PLoS ONE: Voksen stromacellers fra humant fedtvæv provokere kræft i bugspytkirtlen Cell Død både in vitro og in Vivo

Abstrakt

Baggrund

Normalt vævshomeostase vedligeholdes af dynamiske interaktioner mellem epitelceller og deres mikromiljø. Forstyrre denne homøostase kan fremkalde afvigende celleproliferation, adhæsion, funktion og migration, der kan fremme en ondartet adfærd. Faktisk afvigende stromale-epitel interaktioner bidrager til pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) spredning og metastaser, og dette øger muligheden for, at nye stroma-rettede laegemidler repræsenterer yderligere tilgange til bekæmpelsen af ​​denne ondartet sygdom. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at bestemme virkningen af ​​humane stromaceller afledt af adipøst væv (ADSC) på pancreas tumorcelleproliferation. Salg

vigtigste resultater Salg

samdyrkning pancreas tumorceller med ADSC og ADSC-konditioneret medium indsamlet fra forskellige donorer inhiberede levedygtighed cancercelle og proliferation. ADSC-medieret inhiberende virkning blev yderligere udvidet til andre epithelcancer-afledte cellelinier (lever, colon, prostata). ADSC konditioneret medium-induceret kræft celle nekrose efter G1-fasen anholdelse, uden tegn på apoptose.

In vivo

, en enkelt intratumoral injektion af ADSC i en model af pancreas adenocarcinom inducerede en stærk og langvarig hæmning af tumorvækst.

Konklusion

Disse data viser, at ADSC stærkt hæmme PDAC spredning, både

in vitro

in vivo

og inducere tumor celledød ved at ændre cellecyklusprogression. Derfor kan ADSC udgøre en potentiel celle-baserede terapeutiske alternativ til behandling af PDAC for hvilke der ikke effektiv kur tilgængelig

Henvisning:. Fætter B, Ravet E, Poglio S, De Toni F, Bertuzzi M, Lulka H, et al. (2009) Voksen stromacellers fra humant fedtvæv provokere kræft i bugspytkirtlen Cell Død både

In Vitro

In Vivo

. PLoS ONE 4 (7): e6278. doi: 10,1371 /journal.pone.0006278

Redaktør: Irene Oi-Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 24. februar, 2009; Accepteret: 31. maj 2009; Udgivet: 17 Jul 2009

Copyright: © 2009 Fætter et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af tilskud fra Region Midi-Pyrenees, Ligue Nationale Contre le Cancer og Cancrople Grand Sud-Ouest (EMERGEANCE). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Normalt vævshomeostase vedligeholdes af dynamiske interaktioner mellem epitelceller og deres mikromiljø. Mikromiljøet består af ekstracellulær matrix, stromaceller, migrerende immunceller og neurale elementer understøttet af en vaskulære netværk, alle inden for en milieu af cytokiner og vækstfaktorer. Celler interagerer med mikromiljøet via komplekse autokrine og parakrine mekanismer. Flere beviser viser, at forstyrre denne homøostase kan inducere afvigende celleproliferation, adhæsion, funktion og udsivning, der kan fremme malign adfærd [1] – [3]. Nylige undersøgelser har ændret opfattelsen af ​​stromacellerne omgivende epiteliale tumorer. Disse celler er ikke tomgang tilskuere, men snarere aktive deltagere, der former hyppigheden og funktioner i tumorer. Derudover kræftceller selv kan ændre deres tilstødende stroma til at danne en tolerant og støttende miljø for tumor progression [1] – [3].

Kræft stamceller og stromale fibroblaster er flittigt demonstreret at støtte neoplastisk proces [4 ] – [11], når knoglemarv afledte mesenchymal-stamceller (BM-MSC’er) indirekte favoriserer tumorvækst efter systemisk immunsuppression [12], eller produktion af pro-angiogene cytokiner [13] – [15]. virkningerne af BM-MSC på tumor spredning, varierer Men ifølge tumoren seværdighed: BM-MSC fremme bryst, melanom og tyktarmskræft afledte celler proliferation [16], [17], når hæmme

in vivo

vækst af Kaposis sarkom-celler [18]. Fedtvæv, som knoglemarv, indeholder stromale celler kaldes ADSCs for adipøst afledte stromaceller. Denne population deler mange af de karakteristika af BM-MSC’er, herunder immunmodulerende effekter [19], og multilineage differentiering potentialer [20] – [29]. Når injiceres

in vivo

, ADSCs udviser regenererende egenskaber enten ved direkte deltagelse i nydannede væv og /eller via produktion af vækstfaktorer, der opretholder denne regenerering [23], [25], [30]. Selvom stromale celler fra knoglemarv og fedtvæv synes at være tæt forbundet, blev der rapporteret bemærkelsesværdige forskelle [19], [31] – [34]. Evne ADSCs at støtte normal og tumorcelleproliferation er i vid udstrækning drøftet.

