PLoS ONE: Hæmning af celledelingen og vækst af kræft i bugspytkirtlen ved Lyddæmpning af Kulhydrat sulfotransferase 15 In Vitro og i en xenograftmodel

Abstrakt

Chondroitinsulfat E (CS-E), en højt sulfateret glycosaminoglycan, er kendt for at fremme tumor invasion og metastase. Fordi tilstedeværelsen af ​​CS-E detekteres i både tumor- og stromale celler i pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC), har været anset flertrins inddragelse af CS-E i udviklingen af ​​PDAC. Men stadig ikke helt forstået sit engagement i den tidlige fase af PDAC progression. I denne undersøgelse at klarlægge den direkte rolle CS-E i tumor, men ikke stromale celler af PDAC, vi fokuseret på kulhydrat sulfotransferase 15 (CHST15), et bestemt enzym, der biosynthesizes CS-E, og undersøgt virkningerne af CHST15 siRNA på tumorcelleproliferation

in vitro

vækst

in vivo

. CHST15 mRNA udtrykkes stærkt i de humane pancreascancer cellelinier Panc-1, MIA Paca-2, Capan-1 og Capan-2. CHST15 siRNA hæmmede markant udtryk for CHST15 mRNA i disse fire celler

in vitro

. Silencing af CHST15 genet i cellerne var forbundet med signifikant reduktion af proliferation og opregulering af cellecyklussen inhibitor-relateret gen p21

CIP1 /WAF1. I en subkutan xenograft tumor model af PANC-1 i nøgne mus, en enkelt intratumoral injektion af CHST15 siRNA næsten fuldstændig undertrykt tumorvækst. Reducerede CHST15 proteinsignaler forbundet med tumornekrose blev observeret med behandling med CHST15 siRNA. Disse resultater fremlægge dokumentation for den direkte virkning af CHST15 om spredning af pancreas tumorceller dels gennem p21

CIP1 /WAF1 vej. Således CHST15-CS-E-akse-medieret tumorcelleproliferation kunne være en roman terapeutisk mål i den tidlige fase af PDAC progression

Henvisning:. Takakura K, Shibazaki Y, Yoneyama H, Fujii M, Hashiguchi T, Ito Z, et al. (2015) Hæmning af celledeling og vækst af kræft i bugspytkirtlen ved Lyddæmpning af Kulhydrat sulfotransferase 15

In Vitro

og i en xenograftmodel. PLoS ONE 10 (12): e0142981. doi: 10,1371 /journal.pone.0142981

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Februar 7, 2015; Accepteret: 29 oktober 2015; Udgivet: December 7, 2015

Copyright: © 2015 Takakura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Mitsui Life Velfærdsministeriet Foundation indrømme nummer N /A, SK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ud over dette, blev de nødvendige udgifter betalt af de finansielle ressourcer i vores medicinsk kontor (Division of Gastroenterology og Hepatology, Institut for Intern Medicin, The Jikei University School of Medicine). Stelic Institute Co., Inc. ydet støtte i form af lønninger til forfattere (YS, HY, MF, TH), men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskript . De specifikke roller disse forfattere er formuleret i afsnittet “forfatter bidrag”

Konkurrerende interesser: Stelic Institute . Co., Inc. ydet støtte i form af løn til forfattere (YS, HY, MF, TH). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er fast etableret som en af ​​de mest dødelige solide humane tumorer verdensplan [1]. PDAC-relaterede sygelighed og dødelighed tilfælde har begge vist sig at være stigende. Undersøgelse af mekanismerne bag de maligne karakteristika PDAC, herunder sene diagnoser, aggressiv invasion, tidlig formidling og kemo-modstand, er et presserende behov for at etablere en effektiv behandling og til at forbedre prognosen. Tumorudvikling involverer en flertrins proces, såsom proliferation, invasion, metastase og angiogenese, men disse processer stadig dårligt forstået i PDAC. I primære bugspytkirtelkræftceller, er proliferative signaler holdes konstitutivt aktiv ved mutant gener, og den uendelige spredning af genetisk forskellige sub-kloner observeres før invasionen processen. Genetiske ændringer kan forekomme ved fjerne steder efter metastase [2-4]. Alle stadier af tumor progression er også påvirket af det omgivende mikromiljø hvor glycan spiller en central rolle i ændringen af ​​tumorceller og genetiske mutationer. Tumorerne indeholder forskellige glycosaminoglycaner (GAG), der regulerer celle adfærd ved at interagere med forskellige molekyler, såsom vækstfaktorer, cytokiner, kemokiner, proteinaser og deres inhibitorer [5]. GAG’er indbefatter chondroitinsulfat (CS), heparinsulfat, keratansulfat, og hyaluronsyre. Sukkeret rygraden i CS består af gentagne disaccharidenheder af D-glucuronsyre acidβ1-3

