for EGFR og KRAS mutationer i endobronchial Ultralyd Afledt transbronkial Needle aspirater i ikke-småcellet lungekræft Brug COLD-PCR

Abstrakt

EGFR

mutationer korrelerer med forbedrede kliniske resultater hvorimod

er KRAS

mutationer forbundet med manglende respons på tyrosinkinaseinhibitorer i patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Endobronkial ultralyd (eBUS) -transbronchial nål aspiration (TBNA) bliver i stigende grad brugt i forvaltningen af ​​NSCLC. Co-amplifikation ved lavere denatureringstemperatur (COLD) -polymerase (PCR) (COLD-PCR) er en følsom analyse til påvisning af genetiske mutationer i faste tumorer. Denne undersøgelse vurderede muligheden for at anvende COLD-PCR til at screene for

EGFR

KRAS

mutationer i cytologiske prøver opnået ved eBUS-TBNA i almindelig klinisk praksis. Prøver fra NSCLC patienter, der gennemgår eBUS-TBNA blev evalueret i henhold til vores standard kliniske protokoller. DNA ekstraheret fra disse prøver blev udsat for COLD-PCR til at forstærke exoner 18-21 af

EGFR

og exon to og tre af

KRAS

efterfulgt af direkte sekventering. Mutation analyse blev udført i 131 af 132 (99,3%) NSCLC patienter (70F /62m) med bekræftet lymfeknudemetastaser (94/132 (71,2%) adenocarcinom, 17/132 (12,8%) planocellulært, 2/132 (0,15% ) stor celle neuroendokrine, 1/132 (0,07%) storcellet karcinom, 18/132 (13,6%) NSCL-ikke andetsteds specificeret (NOS)). Molekylær analyse af alle

EGFR

og

KRAS

målsekvenser blev opnået i 126 132 (95,5%) og 130 af 132 (98,4%) af tilfældene hhv.

EGFR

mutationer blev identificeret i 13 (10,5%) af fuldt evaluerede sager (11 i adenocarcinom og to i NSCLC-NOS), herunder to nye mutationer.

KRAS

mutationer blev identificeret i 23 (17,5%) af fuldt analyserede patientprøver (18 adenocarcinom og fem NSCLC-NOS). Vi konkluderer, at eBUS-TBNA af lymfeknuder infiltreret af NSCLC kan give tilstrækkelig tumor materiale til

EGFR

KRAS

mutation analyse hos de fleste patienter, og at COLD-PCR og sekventering er en robust screening assay for

EGFR

KRAS

mutation analyse i dette kliniske sammenhæng

Henvisning:. Santis G, Angell R, Nickless G, Quinn A, Herbert A, Cane P, et al. (2011) Screening for

EGFR

KRAS

Mutationer i endobronchial Ultralyd Afledte transbronkial Needle aspirater i ikke-småcellet lungekræft Brug COLD-PCR. PLoS ONE 6 (9): e25191. doi: 10,1371 /journal.pone.0025191

Redaktør: Melanie Königshoff, Comprehensive Pneumology Center, Tyskland

Modtaget: 19. april, 2011; Accepteret: August 29, 2011; Udgivet: 19 September, 2011

Copyright: © 2011 Santis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC; BB /G006911 /1 til GS), fra Institut for Sundhed via National Institutes of Health Research omfattende Biomedical Research Centre award til Guy og St Thomas ‘National Health service Foundation Trust i partnerskab med Kings College London (til GS JS), og fra Experimental Cancer Medicine Centre Network. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er et medlem af ErbB-receptorfamilien, et centralt regulator af epitelcelleproliferation [1]. EGFR består af et ekstracellulært domæne, en transmembran region og et cytoplasmatisk katalytisk region, der omfatter tyrosinkinasedomænet [1]. Overdreven EGFR-signalering forstyrrer balancen mellem cellevækst og apoptose bidrager til tumorigenese i en lang række faste tumorer, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [2]. Dette kan skyldes overekspression af EGFR, dets signaling partnere, eller to af dens ligander, EGF og TGF-α [3], [4]. Konstitutiv aktivering af EGFR-tyrosinkinaseaktivitet kan være forårsaget af somatiske mutationer i tyrosinkinasedomænet af EGFR [5], [6], [7]. Retrospektive og prospektive studier i asiatiske og europæiske patienter med NSCLC har vist, at tilstedeværelsen af ​​