In vitro

, udvidede ADSCs medieret undertrykkelse af allogen lymfocyt proliferation [35]. Modstridende resultater blev opnået

in vivo

, ved samtidig injektion af ADSCs med bryst-, tyktarms-, prostata-, ikke-små lunge eller glioblastom cancer-afledte celler førte til indledende tumorvækst støtte [36] – [38]. At præcisere sådan uoverensstemmelse, undersøgte vi virkningen af ​​ADSCs på pankreatiske duktale adenocarcinom-afledte celler. Blandt solide tumorer, er pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) kendetegnet ved sin ekstremt tætte desmoplastiske infiltration [39], [40]. PDAC er en meget aggressiv sygdom med ingen terapeutisk løsning, og stadig den femte hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i vestlige lande [41]. Fordi afvigende stromale-epitel interaktioner bidrager til PDAC spredning og metastase, vi hypotesen, at målretning af tumor stroma kan repræsentere en yderligere tilgang til behandling PDAC. Her viser vi evne menneskelige ADSCs (hADSCs) for at reducere PDAC-afledte vækst kræftceller,

in vitro

in vivo

, og fremkalde kræft celledød efter G1-fasen anholdelse .

Resultater

Menneskelige ADSCs udøve en hæmmende virkning på PDAC-afledte cellelinjer

først blev hADSC fænotype bestemt af flowcytometri (Supplerende tekst S1) for at bekræfte at de anvendte celler viste fænotypiske egenskaber normalt beskrevet for ADSCs [22], [23]. Faktisk FACS analyser bekræftet, at ADSC var CD34, CD90, CD73 og HLA ABC positiv hvorimod CD45 og CD31 negative (Supplerende figur S1). Vi derefter bestemmes

in vitro

effekt af hADSCs på PDAC tumorcellevækst. Dyrkede vi PDAC-afledte Capan-1-celler i nærvær af ADSCs isoleret fra 25 forskellige sunde donorer under anvendelse transwell membraner for at forhindre celle-til-celle-kontakt. Efter 48 timers co-kulturer, ADSC udviste en potent dosisafhængige hæmmende virkning på PDAC-afledt celle nummer, som vist i figur 1A. Faktisk blev antallet af pankreatiske cancerceller signifikant faldt med 36,5% ± 4,8% i nærvær af 01:01 forhold af ADSCs, sammenlignet med kontrollen.

A. Stigende forhold mellem ADSC og Capan-1-celler blev co-dyrket i nærværelse af Transwell i 48 timer i fuld vækst medier. Capan-1 celler proliferation blev derefter kvantificeret ved celletælling. Værdier er middel ± S.E. af tre separate forsøg med ADSCs fra forskellige donorer. B. Cancer celler fra forskellig oprindelse blev dyrket i nærvær af ADSC konditioneret medium (CM) i 48 timer. Cellernes levedygtighed blev konstateret ved MTS hjælp Den CellTiter 96® vandige One Solution Cell Proliferation Assay. Resultater er udtrykt som procentdel af værdierne opnået i kontrolbetingelser. Værdier er middel ± S.E. af tre separate forsøg udført med ADSC-CM fra forskellige donorer. C. Capan-1-celler blev dyrket i 48 timer med Capan-1, BM-MSC eller ADSC-CM. Capan-1 celleantallet blev kvantificeret som i A. Værdierne er middelværdier ± S.E. af tre separate eksperimenter med ADSCs og MSC fra forskellige donorer. *: P 0,05. ***; p. 0,001