N

acetyl-D-galactosamin (GalNAc). Under kædeforlængelse i biosyntesen af ​​CS, er disaccharidenhederne modificeret ved specifikke sulfotransferaser ved C-2 i GlcA og C-4 og /eller C-6 af GalNAc i forskellige kombinationer og vise enorm strukturel diversitet, frembringe karakteristiske sulfat mønstre kritisk for binding til en række funktionelle proteiner. Meget sulfaterede disaccharidenheder som E-enhed, GlcAβ1-3GalNAc (4S, 6S), hvor 4S og 6S står for 4

O

– og 6-

O

-sulfat henholdsvis og E-enhed-rige CS (CS-E) præparater syntetiseret af et specifikt enzym, kulhydrat sulfotransferase 15 (CHST15), og viser bemærkelsesværdige biologiske aktiviteter [6-12]. Akkumulere beviser har afsløret involveringen af ​​CS-E i tumorcelleinvasion og metastase i lungen [6, 13], ovarie [7, 14], bryst [15] og hud [16]. Rolle CS-E i initiering tumorcelleinvasion blev påvist, hvilket tyder potentialet i CS-E som et centralt molekyle i oprettelse hidtil ukendte terapeutiske midler mod forskellige faste tumorer, herunder PDAC [17].

CS-E udtrykkes i både tumorceller og stromaceller omgiver tumoren i PDAC patientens væv [17, 18]. I betragtning af den fordeling mønster af CS-E, den flere stadier og flercellede inddragelse af CS-E i PDAC progression er blevet overvejet. En trinvis undersøgelse er derfor behov for at afsløre de præcise mekanismer i CS-E i de underliggende maligne karakteristika PDAC. Imidlertid har endnu at blive udforsket inddragelse af CS-E i foreløbig PDAC progression. I denne undersøgelse for at undersøge, om CS-E funktioner direkte i proliferationen af ​​PDAC eller ej, gennemførte vi blokeringsforsøg under anvendelse lille interfererende RNA beregnet til at inhibere ekspressionen af ​​CHST15 (CHST15 siRNA), der selektivt inhiberer CS-E-biosyntese. I simple

in vitro

in vivo

xenograft eksperimenter, demonstrerer vi effekten af ​​CHST15 siRNA om spredning af PDAC og diskutere potentialet i CS-E som et terapeutisk mål for PDAC.

Materialer og metoder

Materialer og reagenser

CHST15 siRNA blev købt fra Ambion, Inc. (TX, USA). CS-E blev opnået fra Seikagaku CORPORATION (Tokyo, Japan), rekonstitueret i phosphatpufret saltvand, alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. WST-1 blev opnået fra Roche Diagnostic GmbH (Mannheim, Tyskland). Lipofectamin

™ RNAiMAX Reagent og Invivofectamine

® 2,0 Reagens blev købt fra Invitrogen (CA, USA).

Cellelinjer og mus

PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 og Capan-2, pancreascancer cellelinier blev indkøbt fra ATCC (Rockville, MA, USA). Efter kontrol, at cellerne var fri for mycoplasma-infektion under anvendelse af Mycoplasma PCR ELISA-kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), PANC-1 og MIA PaCa-2, celler blev dyrket i DMEM (Sigma-Aldrich, CA) indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% antibiotika. Capan-1 og Capan-2-celler blev dyrket i IMDM (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) og McCoys 5A Medium Modified (Sigma-Aldrich, CA) indeholdende 10% FCS og 1% antibiotika, hhv. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 /luft

Transfektion af siRNA

RNA-interferens (RNAi) blev udført under anvendelse af omvendt transfektion metode:. Før celleudpladning , siRNA (50 nmol) blev Lipofectamine 2000 og Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) medier blandes og inkuberes i henhold til producentens anvisninger. Efter transfektion i 48 timer blev celler opsamlet og anvendt til de andre analyser.