EGFR

mutationer i exon 18-21 korrelerer med overlegen kliniske resultat til EGFR tyrosinkinaseinhibitorer gefitanib og erlotinib [8], [9] , [10]. Mest NSCLC-specifik

EGFR

mutationer er enten en enkelt aminosyresubstitution ved kodon 858 (leucin til argine, L858R), eller deletionsmutationer i exon 19, som påvirker det konserverede LREA motiv [11]. Disse mutationer findes i et mindretal af kaukasiske patienter med NSCLC, men så mange som 60% af østasiater med adenocarcinom [8], [12], [13], [14]. En separat gruppe af

EGFR

mutationer er forbundet med primære såvel som erhvervet resistens over for erlotinib og gefitinib, og disse klynge i exon 20 i

EGFR

gen [15], [16].

Nogle NSCLC også havnen mutationer i Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog

(KRAS)

koder for en GTPase neden for EGFR [17], [18], [19]. Disse mutationer klynge i exon to af

KRAS

, forekommer i 15-30% af fravalgt NSCLC [20], og synes at være gensidigt udelukkende til

EGFR

mutationer i NSCLC [21]. Det er blevet foreslået, at mutationer i

KRAS

er forbundet med

de novo

resistens over for gefitinib og erlotinib [21]. I modsætning til

EGFR

mutationer, som er en positiv prognostisk faktor,

KRAS

mutationer i resekteres NSCLC var forbundet med kortere samlet overlevelse end dem med

EGFR

mutationer [17], [ ,,,0],18], [19]. Tilsammen nuværende tyder på, at

EGFR

og

KRAS

mutationer definere forskellige undergrupper af NSCLC patienter, med forskellige reaktioner på EGFR- målrettede behandlinger.

De fleste patienter med NSCLC stede på et fremskredent stadium og patologisk diagnose er ofte lavet af små og mellemstore bronkoskopisk, transtorakal kerne biopsier eller cytologiske prøver. De fleste genetisk mutation analyser afhængige polymerasekædereaktion (PCR) til amplifikation af målsekvenser. I modsætning til standard PCR, co-forstærkning ved lavere denatureringstemperatur-PCR (COLD-PCR) fortrinsvis forstærker mutant sekvenser, og derfor øger følsomheden detektere genetiske mutationer [22]. Dette er særlig vigtigt i at analysere tilstedeværelsen af ​​genetiske mutationer i faste cancervæv, hvor tumorceller kan blandes med stromale og andre ikke-malignt væv. Da det først blev beskrevet, har COLD-PCR vist sig at være overlegen i forhold til konventionel PCR i en række ansøgninger designet til at detektere mutationer i blandede prøver [22], [23], [24], [25].

endobronkial ultralyd (eBUS) -transbronchial nål aspiration (TBNA) er et nyligt udviklet teknik, der gør det muligt for ultralyd-vejledt aspiration af mediastinale og hilar lymfeknuder og masser. Stigende data understøtter dens anvendelse i lungekræft diagnose og iscenesættelse som et alternativ til Mediastinoscopy [26], [27], [28], [29], [30], men der er bekymring for, at disse små cytologiske prøver kan give utilstrækkelig tumor materiale for molekylær diagnostik, et område af stigende betydning i NSCLC ledelse. Dette afspejles i en nylig offentliggjort konsensus erklæring om

EGFR

mutation test, som anbefaler, at væv biopsi prøver bør anvendes frem til cytologiske prøver vidt muligt indtil yderligere forskning fastslår pålideligheden af ​​mutationsmønstre data fra cytologiske prøver [ ,,,0],31]. Her fat vi dette spørgsmål ved screening for

EGFR

KRAS

mutationer i 193 eBUS-TBNA afledt cytologiske prøver fra metastatiske lymfeknuder i 132 patienter med NSCLC i almindelig klinisk praksis ved hjælp af et enkelt assay baseret på principperne i COLD-PCR og direkte sekventering.