Konditioneret medium fra ADSCs hæmmer levedygtighed mange tumorceller

Fraværet af direkte celle-til-celle kontakt i vores eksperimentelle indstilling fik os til at teste, om ADSCs -konditioneret medium (CM) kan også forringe levedygtigheden cancer-celle. Faktisk har opløselige faktorer tidligere blevet påvist at mediere den immunosuppressive virkning af humane ADSCs [19]. Som vist i figur 1B, ADSC-CM i sig selv signifikant inhiberet ikke kun levedygtigheden af ​​flere pancreasadenocarcinom-afledte celler (Capan-1, Capan-2, BxPC3, MiaPaCa-2), men også levedygtigheden af ​​leverkarcinom-afledte celler ( HuH7, HepG2), af tyktarmskræft-afledte celler (Caco-2), og af prostatacancer-cellelinie (PC3). I modsætning hertil ADSC kultursupernatant havde ringe, om nogen, virkning på Hela-celler afledt af livmoderhalskræft eller MCF-7, en brystcancer-cellelinie. Fordi, de observerede reaktioner kan afspejle udtømning af næringsstoffer fra medier og /eller ikke bestemt ophobning af toksiske metabolitter, brugte vi konditioneret medium fra kræftceller alene som en kontrol, sammen med BM-MSC-CM. I modsætning til ADSC-CM, behandling kræftceller med enten Capan-1 eller BM-MSC-CM ikke væsentligt svækker levedygtighed kræftcelle selvom der blev observeret en tendens til fald med den sidste (figur 1C).

ADSC-medium hæmmer tumorcelleproliferation og inducerer tumor celledød

for at analysere potentielle effekt af ADSC-CM på kræft celleproliferation, Capan-1 blev inkuberet i tilstedeværelse af BrdU med eller uden ADSC-CM. FACS-analyse blev udført efter celle denaturering og inkubation med propidiumiodid. BrdU inkorporeres i S-fasen (gate P4) henviser farvning med propidiumiodid tillader diskriminering mellem 2n (G0 /G1, gate P2) og 4n (G2 /M, gate P3) kromosomer (figur 2A). Dot plots gated på enkelte celler viste, at antallet af Capan-1 celler i G0 /G1-fasen tendens til at stige, når celler i S-fase faldt betydeligt med 10% i nærvær af ADSC-CM (figur 2B).

A. Capan-1-celler blev dyrket med eller uden ADSCs konditionerede medium blev tilsat. 48 timer senere blev proliferation og DNA-indhold analyseredes ved flowcytometri under anvendelse BrdU-inkorporering og propidiumiodid som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Dot plots er repræsentative for 3 uafhængige forsøg udført med ADSCs stikprøven fra forskellige donorer. B. Kvantificering af celle-cyklus analyse ved hjælp ModFit software. Capan dyrket i kontrolbetingelser var repræsenteret i sorte bjælker i modsætning til Capan behandlet med ADSC-CM repræsenteret i åbne barer. Værdier er middel ± S.E. af tre separate forsøg med ADSCs fra forskellige donorer. C. Capan-1-celler blev podet i 4-kammer objektglas i 48 timer med eller uden ADSC-CM. DNA-fragmentering blev målt ved TUNEL (repræsentativt for tre separate forsøg). D. Capan-1 dyrket i kontrol medium (sorte søjler) eller behandlet med ADSC supernatanter (åbne søjler) blev analyseret for Annexin og propidiumiodid-mærkning som beskrevet i Materialer og Metoder. Værdier er middel ± S.E. af tre separate forsøg med ADSCs fra forskellige donorer. ***: P 0,001

Vi næste bestemme, om ADSC-CM kunne påvirke celledød.. Til dette formål har vi først overvåget DNA fragmentation i Capan-1-celler ved TUNEL-assay. Som vist i figur 2C blev PDAC-afledt celle DNA-fragmentering kraftigt induceret af ADSC-CM. Vi kvantificerede næste antallet af cancerceller ind apoptose og /eller nekrotisk efter udsættelse for ADSC-CM. Præsenterede resultater figur 2D viser, at ADSC-CM inducerede en 3 gange stigning i propidiumiodid-positive, nekrotiske celler, uden tegn på tidlig apoptose overvåget ved annexin mærkning. Igen CM fra BM-MSC var ineffektiv til ændrer sig væsentligt tumor- cellernes levedygtighed (data ikke vist).

tumorcelledød induceret af ADSC konditioneret medium er medieret ved inhibering af cellecyklusprogression