Tidstro semikvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret ved anvendelse af SV Total RNA Isolation System (Promega, WI, USA) ifølge producentens anvisninger. RNA udbytte og renhed blev bestemt ved spektrofotometri. Revers transskription blev udført med Moloney Murine Leukemia Virus revers transkriptase (Invitrogen) og vilkårlige hexamerer (Promega, WI). Real-time RT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green hjælp af DICE termisk cyklusapparat ifølge producentens instruktioner (TAKARA BIO INC., Otsu, Japan). Alle PCR-primere blev designet og syntetiseret ved TAKARA BIO INC. Genekspressionsniveauer blev normaliseret til glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) og præsenteres som arbitrære enheder. Sense- og antisense-primere anvendt blev vist i tabel 1. Og primersekvenserne er anført i tabel 2. Uafhængige forsøg blev gentaget tre gange for hver prøve, og de relative ekspressionsniveauer af gener blev analyseret.

WST-1 celleproliferationsassay

i den celleproliferationsassay, PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 og Capan-2-celler transficeret med CHST15 siRNA eller negativ kontrol-siRNA blev podet i en 96-brønds plade ved en koncentration på 1 × 10

4 celler /brønd. Cellulær proliferation blev undersøgt efter 60 minutter fra starten af ​​inkubation med celleproliferation reagens WST-1 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland).

Cell proliferationsassay med HGF og CS-E

PANC-1-celler (1.000 celler) blev podet i dyrkningsmedium i en plade med 96 brønde dagen før HGF-stimulering. Cellerne blev stimuleret med 5 ng /mL HGF med eller uden 100 ug /ml CS-E, og celleproliferation blev bestemt ved anvendelse af WST-1 assay i 120 minutter ved 37 ° C.

CHST15 siRNA behandling i en PANC-1 xenograft model

BALB /c nøgne mus (6 til 9 uger gamle) blev indkøbt fra CLEA-Japan (Tokyo, Japan) og blev opretholdt under specifikke patogenfrie betingelser. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg af The Jikei University School of Medicine (Permit nummer: 25-067). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. PANC-1-celler (1 x 10

7 celler) i 100 pi BD Matrigel

™ Matrix (BD, NJ) injiceret subkutant i begge flanker af nøgne mus [19]. Intratumoral injektion af enten 100 pi 250 nM kontrol siRNA eller CHST15 siRNA kompleks med Invivofectamine

® 2,0 reagens (Life Technologies, CA) blev udført 7 dage efter podning. Tumorstørrelse blev målt hver anden dag. På dag 9 og dag 14 blev musene aflivet, og tumorerne blev isoleret, vejet og anvendt til genekspression eller histologiske analyser.

Histologisk analyse

tumorvæv blev fikseret i 10% phosphat -buffered formalin. Efter fiksering blev vævene indlejret i paraffin, og skær objektglas blev anvendt til Hematoxylin-Eosin (HE) -farvning og immunhistokemisk farvning som tidligere beskrevet [20] for CHST15 anvendelse af et anti-humant CHST15 antistof (Sigma-Aldrich) i en fortynding på 01:25. Som et sekundært antistof, Dako EnVision

™ FLEX /HRP påvisningsreagens (Dako, Danmark) blev anvendt. Ingen positive signal blev opdaget, da udelade første antistof, støtte specificitet farvning (data ikke vist).