Resultater

eBUS-TBNA

132 patienter diagnosticeret med NSCLC hjælp eBUS-TBNA mellem maj 2009 og februar 2011 (125 kaukasisk, fire asiatiske og tre britiske Sort) blev inkluderet i denne undersøgelse. Alle patienter (n = 65) med NSCLC uanset histologisk undertype mellem maj 2009 og februar 2010 er medtaget i denne undersøgelse. De resterende 67 patienter (marts 2010- februar 2011) repræsenterer konsekutive patienter med NSCLC, ikke-pladecellekræft undertype. Patient- kliniske karakteristika og sygdomsstadium er vist i tabel 1. Ingen af ​​patienterne havde fået behandling forud for proceduren. Aspirater blev opnået fra 193 lymfeknuder fra stationerne to til 11 (korte akse diameter var 1,2 +/- 0,5 cm) i 132 patienter (tabel 1). Det mediane antal passager pr lymfeknude station var 4,6 (interval: 1-10); dette svarer til den mediane antal passager pr lymfeknude station (3.8) opnået i 972 patienter undersøgt på vores center af eBUS-TBNA mellem februar 2008 og maj 2011 (upublicerede observationer).

Morfologisk diagnose og immunoprofile

Immunhistokemi blev succesfuldt udført i 131 af 132 patienter. Utilstrækkeligt materiale var tilgængelig fra en patient. Histologisk typen blev bestemt ved en kombination af morfologi (cytologiske objektglas og cellblock sektioner) og immunhistokemisk profil. I tilfælde af adenocarcinom, blev diagnosen støttet af ekspression af TTF-1, CK7 eller BerEP4 og negativitet for CK5 og P63. Cytomorphology og ekspression af CK5 og P63 stillede pladecellecarcinom diagnose, mens ekspression af neuroendocine markører (CD56, Chromogranin og synaptophysin) og passende morfologi etableret diagnosen storcellet neuroendokrin carcinom. Udifferentieret NSCLC ved morfologi, der manglede også ekspression af differentieringsmarkører CK5, CK7, CD56, TTF-1, P63, BerEP4 resulterede i diagnosen af ​​NSCLC, uspecificeret (NSCLC-NOS). Baseret på disse kriterier, 94 af de 132 patienter (71,2%) blev diagnosticeret med adenocarcinom, 17 (12,8%) med pladecellecarcinom, to med stor neuroendokrine cellecarcinom (0,15%), den ene med storcellet carcinom (0,07%), og 18 (13,6%) med NSCLC-NOS (tabel 1).

Mutation Analyse

COLD-PCR og sekventering protokol Den blev optimeret til at forstærke og sekvens exon 18 til 21 af

EGFR

og codon 12, 13 og 61 i

KRAS

for at opdage

EGFR

og

KRAS

mutation med følsomhed på 5-10% (mutation frekvenser af 10% blev påvist i alle koldt-PCR-kørsler, hvorimod der ikke blev detekteret mutationsfrekvenser af 5% i to af hver tre kørsler) sammenlignet med mutation følsomhed på 30% for vores standard-PCR-protokol.

En af de 132 prøver ikke at forstærke mål-DNA og derfor

EGFR

KRAS

mutation analyse blev udført i 131 af 132 prøver (99,3%). Patienten prøve, der mislykkedes DNA-amplifikation indeholdt kun 100 celler /sektion [32]. Den kolde-PCR-protokol med succes forstærkede exons 18-21 i 126 af 131 patienter (95,5%) i hvem DNA var tilgængelig. Forstærkning af exon 21 mislykkedes i tre patientprøver (to adenocarcinomer og en pladecellekræft); en af ​​disse prøver også mislykkedes amplifikation af exon 20. To yderligere patientprøver mislykkedes amplifikation af exon 18. Sekventering lykkedes for alle amplificerede sekvenser; derfor komplet molekylær analyse af alle fire

EGFR

mål exons var til rådighed i 126 af de 132 patienter (95,4%) og delvis molekylær analyse i 131 af 132 patienter inkluderet i dette studie (99%).