Vi Derefter undersøgte den mekanisme, hvormed tumorcelle cyklus standset ved ADSC-CM. Vi målte ekspressionen af ​​de vigtigste proteiner involveret i cellecyklusregulering. Vi fandt, at ADSC-CM inducerede en dyb inhibering af Rb-phosphorylering i Capan-1-celler, med ingen effekt på protein-ekspression (figur 3A, 3B). Mærkbart udtryk for CDK4 og cyclin D1, som er kritiske for Rb fosforylering, faldt samtidigt. Ekspression af cyclin E, som ikke er involveret i G1-S overgang, forblev uændret (figur 3A; 3B). Af betydning, blev ingen ændringer fundet i ekspressionsniveauerne af spaltet caspase-3, caspase-8, caspase-9, caspase-6, caspase-7, og PARP efter behandling af cellerne med ADSC-CM (data ikke vist). Også ekspressionsniveauer for cytochrom C, BclXl og Bcl2 forblev relativt uændret i vores eksperimentelle indstillinger (data ikke vist).

A. Capan-1-celler blev dyrket med eller uden ADSC-CMfor 48 timer. Proteiner blev derefter ekstraheret og underkastet immunoblotting for de angivne proteiner som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Resultaterne er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. B. Kvantificering af immunoblot densitometri i kontrolkulturer (sorte søjler) eller kulturer behandlet med ADSC-CM (åbne søjler). Værdier er middel ± S.E. af tre separate forsøg med ADSCs fra forskellige donorer. *: P 0,05; **: P 0,01

ADSCs reducerer

in vivo

væksten af ​​humane pancreas tumorer

Vi næste udvidede ADSCs antiproliferative aktiviteter til hæmning af pancreas tumorer. ,

in vivo

. Således blev humane PDAC tumorer etableret i athymiske mus efter subkutan injektion af Capan-1 celler som en meget aggressiv model af PDAC [42], [43]. Fjorten til sytten dage efter tumor indpodning, en enkelt dosis af ADSCs, svarende til 10

3 ADSCs /mm

3 af tumor blev overført

in vivo

ind voksende tumorer. Kontrol- tumorer blev injiceret enten med bærer eller med paraformaldehyd (PFA) faste ADSCs. Kontroltumorer voksede hurtigt, gennemsnitligt 4076 ± 556 mm

3 i størrelse ved 28 dage efter implantation (figur 4A, 4B). I modsætning hertil blev væksten af ​​Capan-1 tumorer modtager ADSC injektion stærkt hæmmet (2556 ± 232 mm

3; figur 4A, 4B). Inhibering af pancreas tumorvækst progression nåede -58% ± 8,9% (p 0,001), to uger efter en enkelt intratumoral injektion af ADSCs (figur 4C). Tumor vægt blev også signifikant reduceret efter ADSCs implantation (kontrol: 4,6 g ± 0,8 vs ADSCs-behandlet 2,2 g ± 0,2, p 0,05). Som vist i figur 4D, væksten af ​​tumorer injiceret med enten vehikel eller PFA-behandlede ADSCs var sammenlignelige, hvilket viser, at inhiberingen af ​​tumorvækst ikke skyldtes en uspecifik virkning af tumor dilacerations og afhængig ADSC sekretion henholdsvis.

Capan-1-tumorer blev implanteret i athymiske nøgne mus som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder (fire til seks dyr per gruppe). To uger senere blev ADSC injiceret i tumoren, og progression blev derefter overvåget. A. repræsentant resekteret tumorer fra athymiske nøgne mus 15 dage efter modtagelse ingen behandling (venstre) eller en enkelt intratumoral dosis på 5 × 10