Statistisk analyse

Alle data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Bonferroni-metode eller t-test. En

s

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Target-specifikke siRNA-induceret CHST15 knockdown i bugspytkirtelkræft cellelinje

Vi bekræftede først den rigelige udtryk for CHST15 mRNA i pancreas cancer cellelinjer Panc-1, MIA Paca-2, Capan-1 og Capan-2 ved hjælp af RT-PCR. Dernæst blev disse fire celler transficeret med enten målspecifikke siRNA-duplexer (CHST15 siRNA) eller en ikke-specifik siRNA kontrol (kontrol siRNA). Gene silencing blev målt ved real-time RT-PCR, og CHST15 ekspression blev reduceret i PANC-1-celler med 1%, 85% og 87% i prøver behandlet med målspecifik siRNA i 24 timer, 48 timer og 72 timer henholdsvis . Ved 48 timer efter transfektion blev dosisafhængig suppression af CHST15 mRNA ekspressionsniveauer observeret (data ikke vist). Derfor, i successive undersøgelser, undersøgte vi virkningen af ​​CHST15 siRNA 48 timer efter siRNA transfektion. CHST15 ekspression blev reduceret i MIA PaCa-2, Capan-1 og Capan-2-celler med 75%, 42% og 36% i prøver behandlet med målspecifik siRNA i 48 t.

Inhibering af pancreas cancercelleproliferation induceret af CHST15 siRNA

for at vurdere virkningen af ​​CHST15 knockdown (fig 1A), blev celleproliferation undersøgt 48 timer efter start af siRNA transfektion ved anvendelse af WST-1 assay. Resultaterne viste signifikant undertrykkende virkning af CHST15 siRNA på celleproliferation i PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 og Capan-2 (Fig 1B). En stigning i p21 genekspressionsniveauer blev påvist i CHST15 siRNA-behandlede celler sammenlignet med kontrol siRNA-behandlede celler i PANC-1 og Capan-2 (Fig 1C).

(A) Relative mængder CHST15 mRNA i kontrol siRNA behandlede og CHST15 siRNA behandlet PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 og Capan-2-celler (n = 3 i hver) blev vist efter normalisering hjælp GAPDH som en intern kontrol. I hver celle linjer, der er væsentlige forskelle om reduktion af CHST15 ekspression i prøver behandlet med målspecifik siRNA i 48 timer. Stjerner (**, ***) p 0,01, P 0,001 henholdsvis mellem kontrol siRNA og CHST15 siRNA. (B) A WST-1 assay. Det gennemsnitlige niveau af proliferation i kontrol siRNA behandlede celler (sort søjle) blev udtrykt som en standard (1.0), og data blev vist i forhold til standarden som en spredning indeks. Middelværdi ± SD (n = 3). Signifikante undertrykkende virkninger af CHST15 siRNA på celleproliferation blev observeret i PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 og Capan-2. Stjerner (*, **) p 0,05, P 0,01, henholdsvis mellem kontrol siRNA og CHST15 siRNA. (C) Relative mængder af p21-mRNA i kontrol siRNA behandlede og CHST15 siRNA behandlet PANC-1-celler (n = 3-5 i hver). Der var en lille stigning og en betydelig forøgelse af p21 mRNA i CHST15 siRNA behandlet PANC-1 celler og Capan-2-celler sammenlignet med kontrol siRNA hhv. Stjerne (*) p 0,05 mellem CHST15 siRNA og kontrol siRNA

Effekt af CHST15 siRNA på pancreas tumorvækst i en xenograftmodel

Efter bekræftelse PANC-1 cellevækst i det. nøgne mus på dag 7 efter inokulation, undersøgte vi den undertrykkende effekt af CHST15 siRNA på PANC-1 celleproliferation

in vivo

(figur 2). Efter injektion Panc-1-celler i begge flanker af nøgne mus, vi administreret CHST15 siRNA ind hver tumor på dag 7. Den anti-proliferative effekt af CHST15 siRNA blev identificeret mod kontrol siRNA Efter dag 9. Panc-1-celler behandlet med CHST15 siRNA voksede langsommere end kontrol siRNA-behandlede celler og ubehandlede celler (fig 2A). Disse resultater indikerer, at spredning af PANC-1-celler blev undertrykt efter knockdown af CHST15. Real time RT-PCR blev udført for at vurdere gen-undertrykkende virkning, men der var ingen signifikant forskel i genekspression mellem CHST15 siRNA-behandlede og kontrol siRNA-behandlede mus enten på dag 9 (data ikke vist) eller dag 14 (fig 2B ).