Brug COLD-PCR kunne vi opdage

EGFR

mutationer i 13 af 126 patienter (10,3%) i hvem fuld molekylær analyse forelå (tabel 2). En patient prøve indeholdt to exon 21 mutationer (tabel 3). Gentagelse af COLD-PCR og sekventering protokol fra en anden cellblock uafhængigt bekræftet alle mutationer. Mutationer blev næsten udelukkende fundet i adenocarcinom undertype (11 af 13; 85%; p 0,001). Et stort deletion i ramme i exon 19 og L858R mutation blev påvist hos to patienter med NSCLC-NOS. Nej

EGFR

mutationer blev påvist i 17 planocellulært karcinom i perioden fra maj 2009 og februar 2010; mutation analyse blev efterfølgende kun udføres i patienter diagnosticeret med NSCLC ikke-pladecellekræft histologi.

EGFR

mutationer blev identificeret i 11 ud af 89 (12,3%) adenocarcinomer og 13 i 110 (12%) ikke-pladecellekræft histologi. Den L858R mutation udgjorde fire af 13 (31%). Vi identificerede kun en deletion i ramme i exon 19 (Δ2481-2495) (tabel 3). Vi identificerede også to nye

EGFR

mutationer; begge var enkelte aminosyresubstitutioner, en i exon 19 (V760M) og en anden i exon 20 (H805L). Der var en kompleks mutation (L833V + L858R). Der er mulighed for, at nye mutationer fundet i denne undersøgelse, er artefakter; dette har været forbundet med PCR af formalin-embedded tissue [33], [34]. Desuden COLD-PCR, samt en standard-PCR-protokol er modtagelige for polymerase-inducerede fejl. I vores undersøgelse blev AmpliTaq Gold anvendt til at amplificere målsekvenser i modsætning til high fidelity Taq polymerase anvendes af Li

et al.

[22], [23], [24] Anvendelse af high fidelity Taq polymerase kunne undgå muligheden for PCR berigelse af PCR-fejl. Imidlertid er det usandsynligt, at de hidtil ukendte mutationer detekteret i vores undersøgelse skyldes COLD-PCR-fejl, da alle mutationer blev bekræftet i separate reaktioner, og ingen mutationer blev påvist i vildtype-DNA, der blev anvendt som negativ kontrol i alle reaktioner. Dette tyder ville også, at AmpliTaq Gold ikke berige amplikoner med kunstige mutationer.

Vi identificerede også den mindre almindelige

EGFR

mutationer G719A, P733S, L747P og L861Q. En anden ualmindeligt mutation (L833V) blev fundet sammen med L858R mutation. MassArray (Sequenom Inc) og Scorpion forstærket refraktær mutation systemet (SARMS) (DSX

EGFR

PCR mutation analyse kit, QIAGEN). Teknologier ville ikke have opdaget mutationer P733S, L747P, V760M, H805L og L833V

KRAS

mutationer analysen var en succes i 130 af 132 tumorer (98,4%). En prøve, der gav intetsigende sekvens heller ikke

EGFR

mutation analyse på grund af mangel på tumor materiale. Enkelt aminosyresubstitutioner involverer codon 12, 13 og 61 i

KRAS

blev identificeret i 23 ud af 130 NSCLC (17,7%) samlet (18 af 93 adenocarcinomer (19%) og fem af 18 NSCLC-NOS (27,7% )) (tabel 3). Ingen blev fundet i patienter med planocellulært tumorer eller hos patienter huser

EGFR

mutationer.

Tidligere undersøgelser og vores egne validering eksperimenter har vist øget følsomhed af COLD-PCR sammenlignet med standard PCR-protokoller [22 ], [23], [24], [25], [35]. Her har vi også udført en begrænset sammenligning af evnen af ​​COLD-PCR til at opdage

EGFR

KRAS

mutationer i 25 eBUS-afledte adenocarcinom cytologiske aspirater med den for standard-PCR. Disse prøver blev også analyseret parallelt af COLD-PCR og SARMS (DxS EGFR PCR kit, QIAGEN) ifølge producentens anvisninger. Vi fandt standard-PCR og efterfølgende sekventering opdaget alle

EGFR

mutationer, der var blevet opdaget af COLD-PCR (L858R, Δ2481-2495 og H805L). Toppens mutation var mere klart synlig efter COLD-PCR amplifikation som vist for den L858R mutation (figur 1A). Standard-PCR undladt at påvise

KRAS

G12C mutation (figur 1B). Denne forskel i mutation afsløring mellem COLD-PCR og standard PCR var ikke signifikant (p = 0,5). Brug SARMS, fandt vi ingen yderligere

EGFR

mutationer blandt disse eBUS-afledte adenocarcinom aspirater. SARMS bekræftede også L858R mutation, der oprindeligt var blevet identificeret af COLD-PCR.