5 ADSCs (højre). B. Mængden af ​​kontrol (sorte symboler) eller ADSC behandlet (åbne symboler) tumorer blev overvåget hver 2. dag, op til 28 dage efter implantation (13 dage efter ADSCs injektion). C. Andel af kontrol (sorte søjler) eller ADSC behandlet (åbne søjler) tumor progression blev målt på det tidspunkt, efter

in vivo

ADSCs injektion. D. Tumorer blev injiceret enten med bil, PFA faste ADSCs eller ADSCs og deres progression blev målt 6 dage efter intratumoral celle levering. E. Histologiske snit af pankreatiske tumorer injiceret eller ikke med ADSC blev analyseret for proliferation ved Ki67-immunfarvning (Ki67-mærkningsindeks, øverste panel) eller for DNA-fragmentering ved TUNEL-assay (nederste panel), 6 dage efter ADSC injektion. Procentdelen af ​​mærkede kerner blev målt i 15 felter ved stor forstørrelse (× 400) under anvendelse af visiolab 2000 analysesystem. Alle resultater var repræsentative for 3 til 4 uafhængige forsøg (3 til 5 tumorer per gruppe) udført med ADSCs samplede fra forskellige sunde donorer. Værdier er middel ± S.E. *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,01

Vi undersøgte næste de mekanismer, der er involveret i virkningerne af menneskelige ADSCs på PDAC tumorer

in vivo

.. Tumorer behandlet eller ikke med ADSCs blev forarbejdet til immunohistokemi for det nukleare antigen Ki67 for at detektere prolifererende celler (figur 4E, top panel), eller behandles til TUNEL analyse til beregning døde celler (figur 4E, nederste panel), 6 dage efter injektion . Kvantificering af immunfarvning viste en signifikant nedgang i antallet af prolifererende celler, i ADSCs-overførte tumorer sammenlignet med kontrol (-66,5% ± 3,8%; p 0,01). Desuden ADSCs inducerede en 5 gange forøgelse i celledød i pancreas tumorer som målt ved TUNEL-assay.

Diskussion

Vi demonstrerede i den foreliggende undersøgelse, at humane ADSCs samplede fra et stort panel af forskellige raske donorer effektivt svækket væksten af ​​en meget aggressiv cancer, dvs. PDAC, både

in vitro

in vivo

ved at hæmme kræft celledeling og fremme kræft celledød efter G

1 -fase blok. Sidstnævnte hæmmende effekt blev udvidet til maligne cellelinjer fra forskellige oprindelser.

Flere af vores

in vitro

observationer rapporteret her vise, at ADSCs har evnen til at blande sig i spredning af tumorceller ved at ændre cellecyklusprogression.

in vitro

molekylære data viste, at tumorceller, der havde været i kontakt med ADSC-CM var i en hviletilstand (G

0 /G

1), og nedreguleres CDK4 og cyclinD1. Interessant, vi var ude af stand til at identificere enten ydre eller indre-medieret celledød ved apoptose efter eksponering af kræftceller til ADSCs betingede medium. Denne evne til at interferere med cellecyklus er allerede blevet beskrevet for stromaceller fra andre oprindelser [44], [45]. Abnormiteter af G

1-overgang regulatorer, og mere specifikt af Rb-vejen, er blevet anerkendt som væsentlige faktorer i udviklingen af ​​menneskelige kræftformer. Derfor modulation af CDK er et vigtigt mål for forebyggelse og terapi tumor, der kan forklare, hvorfor ADSCs hæmme proliferation af celler, der stammer fra flere epitel kræft.

Brugen af ​​ADSC som køretøj i kræft genterapi er blevet foreslået for nylig [36], [46], [47]. Faktisk ADSCs manipuleret til at konvertere anticancerous prodrug kan være effektive køretøjer til kan hæmme væksten af ​​xenotransplanterede menneskelige kolon eller prostatatumorer [36], [46]. Imidlertid har kun få undersøgelser, der viser modstridende resultater er udført med naive celler isoleret fra fedtvæv [36] – [38], [48]. Disse uoverensstemmelser kan forklares ved processen med ADSC isolation og passage, antallet af injicerede celler og de procedurer, der anvendes til