(A) ændringen af ​​tumor volumen. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD (Ubehandlet, n = 6, Kontrol siRNA: n = 12, CHST15 siRNA n = 10). Stjerner (*, ***) p 0,05, P 0,001 henholdsvis mellem kontrol siRNA og CHST15 siRNA. (B) Relative mængder CHST15 mRNA i ubehandlet, kontrol siRNA behandlet og CHST15 siRNA behandlede xenotransplantater på dag 14. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD (Ubehandlet, n = 6, kontrol siRNA: n = 12, CHST15 siRNA, n = 10 ).

Patologisk undersøgelse af pancreas tumor ved hæmatoxylin og eosin farvning og immunhistokemi

for at påvise effekten af ​​CHST15 siRNA, pancreas tumorer i nøgne mus blev analyseret af HE farvning og CHST15 immunhistokemisk farvning (fig 3). I HE-farvning, blev udbredt nekrose observeret i CHST15 siRNA gruppen (fig 3A) sammenlignet med kontrolgruppen siRNA gruppen (fig 3B). Lokalisering af CHST15 i xenotransplantatet blev evalueret ved immunfarvning mod humant CHST15 protein. CHST15 var stærkt udtrykt af tumorceller placeret i den invasive front (figur 3A og 3C). Stærk CHST15-farvning blev påvist i cytoplasmaet af celler med mesenchymale morfologi (fig 3E). I centrum af tumoren, ekspressionen af ​​CHST15 var relativt lavere sammenlignet med den invasive front (figur 3A og 3C). Svag lokalisering af CHST15 var detekterbar i cellerne i ledning-lignende struktur (fig 3F). I modsætning hertil blev et klart tab af CHST15 farvning i tumoren regioner af CHST15 siRNA gruppen (fig 3D og 3G) afslørede.

(A, B) Tumorer i nøgne mus på dag 19 blev farvet med HE ( oprindelig forstørrelse x 100). Repræsentative billeder blev vist. Udbredt nekrose læsioner var fremtrædende i CHST15 siRNA behandlede mus (A) sammenlignet med kontrollen siRNA behandlede mus (B). (C, D, E, F, G) immunhistokemisk farvning af CHST15 (brune, originale forstørrelser × 100 for C, D, X400 for E, F, G) i xenotransplantater på dag 19. Repræsentative billeder blev vist. Selv om næsten alle tumorceller i xenograft var positive for CHST15 i kontrol siRNA behandlede mus (D), blev stærkt positivt signal observeret i den invasive foran snarere end midten af ​​tumoren. CHST15-stærkt positive tumorceller udviste mesenchymal-lignende morfologi (E), mens CHST15-low positive celler udviste snorlignende morfologi (F), I modsætning hertil lille antal tilbageværende tumorceller var svagt positive for CHST15 i CHST15 siRNA behandlede mus (C ).

CS-E fremmet proliferationen af ​​Panc-1-celler i nærvær af HGF

virkningen af ​​CS-E på proliferationen af ​​PANC-1-celler blev vurderet

in vitro

(figur 4). Selvom HGF er kendt for at fremme proliferation af tumorceller, har lavere dosis af HGF anvendt i denne undersøgelse ikke inducere signifikant tumorcelleproliferation. Imidlertid blev proliferation indeks PANC-1 signifikant forøget med den samme dosis af HGF i nærværelse af CS-E (figur 4).

A WST-1 assay blev udført under anvendelse PANC-1-celle. Det gennemsnitlige niveau af proliferation i PANC-1 celler uden at tilføje CS-E og HGF (hvid søjle) blev udtrykt som en standard (1.0), og data blev vist i forhold til standarden som en spredning indeks. Proliferationsindekset i Panc-1-celler behandlet med lav dosis HGF (sort søjle) udviste ikke statistisk forskel i dyrkningssystemet. I modsætning hertil proliferationsindekset i HGF-behandlede PANC-1-celler øges væsentligt ved tilsætning CS-E (grå søjle). Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD (n = 6 i hver).