Sekventering electrogramme af sammenlignende analyse af COLD-PCR og standard-PCR-amplifikation af

EGFR

exon 19 og

KRAS

exon 2. A: øvre og nedre paneler er KOLDE og standard PCR-amplifikation af exon 21 af

EGFR

fra eBUS-afledte aspirater fra lymfeknuder infiltreret af metastatisk lunge adenocarcinom hhv. En shows substitution af thymidin (T) ved cytosin (C) i exon 21 af

EGFR

at generere L858R mutation, der er tydeligt i COLD-PCR-amplifikation reaktion (pil) samt standard PCR-reaktion. Den maksimale mutationen er mere tydeligt i COLD-PCR (øverste panel) sammenlignet med standard-PCR-reaktion (nederste panel). B øvre og nedre paneler er KOLDE og standard PCR-amplifikation af

KRAS

exon 2. Det øverste panel viser substitution af guanin (C) ved thymidin (T) for at generere G12C mutation, som blev opdaget af COLD-PCR-amplifikation ( pil). Mutationen var ikke tydeligt i standarden-PCR-reaktionen (nederste panel).

Diskussion

Her er vi rapporterer om muligheden for at anvende COLD-PCR til at screene for

EGFR

KRAS

mutationer i 132 patienter, der var blevet stikprøven af ​​eBUS-TBNA efter vores standard kliniske protokoller. Dette repræsenterer den største gruppe af sådanne patienter rapporteret. Vi demonstrerer fuldstændig evaluering af exon 18 til 21 i 95,5% af

EGFR

og exon to og tre i 98,4% af

KRAS

blandt eBUS-TBNA aspirater. Vores resultater tåler sammenligning med tre tidligere undersøgelser, der screenet eBUS-afledte aspirater for

EGFR

mutationer. García-Olive

et al

Nakajima

et al

succes analyserede exon 19 og 21 i

EGFR

i 72% (26/36) og 93% (43/46 ) af patientprøver henholdsvis [36], [37]. Schuurbier

et al

held analyseret 77% af alle prøver af standard PCR og sekventering af exon 18-21 af

EGFR

[38]. Vi prøver stort set samme størrelse lymfeknuder som dem evalueret i de tre andre undersøgelser og udførte en median på 4,5 passerer pr lymfeknude samplet; dette antal passager svarer til de tre-til-fire passager pr node rådes til at fastslå diagnosen af ​​malignitet [28], [30]. Resultater fra denne og tidligere undersøgelser tyder derfor, at eBus-TBNA kan give tilstrækkelig tumor materiale til

EGFR

KRAS

mutation analyse i almindelig klinisk praksis og dermed undgå behovet for mere invasive kirurgiske prøvetagning i disse patienter.

der er i øjeblikket en række metoder, som er udviklet til at screene for

EGFR

mutationer i NSCLC prøver, hvor mutant DNA udgør kun en brøkdel af den samlede oprenset DNA [7]. Nogle assays, såsom SARMS og skærm MassArray for specifikke mutationer med følsomhed 1% og 10% henholdsvis. Andre strategier, der er afhængige af teknikker såsom høj opløsning smeltning og denaturering højtryksvæskekromatografi registrere de fleste mutationer uden at angive den præcise aminosyresubstitution [7]. I nogle studier blev mikrodissektion af tumor-DNA fra vævsprøver udføres før DNA-amplifikation [39]. Der er i øjeblikket ingen generel enighed om, hvilke af disse er den bedste metode til mutation analyse i NSCLC [31]. Men strategier baseret på DNA-amplifikation og direkte sekventering er den mest omfattende, som de kan screene ikke kun for kendte, men også nye mutationer. Det anbefales, at mindst 30% tumorceller har brug for at være til stede med mere end 10% mutant DNA for effektiv mutation screening stole på standard PCR og sekventering protokoller [7].