in vivo

eller

in vitro

studier. Ja, i nogle undersøgelser, blev ADSC injiceret

in vivo

sammen med kræftcellerne, er det således vanskeligt at sammenligne effekten af ​​ADSC på installeret tumor (i denne undersøgelse) versus voksende tumor [36] – [38 ]. Derudover blev nogle data opnået med muse-celler [38] henviser vores model er fremstillet af humane celler og cancerceller fra forskellig oprindelse blev anvendt, selvom vi demonstreret, at ADSC-CM ikke påvirkede levedygtigheden tumor celle i samme omfang. Sidst og ikke mindst arten af ​​ADSC varierer afhængigt af de forskellige undersøgelser, eftersom passerede celler i de fleste tilfælde blev anvendt [36] – [38], [48], mens vi udførte eksperimenter med primære kulturer. Dette kan være af betydning som ADSC fænotype og potentielt funktion er modificeret med passager [49]. Denne variabilitet i de potentielle virkninger af stromale celler på cancercelleproliferation er også blevet beskrevet i undersøgelser under anvendelse af knoglemarvsceller mesenchymstamceller [16] – [18], hvilket tyder på, at forskellige mekanismer kan være involveret i henhold til flere faktorer, der mangler at blive identificeret. For eksempel viser vi her, at celle til celle-kontakt er ikke fuldt nødvendig som anti-proliferative virkninger blev observeret både i direkte undersøgelser co-kultur under anvendelse transwell (ingen celle kontakt) og ved forsøg med ADSCs konditioneret medium. I modsætning hertil Khakoo

et al

nylig vist, at BM-MSC’er udøvede en potent antioncogenic virkning på Kaposis sarkom gennem celle til celle-kontakt og Akt inaktivering [18]. Dette blev senere bekræftet

in vitro

af Ramasamy

et al

[45].

Identifikationen af ​​de involverede i stromale og cancerceller interaktioner mekanismer og især den udskilte faktor ansvaret for den anti-proliferative effekt af ADSC er i øjeblikket under efterforskning. Mange kandidater udskilles af ADSCs (såsom TGF β1, SDF1, RANTES), interleukiner (såsom IL6, IL1 β, IL8, GSF, IL11) eller prostaglandiner (PGE2, PGI2, PGJ2) vides at udøve en antiproliferativ /pro -apoptotic virkning. Vandrende forsøg med Capan afslørede, at ADSC-CM udgør nogen kemoattraktantaktivitet (Supplerende figur S2 og tekst S1), hvilket antyder, at faktor involveret i ADSC antiproliferativ virkning er ikke en kemokin. For nylig er PG’er blevet demonstreret at mediere ADSCs blandet lymfocytreaktion inhibering [35]. Under udarbejdelsen af ​​dette manuskript, foreslog en undersøgelse, som DKK-1 kan være en af ​​disse faktorer (48). IL-6 er for nylig blevet involveret i at beskytte normale og præmaligne epitelceller fra apoptose i colitis associeret cancer (50). Dette antyder, at dette interleukin kan spille modsatte roller afhængigt af inflammatoriske status, tumor scenen og /eller type.

In vivo

, vi opnåede et men effektiv, men forbigående antiproliferativ virkning på tumorprogression. GFP-mærkede ADSCs blev detekteret omgivende perifere tumor fartøjer og inden for centrale og perifere acellulær og nekrotiske områder af tumor, op til 5 dage efter injektion (Supplerende figur S3 og tekst S1). Baseret på denne observation, koncentrationen og /eller halveringstiden af ​​de opløselige faktorer ansvarlige for antiproliferativ /anti-tumoral virkning er sandsynligvis ikke tilstrækkelig til at opretholde tumorceller i en hvilende tilstand i lang tid, men er tilstrækkelige til oprindeligt antagonisere cancercelleproliferation. En sådan kortvarig effekt kan blive reddet af multiple, intratumoral injektion af ADSCs. Levere humane celler i en mus xenotransplanteret med humane cancerceller kan resultere i en ikke-specifik xenogen immunrespons i modtageren at modvirke

in vivo

tumorigenese. Men fordi (i) Capan-1 celler udtrykker ikke MHC fra klasse I og II (data ikke vist), og (ii) athymiske mus immunsystem (kun medieret af NK-celler) er mindre vigtig end i immune dyr, vi med rimelighed udelukke en ikke-specifik immunreaktion i den observerede effekt. I betragtning af evnen hos ADSC at deltage i strukturdannelse vaskulær-lignende [23], kan vi ikke udelukke en specifik pro-angiogen effekt af ADSC i forbindelse med pancreas tumorvækst. Men denne virkning, om nogen, synes at være mindre på stadiet af sygdommen, dvs. under den eksponentielle fase af tumorvækst, som vi testede i dette arbejde. Desuden kunne vi ikke identificere ændringer i vaskulær tæthed, enten fra mus eller human oprindelse, efter intratumoral injektion af ADSCs (data ikke vist). Alternative ændringer i ADSCs fænotype efter intratumoral injektion bør overvåges nøje. Faktisk har vi for nylig vist, at ADSCs hurtigt og massivt erhvervet høj fagocytisk aktivitet og indeks, når det injiceres i bughulen hos nøgne mus [51].