Diskussion

Prognosen for PDAC patienter er stadig dystre, og revolutionerende behandlingsmuligheder er stærkt påkrævet. Det er kendt, at den høje dødelighed forbundet med PDAC hovedsagelig tilskrives dens uforlignelige aggressivitet grundet dens tidlige invasion og fjerne metastaser. Disse maligne egenskaber observeres i andre avancerede tumorer som kræft i æggestokkene. I ovariecancer er CS-E påvist i både tumor og stromale celler og er involveret i den uforlignelige aggressivitet af kræft og korrelerer med dårlig prognose [21]. Baseret på deres tilsvarende distributionsmønstre, menes det, at både tumor celle-afledt samt stromacelle–afledt CS-E spiller afgørende roller i de forskellige trin i tumor progression i fremskredne tumorer.

For at undersøge, hvilken rolle CS-E i PDAC, vi brugte CHST15 siRNA, som selektivt hæmmer ekspressionen af ​​CHST15 genet og syntesen af ​​CS-E. Vi valgte denne metode, fordi den selektive hæmning af CS-E ved anvendelse af en tilstrækkelig mængde af kemiske inhibitorer eller antistoffer er stadig en udfordring

in vivo

. Vi fokuserede på effekten af ​​CHST15 direkte på tumor, men ikke stromal, celleproliferation, en primær trin for tumorprogression, i den humane pancreas-cancer-cellelinje PANC-1. I tumor spredning, er GAG blevet rapporteret til at handle som co-receptorer for opløselige tumor vækstfaktorer. GAG’er lette dannelsen af ​​ligand-receptor komplekser og aktivering af receptor signalering.

Fordi HGF er et af de vigtigste opløselige faktorer produceret af tumorceller samt stromale celler i PDAC, testede vi, om aktiviteten af ​​HGF kunne øges ved tilstedeværelse af CS-E. Selv når der anvendes en lavere koncentration af HGF, som inducerede ikke tumorcelleproliferation, blev en betydelig stigning i proliferation bekræftet i nærværelse af CS-E (figur 4). CS-E alene inducerede ikke tumorcelleproliferation ved den testede koncentration, hvilket indikerer, at CS-E forøger receptor signalering for HGF.

Uventet CHST15 siRNA alene direkte hæmmede udbredelsen af ​​Panc-1 celler

i vitro

. En særskilt mekanisme fra co-receptorer blev også foreslået. Selvom vi ikke har undersøgt de detaljerede kinetik under kultur, niveauer af cellecyklus inhibitor-relaterede gen p21

CIP1 /WAF1 steg i PANC-1 celler [22], som viste en betydelig reduktion i CHST15 mRNA niveauer ved 48 h, hvilket tyder at CHST15 gen lyddæmpning modificeret opstrøms veje for p21. I denne henseende har opregulering af p21 blevet rapporteret i nogle forhold i bugspytkirtelkræftceller. For eksempel blokerer hedgehog signalering induceret opregulering af p21 [23, 24]. Fordi CS-GAG-Hedgehog interaktion er blevet rapporteret at forbedre hedgehog signalering [25], en mulighed er, at blokering CS-E syntese kunne bidrage til inhibering hedgehog signalering, hvilket ville føre til en opregulering af p21. Yderligere undersøgelser for at forstå de CHST15-medierede mekanismer, der regulerer cancercelleproliferation relateret til p21 pathway.

Vi testede også virkningen af ​​CHST15 siRNA på tumorvækst ved intratumoral injektion i en xenograft model. Efter oprettelse af tumor, en enkelt injektion af CHST15 siRNA undertrykte markant yderligere vækst tumor (Fig 2A). Vi har ikke observere væsentlig reduktion af humane CHST15 mRNA-niveauer en uge efter CHST15 siRNA injektion, på tidspunktet for offer, i forhold til negativ kontrol siRNA. I modsætning hertil histologisk undersøgelse af xenotransplantatet viste tydeligt nedbringe menneskers CHST15 protein-positive tumorceller ved CHST15 siRNA en uge efter den enkelte injektion, hvilket viser, at der blev opnået vellykket inhibering af CHST15. En mulig forklaring på mRNA-protein ubalance er, at niveauet af tumor-afledt human CHST15 mRNA nåede en top ved tidligere tidspunkter og faldt derefter til dag 9, hvorefter virkningen på mRNA ikke kunne påvises i tilstrækkelig grad. En anden mulighed er, at det kritiske niveau på CHST15 mRNA ikke er tilstrækkeligt detekteres kun ved PCR-metoden. Fordi CHST15-højt udtrykte tumorceller kun kan påvises i den invasive front, men ikke i midten af ​​xenograft, vurderes det, at