COLD-PCR assay anvendes i denne undersøgelse opdaget

EGFR

KRAS

mutationer til stede i tumor-DNA omfatter så lidt som 5-10% af den samlede prøve-DNA. Det er sandsynligt, at ved at anvende en enkelt COLD-PCR kritisk denatureringstemperatur for nogle af de amplikoner testede der er en væsentlig berigelse (som fig. 1 viser) mens det for andre er der ringe eller ingen berigelse. Følsomheden således definerede vores COLD-PCR analyse kunne derfor blevet yderligere forbedret for at detektere mutation frekvenser på mindre end 5% havde vi udviklet en amplikon-specifik assay under anvendelse af optimal heteroduplex annealing og denaturerende temperaturer for hver amplikon. Følsomhed kunne forbedres yderligere ved at udnytte mere følsomme amplicon-specifikke COLD-PCR assays, såsom den beskrevet af Galbiati

et al

[40], eller forbedrede og Complete Berigelse-COLD-PCR (

is

Kolde-PCR) platform, der kan detektere mutationsfrekvenser så lave som 0,1%, [41]. Det er vores opfattelse, men det er usandsynligt, at være muligt for rutinemæssig diagnostisk brug i påvisning af multiple mutationer udnytte amplicon-specifikke analyser og kan bedst anvendes, når tumor celle indholdet er lavere end tærsklen på 5-10% af vores nuværende assay. Interessant, vi for nylig fundet dette at være en usædvanlig klinisk scenario [32]. For eksempel fandt vi, at den mediane tumor celletal i eBUS-afledte lymfeknude aspirater var 2525 (interval 65 til 39.800) og medianværdien procentvise tumor var 70% (interval 10-95%). Det var sammenlignelig med udbyttet fra bronkoskopiske biopsier og overlegen i forhold til udbyttet fra computertomografi-guidede nål biopsier af perifere primære lungetumorer. Faktisk var den procentvise tumor-indholdet i alle prøvetyper undersøgt 5% eller højere [32]. Som eBUS-afledte kliniske prøver kan være sammensat af mindre end 30% af tumorcellerne, kan standard-PCR ikke tilstrækkeligt følsom til at påvise tilstrækkelig følsom til at påvise mutationer i disse prøver. Til støtte for denne, en begrænset sammenligning af COLD-PCR

vs

standard-PCR viste, at standard-PCR ikke har kunnet påvise en af ​​fire mutationer identificeret ved COLD-PCR, som også viste højere mutation toppe (figur 1A 1B). Tidligere undersøgelser har også vist øget følsomhed af COLD-PCR sammenlignet med standard PCR-protokoller [22], [23], [24], [25], [35]. Som COLD-PCR har uden ekstra omkostninger, vi favorisere brugen til standard-PCR til at screene for

EGFR

KRAS

mutationer i disse kliniske prøver.

Vi fandt, at hyppigheden af ​​

EGFR

mutationer i lunge adenokarcinomer og ikke-pladecellekræft NSCLC var stort set i tråd med resultaterne fra to tidligere store undersøgelser i europæiske patienter med lunge adenokarcinomer der fundet

EGFR

mutationer i 10% og 16,6% af patienterne, med exon 19 sletninger, der repræsenterer 46% og 62% af alle

EGFR

mutationer [12], [14]. To af mutationer (V760M og H805L) detekteret i vores patient kohorte var roman og to andre (P733S, L747P) ville ikke have opdaget SARMS (DX Quiagen) eller ved MassArray (Sequenom Inc) analyser. Skelne roman

EGFR

mutationer, der er klinisk relevant fra dem, der er funktionelt tavse eller artefakter er helt klart vigtigt, især så forskellige reaktioner på EGFR tyrosinkinasehæmmer (TKI) terapi af patienter med NSCLC huser ualmindeligt

EGFR

mutationer blev for nylig rapporteret [42]. De mindre almindelige G719A og L861Q mutationer, der blev fundet i vores patient kohorte viste sig at være følsomme over for EFFR TKI-terapi og er derfor klinisk signifikant [42]. Den L747P mutation har været forbundet med dårligt respons over for EGFR TKI-hæmmer, mens en anden mutation ved den samme kodon (L747S) er blevet forbundet med erhvervet resistens over for TKI-terapi. Exon 20 indrykninger, såsom 2319insertionGAC2320 fundet i vores kohorte, er også knyttet til dårlig respons på EGFR TKI-behandling [43]. Vi identificerede også en dublet mutation (L833V kombineret med L858R). Dublet mutationer udgjorde 6% af

EGFR

mutationer, med omkring halvdelen af ​​disse forekommer på fem codoner [44]. Det er interessant dog at L833V i kombination med H835L exon 21 mutation er blevet forbundet med gunstig reaktion på gefitinib [45]. Vi har ingen oplysninger om reaktionsevne vores H833V + L858R mutation til TKI-terapi.

Vi fandt kun en sletning i exon 19, som tegnede sig for 7% af alle

EGFR

mutationer. Dette er betydeligt lavere (p 0,01) end de 36% frekvenser af

EGFR

exon 19 deletioner i NSCLC primær tumor prøver analyseret af COLD-PCR og direkte sekventering af exon 18-21 i vores institution (upublicerede). Denne iagttagelse rejser den mulighed, at exon 19 sletninger kan underrepræsenteret i metastatiske lymfeknuder i forhold til primære tumorer. Park

et al

rapporterede uoverensstemmelse mellem primær tumor og lymfeknudemetastaser i NSCLC især for mutationer i exon 19 [46]. Desuden Nakajima

et al

rapporterede kun én exon 19 sletning blandt 11 (9,9%)

EGFR

mutationer i 43 eBUS-TBNA metastatisk lunge adenokarcinomer i East-asiatiske patienter [37], og i primære lunge adenokarcinomer exon 19 sletninger udgør så meget som 53% af mutationer i østasiatiske patienter [47]. Tab af

EGFR

mutationer i metastatiske lunge adenokarcinomer sammenlignet med primære tumorer er også blevet rapporteret [48]. Større prospektive studier matchende analyse af primær tumor og lymfeknudemetastaser er forpligtet til at vurdere, om

EGFR

exon 19 sletninger eller andre mutationer, er underrepræsenteret i metastatiske lymfeknuder enten på tidspunktet for diagnose eller som reaktion på behandlingen.

i denne undersøgelse har vi også vurderet eBUS-afledte nål aspirater for

KRAS

mutationer ved hjælp COLD-PCR og fundet disse i 19% af lunge adenokarcinomer og 27,7% af NSCLC-NOS. COLD-PCR er tidligere vist at forøge

KRAS

mutationsdetektion følsomhed sammenlignet med almindelige PCR, i en række kliniske prøver [25]. Hyppigheden af ​​

KRAS

mutationer i eBUS-TBNA prøver analyseret i denne undersøgelse er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der er rapporteret

KRAS

mutation frekvens på op til 22%, overvejende adenokarcinomer [20] vigtigere er det,

KRAS

mutationer er forbundet med manglende respons på EGFR-hæmmere i NSCLC [21]. Tilsammen vores resultater viser, at ved at kombinere

EGFR

KRAS

mutation analyse i NSCLC patienter med ikke-planocellulært histologi, kan gøres beslutninger om hensigtsmæssigheden af ​​EGFR TKI-terapi i 27% af vores patient kohorte.

Vi konkluderer, at eBUS-TBNA af mediastinale lymfeknuder infiltreret af NSCLC kan give tilstrækkelig tumor materiale til

EGFR

KRAS

mutation analyse i langt de fleste af patienter uden behov for at ty til mere invasive kirurgiske mediastinoscopy eller mediastinotomy. Vi konkluderer også, at COLD-PCR og sekventering protokoller bør betragtes som en potentiel screeningsanalyse for flere

EGFR

KRAS

mutation analyse i dette kliniske sammenhæng. Evnen til at påvise roman

EGFR

mutationer, som vi påvist i denne undersøgelse, kan også være nyttigt i screening for erhvervet

EGFR

resistente mutationer, et spørgsmål af nye klinisk betydning i NSCLC. Seriel prøvetagning og vurdering af tumorvæv opnået samtidigt anerkendes i stigende grad som vigtige i den kliniske anvendelse af EGFR-målrettede behandlinger. EBUS-TBNA er en sikker og minimalt invasiv teknik, der sandsynligvis vil være særdeles anvendelig i denne sammenhæng.