Helt, vores arbejde repræsenterer den første undersøgelse med ikke-modificerede celler til behandle PDAC. Denne anti-proliferative effekt af ADSC på bugspytkirtelkræftceller medieres i det mindste delvist af en udskilte faktor, men det er også fristende at spekulere, at

in vivo

ADSC kan ændre mikromiljøet af tumoren og således hæmme dens proliferation . Afslutningsvis til ADSCs evne blokere G

1-S faseovergang og efterfølgende at hæmme kræftcellers spredning

in vitro

in vivo

kan være en effektiv og gennemførlig fremgangsmåde for behandling af 85% af PDAC patienter, der ikke kan drives på en helbredende måde på grund af en lokalt avanceret sygdom.

Materialer og metoder

Etik Statement

Menneskelig fedtvæv var opnået som affald fra æstetiske kirurgi procedurer. Alle patienter gav deres skriftlige samtykke. Procedurerne blev godkendt af den regionale etik udvalg “Comité de beskyttelse des personnes Sud Ouest et Outre Mer I”.

Kemikalier

For fedtvæv fordøjelse, collagenase blev købt fra Roche (Roche Diagnostic, Tyskland). Bovint serumalbumin (BSA), dexamethason, ascorbat-2-phosphat, pantothensyre, og insulin-transferrin-natriumselenit supplement blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Quentin Fallavier, Frankrig). Føtalt kalveserum (FCS), trypsin, DMEM, RPMI-1640, fungizon, penicillin, streptomycin og PBS blev tilvejebragt af Invitrogen (Cergy-Pontoise, Frankrig). Føtalt bovint serum (FBS) for ADSC kulturen blev indkøbt fra Perbio (Paris, Frankrig). Den antimycoplasma agent blev Plasmocin ™ fra InvivoGen (Toulouse, Frankrig).

Tumor cellekultur

Capan-1, Capan-2, BxPC-3, MiaPaCa-2 og Panc-1 cellelinier afledt fra human PDAC blev dyrket som tidligere beskrevet [52]. HuH7 og HepG2-celler afledt af hepatocellulært carcinom, blev dyrket som beskrevet andetsteds [53]. PC3 (humane prostatacancer) og Caco-2-celler (human colon carcinoma) blev dyrket i DMEM 1 g /l glucose medium suppleret med 10% FCS. Hela (humane cervix-carcinom), blev dyrket i DMEM 4,5 g /l glucose medium suppleret med 10% FCS. Alle medier blev suppleret med fungizon, antibiotika, L-glutamin, og antimycoplasma reagens (Plasmocin ™, InvivoGen). Celler blev holdt ved 37 ° C og 5% CO2.

Menneskelige ADSCs forberedelse og kultur

Menneskelige ADSCs blev udtaget fra 20 raske donorer. Stroma vaskulære fraktion blev isoleret fra humant adipøst væv opnået fra abdominal dermolipectomy i plastikkirurgi departement Rangueil Hospital (Toulouse, Frankrig) som tidligere beskrevet [19]. Kort fortalt blev SVF-celler udpladet i T75 kolber natten over i DMEM-F12 (01:01) -medium suppleret med 5% FBS, 100 pg /ml pantothensyre, 100 uM ascorbinsyre, 16 pM biotin, 250 ug /ml amphotericin, 5 ug /ml streptomycin og 5 U /ml penicillin. Efter 24 timer blev kulturerne vasket grundigt under anvendelse af PBS for at fjerne resterende ikke-adhærente celler. HADSC Væksten blev forfulgt indtil cellerne nåede 75% sammenløb (passage 0).

In vitro

celletal vurdering

50 × 10

3 Capan-1 celler dyrket i komplet RPMI-medium i 24 timer i 35 mm skåle, før serumudsultning i 16 timer. Celler blev dyrket i tre eksemplarer under tilstedeværelse eller ikke af ADSCs eller BM-MSC’er konditioneret medium i yderligere 48 timer. Kontrolceller blev dyrket i DMEM-F12 (01:01) medium suppleret med 5% FBS. Cellevækst blev målt ved celletælling under anvendelse af en Coulter-tæller model ZM. Til co-kultur assays blev Capan-1-celler først udpladet i cellekultur indsætter med 4 um porer (BD Biosciences) i komplet medium i 24 timer. Efter en 16 timer deprivation trin blev Capan-1-celler overført til 35 mm skåle i nærvær af ADSCs i forskellige forhold. Alle forsøg blev udført med ADSCs og MSC’er oprenset fra forskellige raske donorer.