in vivo

CHST15 siRNA virker hovedsageligt på disse tumorceller placeret i den invasive front. Antallet af disse celler er begrænset blandt hele tumorceller og mRNA signalerne muligvis ikke i tilstrækkelig grad påvises ved PCR, som anvendes hel xenograft prøve. Når indledningen af ​​tumorvækst blev undertrykt af CHST15 siRNA, og efterfølgende blev produktionen af ​​CHST15 protein hæmmes, yderligere vækst signaler, som CHST15-medierede vækstfaktorer kunne have været effektivt undertrykt. Yderligere undersøgelser for at vurdere tidsforløbet og /eller gentagne siRNA indsprøjtninger kunne afklare

in vivo

mekanisme ligger til grund for mRNA-protein forhold.

Den nuværende undersøgelse viste for første gang, at CHST15 siRNA kunne undertrykke tumorvækst, hvilket betragtes som en primær tumorudviklingsstadie ved det primære sted. Der var imidlertid flere begrænsninger i den foreliggende undersøgelse. Først brugte vi kun PANC-1 celler in vivo, selvom vi brugte tre forskellige cellelinier in vitro og observerede tilsvarende virkninger af CHST15 siRNA i tumorcelleproliferation. For det andet, vi anvendte en hud xenograft model til blot undersøge effekten af ​​CHST15 siRNA på proliferationen og væksten af ​​tumorceller. Orthotrop xenograftmodeller vil give yderligere oplysninger om den rolle, CHST15 siRNA i tumorcelleproliferation i en tumor mikromiljø. Det vil være værd at forsøge at klarlægge det samlede billede af den rolle, CHST15 og CS-E i PDAC progression ved at analysere celle-specifikke og scene-specifikke karakteristika.

rute siRNA levering var begrænset til en intratumoral injektion i den foreliggende undersøgelse. Men vi mener, at den lokale injektion har nogle fordele, når der beskæftiger sig med hypovaskulære tumorer som i PDAC og for siRNA hvis systemisk levering er stadig en udfordring. Faktisk er intratumoral injektion af siRNA’er er i øjeblikket tilgængelig i kliniske omgivelser. En endoskopisk ultralyd (EUS) er ikke kun et diagnostisk værktøj, men også en interventionel og terapeutisk procedure. Det beviser for, at interventionel EUS er nyttigt for PDAC behandling via injektion behandling inklusive siRNA’er har været støt akkumulere [26-30]. Interventionel EUS vil være en væsentlig del af den tværfaglige tilgang til kræftbehandling i den nærmeste fremtid. Denne teknik giver mulighed for at behandle PDAC i en direkte og forholdsvis minimalt invasiv måde med en meget lav forekomst af proceduremæssige komplikationer. Vi mener, at den kliniske anvendelse af CHST15 siRNA hjælp EUS-fin nål injektion til PDAC patienter vil være muligt i en faktiske klinik.

Sammenfattende vores undersøgelse viste, at RNAi-medieret nedregulering af CHST15 effektivt hæmmer proliferation og vækst af pancreas tumorceller. Den CHST15 signalvejen spiller en vigtig rolle i PDAC spredning og vækst og kunne tjene som et potentielt terapeutisk mål for PDAC. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at klarlægge effekten og risikoen for CHST15 gendæmpning af CHST15 siRNA i PDAC udvikling og for at gøre det muligt for dens anvendelse i kliniske anvendelser.

Støtte Information

S1 Database. . Gene-undertrykkende effekt af CHST15 siRNA på dag-9 tumor i en xenograftmodel

relative mængder CHST15 mRNA i kontrol siRNA behandlet og CHST15 siRNA behandlede xenotransplantater på dag 9. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD (kontrol siRNA: n = 7, CHST15 siRNA, n = 5)

doi: 10,1371 /journal.pone.0142981.s001

(DOCX)

.