Materialer og metoder

Etik Statement

Det var en observationsstudie udført i henhold til vores standard kliniske protokoller. Alle patienter gav deres skriftlige samtykke til at undergå eBUS-TBNA og for det samplede materiale, der skal analyseres i henhold til godkendte kliniske protokoller. EBUS-TBNA blev godkendt som en ny eksperimentel procedure af Guy s St Thomas ‘Hospital Klinisk Governance udvalget og er en del af standarden for pleje af patienter med NSCLC. COLD-PCR er den godkendte metode til

EGFR

KRAS

mutation analyse på vores institution.

EGFR

KRAS

mutation analyse er en del af standarden for pleje af patienter med NSCLC på vores institution.

eBUS-TBNA

eBUS-TBNA blev udført af to konsulenter i Respiratory Medicine ved hjælp af en bronkoskop med integreret lineær ultralyd sonde (Olympus 260F) og C200 ultralyd processor i 128 patienter og alfa fem-ultralyd-processor i fire. Proceduren blev udført under anvendelse af lokalbedøvelse. 22G nål blev anvendt til at opsuge hvert knudepunkt. En lufttørret og en alkohol-fikseret konventionel smear blev fremstillet fra hver pasning af et biomedicinsk videnskabsmand og broderede vaskene blev skyllet i afbalanceret saltopløsning: Aqsia ™ (Bausch Lomb, Kingston-Upon-Thames, UK). Lufttørrede udstrygninger blev farvet med Hemacolor ™ (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, UK) til øjeblikkelig vurdering og alkohol-faste slides tilbageholdt til senere Papanicoloau farvning. On-site evaluering (ROSE) af en konsulent cytopathologist forudsat real-time vurdering af aspirater og visitation af cellesuspensioner for cellblocks, flowcytometri eller mikrobiologi som dikteret af mikroskopi. Multiple aspirater fra individuelle knudepunkter fra hver nodal station blev samlet til yderligere analyse. Den samme patolog revideret alle dias og efterfølgende cellblock sektioner, udsendte en diagnose og videresendt cellblocks til molekylær patologi laboratorium for mutation analyse. Slides og alle cellblocks blev også revideret, i henhold til vores lokale kliniske retningslinjer, ved panel af thorax histopathologists og cytopatologer. Endelig diagnose og sygdom fase [49] blev vedtaget efter debat på thorax kræftformer tværfaglige møde. Alle konsekutive patienter, der gennemgår eBUS-TBNA mellem maj 2009 og februar 2010, og som blev diagnosticeret med NSCLC eller blev iscenesat for deres kendte NSCLC blev inkluderet i denne undersøgelse. Mellem marts 2010 og februar 2011 vil alle konsekutive patienter med ikke-planocellulært NSCLC blev evalueret.

Mutation Analyse

Sample forarbejdning og celle blok forberedelse til DNA-ekstraktion.

Tre 10 micron snit fra disse paraffinindlejrede eBUS cellblocks blev afparaffiniseret og DNA blev isoleret fra væv under anvendelse af Qiagen DNA-isolering kit med en modificeret protokol. Kort fortalt blev deparaffinised væv suspenderet i 180 μ af væv opløseliggørende puffer og 70 pi proteinase K-enzym og inkuberet ved 56 ° C natten over. Efter tilsætning af 200 pi af DNA-bindende buffer, blev blandingen inkuberet ved 70 ° C i 10 minutter efterfulgt af 100 pi isopropanol og centrifugering ved 16 kg i 1 minut for at fjerne vævsrester. Kvaliteten af ​​DNA og dets egnethed til PCR-amplifikation blev vurderet ved hjælp af DNA-OK PCR kit, i henhold til producentens anvisninger.

COLD-PCR

COLD-PCR blev udført i overensstemmelse med de principper, udtænkt af Li J

et al

[22] med mindre modifikationer Flere primere (otte-ti pr amplikon) blev designet og syntetiseret til at forstærke exoner 18-21 af

EGFR

og codon 12, 13 og 61 af

KRAS

. Muterede DNA for hver af de-mål-ampliconer blev syntetiseret og serielt fortyndet med vildtype DNA til maksimal fortynding af 5% (muteret til vildtype DNA). Standard og COLD-PCR-reaktioner blev derefter udført ved hjælp af forskellige udglødning og denaturering temperaturer med hver primer par. Heteroduplex formation Temperaturen skulle være betydeligt højere end udglødningstemperaturen af ​​primerne at undgå for tidlig forlængelse.