In vitro

celleviabilitetstest

Målceller (15 × 10

3) blev dyrket i komplet medium i fladbundede plader med 96 brønde i 24 timer, før serumudsultning i 16 timer. Celler blev dyrket i tre eksemplarer under tilstedeværelse eller ikke af ADSC-konditioneret medium i yderligere 48 timer. Kontrolceller blev dyrket i DMEM-F12 (01:01) medium suppleret med 5% FBS. Cellelevedygtighed blev målt ved MTS-assay, ifølge producentens anbefalinger (CellTiter96 vandig assay Promega France, Charbonnieres, Frankrig). Eksperimenter blev udført med ADSCs oprenset fra forskellige sunde donorer. Resultater er udtrykt som procentdel af værdier opnået i kontrolbetingelser.

Flowcytometrianalyse af proliferation og celledød

Capan-1-celler blev dyrket og behandlet med ADSCs-CM som beskrevet i

“in vitro celle nummer vurdering”

sektion. Celler blev inkuberet med BrdU 10 um (Sigma Aldrich) i 4 timer ved 37 ° C. Capan blev opsamlet, vasket en gang i PBS og derefter fikseret i iskold 70% ethanol 1 time ved 4 ° C. Cellerne blev opsamlet ved centrifugering ved 600 g, vaskes i PBS indeholdende BSA 0,5% og Tween-20 0,5%, og resuspenderet i 2 N HCI og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask blev cellerne suspenderet i natriumboratpuffer (0,1 M, pH 9) for at neutralisere resterende syre. Celler blev farvet med anti-BrdU monoklonalt antistof (Becton Dickinson) i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vaskene blev Capan-1-celler resuspenderet i propidiumiodidfarvning opløsning (5 ug /ml) før analyse på flow cyotmeter (CantoII, Becton Dickinson). For annexin-V og propidiumiodid detektion blev celler mærket med enten annexin-FITC (Apoptotest FITC, DakoCytomation), eller propidiumiodid (Invitrogen) ifølge producentens anbefalinger. Apoptotisk og nekrotiske celler blev kvantificeret ved hjælp af en BD FACS Calibur (Beckton Dickinson) og Cell quest pro software (Beckton Dickinson).

TUNEL

analyser

Påvisning af celledød ved TUNEL assay på Capan-1-tumorer blev udført som beskrevet andetsteds [42]. For

In vitro

celle-død-assays, 50 × 10

3 Capan-1-celler blev podet i i 4-brønds objektglas (Lab-Tek II kammer dias, Nalge Nunc International, Naperville IL) i komplet medium i 24 timer. Efter serumudsultning i 16 timer blev celler dyrket i tre eksemplarer under tilstedeværelse eller ikke af ADSC-CM i yderligere 48 timer. Kontrolceller blev dyrket i DMEM-F12 (01:01) medium suppleret med 5% FBS. Påvisning af de tidlige stadier af kromosomet nedbrydning blev udført ved hjælp af Apopdetek efter producentens anbefalinger (ApopDETEK, Enzo biovidenskab, Farmingdale, NY, USA).

Western Blot-analyse

Proteiner blev udvundet fra Capan-1-celler, opløst på SDS-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembran som beskrevet andetsteds [53]. Efter stuetemperatur blokering i 1 time, blev blots inkuberet med antistoffer købt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Heidelberg, Tyskland) dannet mod cyclinD1 (sc-124), CDK4 (sc-260), cyclin (sc-247), βactin (sC- 8432) eller glyceraldehyder-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) (sc-24.778). Rb og phosphospecifikt Rb antistoffer var fra cellesignalering Technology (Ozyme, St Quentin en Yvelines, Frankrig). Sekundære HRP-konjugeret antistoffer (Perbio Science, Erembogdegem-Aalist, Belgien) blev tilsat, og blots blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur.