PLoS ONE: Sonic Hedgehog Signaling Hæmning giver muligheder for målrettet terapi af Sulforaphane i Regulering kræft i bugspytkirtlen Stem Cell Self-Renewal

Abstrakt

dysregulering af den soniske pindsvin (Shh) signalvejen har været forbundet med kræft stamceller (CSC) og impliceret i initiering af pancreascancer. Pancreas CSCS er sjældne tumorceller karakteriseret ved deres evne til at forny sig selv, og er ansvarlige for tumor tilbagefald ledsaget af resistens over for nuværende behandlinger. Den dødelighed af disse uhelbredelige, aggressive og invasive pancreas tumorer er stadig en skræmmende klinisk udfordring. Således er formålet med denne undersøgelse var at undersøge den rolle, Shh pathway i bugspytkirtelkræft og at undersøge de molekylære mekanismer, som sulforaphane (SFN), en aktiv forbindelse i korsblomstrede grøntsager, hæmmer selvfornyelse kapacitet af humane pancreas CSCS. Interessant, vi demonstrerer her, at Shh pathway er stærkt aktiveret i bugspytkirtlen CSCS og spiller vigtig rolle i opretholdelsen stemness ved at regulere ekspressionen af ​​stemness gener. I betragtning af kravet om Hedgehog i bugspytkirtelkræft, vi undersøgt, om pindsvin blokade af SFN kunne målrette stamceller befolkning kræft i bugspytkirtlen. I en

in vitro

model blev human pancreas CSCS afledte kugler hæmmes betydeligt på behandling med SFN, hvilket tyder på klonogene udtynding af CSCS. Interessant SFN inhiberede komponenterne i Shh pathway og Gli transkriptionel aktivitet. Interferens af Shh-Gli signalering signifikant blokeret SFN-inducerede inhibitoriske virkninger demonstrerer kravet om en aktiv vej til vækst af pancreas CSCS. SFN inhiberede også nedstrøms mål for Gli transkription ved at undertrykke ekspressionen af ​​pluripotensbestemmende opretholde faktorer (NANOG og Oct-4) samt PDGFRα og cyclin D1. Endvidere SFN induceret apoptose ved inhibering af BCL-2 og aktivering af caspaser. Vore data viser den afgørende rolle for Shh-Gli signalering i at kontrollere de særlige kendetegn ved pancreas CSCS. Vi foreslår, at bugspytkirtlen kræft forebyggende virkninger af SFN kan skyldes hæmning af Shh pathway. Således Sulforaphane potentielt repræsenterer en billig, sikker og effektiv alternativ til forvaltning af kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Rodova M, Fu J, Watkins DN, Srivastava RK, Shankar S (2012) Sonic Hedgehog Signaling Hæmning giver mulighed for Målrettet terapi af Sulforaphane i Regulering kræft i bugspytkirtlen Stem Cell Self-fornyelse. PLoS ONE 7 (9): e46083. doi: 10,1371 /journal.pone.0046083

Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA

Modtaget: May 10, 2012; Accepteret: August 27, 2012; Udgivet: 28 september, 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:.. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser .

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) har en af ​​de fattigste prognoser blandt alle kræftformer og samlet 5-års overlevelse på 3% [1], [2], [3]. Desværre, i de fleste tilfælde pancreascancer ikke resektabel på tidspunktet for diagnosen. Der er begrænsede behandlingsmuligheder til rådighed for denne sygdom, fordi kemo- og radio-behandlinger er stort set ineffektive, og metastatisk sygdom ofte redevelops selv efter kirurgi [4]. Derfor er der et presserende behov for at opdage nye og effektive kemoforebyggende tilgange til kræft i bugspytkirtlen.

Kræft stamceller /tumor initiering celler (TIC) er blevet foreslået at være årsag til kræft initiering, progression og kemoterapi fiasko i flere humane maligniteter, herunder kræft i bugspytkirtlen [5], [6], [7]. CSC hypotese foreslår, at kun knoglemarven i tumorer er i stand til ubegrænset selvfornyelse og at eliminering af disse celler i sidste ende vil stoppe neoplastisk ekspansion, som bedre differentierede celler har begrænset mitogen kapacitet og vil ikke bidrage til langsigtet tumorvækst . Derfor er det absolut nødvendigt at designe nye strategier baseret på en bedre forståelse af de signalveje, der kontrollerer aspekter af selvfornyelse og overlevelse i CSCS for at identificere hidtil ukendte terapeutiske mål i disse celler. Således kan udviklingen af ​​terapeutiske strategier, der specifikt retter sig mod pancreas CSCS være effektiv i at udrydde tumorer og mindske risikoen for tilbagefald og metastaser.

opregulering af sonisk pindsvineoverføringsvejen er blevet påvist i CSCS, hvilken effekt tumor progression herunder migration , invasion og metastase. Uhensigtsmæssig aktivitet af Hh signalvejen også er blevet forbundet med tumortyper, der opstår sporadisk eller i genetisk prædisponerede individer [8], [9]. Den Shh vej er en tidlig og sen mediator af tumorigenese i epitelial kræft. Aktivering af Shh signalering synes at gå forud for transformation af pancreasvæv stamceller til pankreatiske cancerøse stamceller, med Gli transskriptionsfaktor fungerer som en mediator af miljømæssige signaler og i progressionen af ​​pancreas CSCS i metastatiske tumorceller. Shh signalering lanceres ved binding af det udskilte Shh peptid til 12- span transmembrane protein Patched (ptch), hvilket resulterer i tab af ptch aktivitet og deraf følgende phosphorylering og posttranskriptionel stabilisering af 7-span transmembrane protein Smoothened (Smo), et medlem af Serpentine receptorer [10], [11]. Som følge heraf er ekspression af Hh målgener initialiseres gennem posttranslational aktivering af Gli familie af zink-finger transkriptionsfaktorer [12]. Den Gli familie er en af ​​målgenet konsekvent induceret når Shh pathway aktiveres, hvilket gør dette transkript en pålidelig markør for både fysiologisk og patologisk Shh signaleringsaktivitet. Aktivering af Shh signalvejen er involveret i reguleringen af ​​spredning af pancreas CSCS. Således ved at målrette signalveje, der er afvigende aktiverede og af betydning for opretholdelse af cancer stamceller kan føre til udvikling af nye behandlingsregimer for pancreascancer gennem fjernelse af pancreascancer CSCS [13], [14].

Epidemiologiske undersøgelser har antydet, at øget risiko for kræft i bugspytkirtlen er forbundet med tobak, fedme og højt forbrug af fedt, fisk, svinekød eller oksekød, og det faldt risici forbundet med indtagelse af korsblomstrede grøntsager. En vigtig gruppe af stoffer, der har denne egenskab er de organosvovloverflade forbindelser såsom isothiocyanater (ITC), rigelige i korsblomstrede grøntsager, som forbrug epidemiologisk har vist en omvendt sammenhæng med kræft i bugspytkirtlen. ITC har vist sig at udvise flere potentielle kemobeskyttende aktiviteter i celle- og dyremodeller [15], [16], [17], [18]. Vi har tidligere vist, at oral administration af sulforaphane hæmmede væksten af ​​PC-3-celler orthotopisk implanteret i prostata af nøgne mus ved at inducere apoptose og inhibering af tumorcelleproliferation, metastase og angiogenese [19]. Vi har også for nylig vist, at SFN alene og i kombination med quercetin hæmmer væksten af ​​kræft i bugspytkirtlen stamceller fra kræft i bugspytkirtlen cellelinjer

in vitro

gennem regulering af FOXO proteiner [20]. Således SFN lover godt for udvikling som en kemoforebyggende /terapeutisk middel. På trods af disse fund, der er ingen undersøgelser, der viser reguleringen af ​​pancreas CSCS af SFN, og om SFN kan hæmme Shh pathway.

Således er formålet med denne undersøgelse var at undersøge den rolle, Sonic pindsvin vej hos pancreas kræft og at undersøge de molekylære mekanismer, som sulforaphane (SFN), en aktiv forbindelse i korsblomstrede grøntsager, hæmmer selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS. Den understregede molekylære mekanisme i udviser denne virkning var gennem hæmning af Sonic hedgehog signalering pathway på niveauet for Gli transkription, proliferation, stamceller karakteristika og induktion af apoptose. Disse data antyder, at SFN kan være et nyttigt middel til forebyggelse og behandling af pancreascancer. Sådanne oplysninger vil ikke kun give rationelt design af SFN-baserede strategier til forebyggelse og /eller behandling af kræft i bugspytkirtlen, men kunne også lette udviklingen af ​​mekanisme-drevne protokoller for optimale kliniske virkninger.

Resultater

Angivelse af soniske pindsvinesignaleringsvejen gener i bugspytkirtlen CSCS

The Hedgehog (Hh) signalvejen er afgørende for udviklingen af ​​væv og organer [8]. Men afvigende aktivering af sonisk pindsvin (Shh) signalvejen spiller vigtige roller i tumorigenese og progression af flere tumorer [8], [9]. At vurdere muligheden at Hh-signalering er aktiv i humane pancreas CSCS sammenlignede vi mRNA-ekspression af forskellige komponenter af Shh pathway i human pancreas CSC (PanCSC) til humane pancreatiske normale duktale epitelceller (HPNE) og humane normale pancreas stamceller ( HNPSC), i en

in vitro

cellekultur model og som kvantificeret ved QRT-PCR. Som vist i fig. 1.A-C observerede vi en robust udtryk for centrale elementer i Shh-Gli vej i bugspytkirtlen CSC i forhold til deres normale counter dele. Proteinet ekspression af disse komponenter blev yderligere bekræftet ved Western blotting som vist i fig. 1.D. Interessant viser vi her, at Sonic hedgehog pathway er stærkt aktiveret i pancreas CSCS tyder på, at hyperaktive Shh-Gli signalering kan regulere ekspressionen af ​​gener i stemness pancreas CSCS og spille en rolle i celleproliferation og progression af pancreas CSCS.

(A-C), Relativ ekspression af forskellige komponenter af Shh pathway blev kvantificeret i humane pancreas cancer stamceller (PanCSC), humane pancreas normale stamceller (HNPSC) og humane pancreatiske normale duktale epitelceller (HPNE). Ekspressionen af ​​Shh-gener blev kvantificeret under anvendelse af kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion realtid assay (q-RT-PCR), og normaliseret til GAPDH-ekspression. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og blev beregnet på grundlag af ΔΔ

C

t metode. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. %, Og $ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (D), Immunoblotting af Gli1 /2, Smo og β-actin af menneskelige bugspytkirtelkræft stamceller (PanCSC), humane pancreas normale stamceller (HNPSC) og humane pancreas normale duktale epitelceller (HPNE).

Sulforaphane hæmmer pindsvin signalvej i pancreas CSCS

in vitro

Vi søgte derfor at undersøge effekten af ​​SFN på ekspressionen af ​​Shh receptor (Smothened) og effektorer (Gli1 og Gli2) ved QRT-PCR i humane pancreas CSCS. Som det ses i (fig. 2.A-C), SFN inhiberede ekspressionen af ​​Smo, Gli1 og Gli2. Da vi tidligere har vist Shh pathway aktivering i et panel af humane pancreas cellelinjer [21], søgte vi også at undersøge virkningerne af SFN på ekspression af Shh receptor (Smothened) og effektorer (Gli1 og Gli2) ved QRT-PCR i bugspytkirtelkræftceller aSPC og Panc-1. Som vist i fig. 3, SFN inhiberede ekspressionen af ​​Smo, Gli1 og Gli2 i disse cellelinier samt, hvilket antyder, at SFN kan inhibere aktiveringen af ​​Shh signalering i bugspytkirtelkræft.

(A-C), Inhibering af komponenter af sonisk pindsvineoverføringsvejen. Pancreas CSCS blev behandlet med sulforaphane (0-20 uM) i 24 timer. Ekspressionen af ​​Gli1, Gli2 og Smo blev målt ved QRT-PCR og normaliseret til GAPDH-ekspression. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og blev beregnet på grundlag af ΔΔ

C

t metode. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, @ Og $ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05; (D), Immunoblotting af Gli1 /2, Smo og β-actin af menneskelige bugspytkirtelkræft stamceller (PanCSC) behandlet med Sulforaphane (0-20 uM).

(A-B), Hæmning af bestanddele af sonisk pindsvineoverføringsvejen. ASPC1 og PANC1 blev behandlet med sulforaphane (0-20 uM) i 24 timer. Ekspressionen af ​​Gli1, Gli2 og Smo blev målt ved QRT-PCR og normaliseret til GAPDH-ekspression. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og blev beregnet på grundlag af ΔΔ

C

t metode. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. $, @, Og = Signifikant forskellig fra kontrol, P 0.05.

Eftersom tilstedeværelsen af ​​nukleare Gli udtryk er tegn på aktiv Hh-signalering, vi undersøgt virkningerne af SFN på den nukleare translokation af Gli transkriptionsfaktorer hjælp immuncytokemi (ICC). Pancreas CSCS blev behandlet med SFN (0-20 uM) i 24 timer. Celler blev derefter farvet med anti-Gli og Gli2 antistof (grøn fluorescens), og DAPI (rød fluorescens). Flettede billeder skal vises, som angiver gul-orange farvning af Gli 1 og Gli2 placeret i kernen på grund fusionere af grøn og rød fluorescens. Som vist i fig. 4A, SFN inhiberede nukleare translokation af Gli1 og Gli2, som målt ved ICC. Disse data derfor foreslå, at SFN hæmmer sonisk pindsvineoverføringsvejen på niveau med Gli aktivering.

(A), Den nukleare translokation af Gli1 og Gli2, blev målt ved immunocytokemi. Pancreas CSCS blev behandlet med sulforaphane (0-20 uM) i 24 timer. Celler blev derefter farvet med anti-Gli og Gli2 antistof (grøn fluorescens), og DAPI (rød fluorescens). Flettede billeder skal vises, som indikerer gulorange farvning af Gli 1 og Gli2 placeret i kernen på grund af co-lokalisering af grøn og rød fluorescens. (B), Inhibition af Gli transkription. Pancreas CSCS blev transduceret med Gli-responsive GFP /ildflueluciferase virale partikler (pGreen Fire1-Gli med EF1, System Biosciences). Efter transduktion, blev dyrkningsmediet erstattet og CSCS blev behandlet med sulforaphane (0-20 uM) i 24 timer. Gli-responsiv reporter-aktivitet blev målt under anvendelse af en luciferase assay (Promega Corporation). Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @,%, Og * = signifikant forskellig fra kontrol, P 0.05.

Afbrydelse af Shh signalering ved Sulforaphane hæmmer Gli reporter aktivitet i bugspytkirtlen CSCS

Siden Gli transskription faktor medierer effekten af ​​Shh, der spiller en vigtig rolle i at opretholde stemness og tumorigenese, vi næste målte Gli transkriptionel aktivitet (fig. 4B). Pancreas CSCS blev transduceret med Gli-responsive GFP /ildflueluciferase virale partikler (pGreen Fire1-Gli med EF1, System Biosciences). SFN inhiberede Gli transkriptionel aktivitet på en dosis-afhængig måde. Disse data antyder, at SFN kan regulere pancreas carcinogenese som medieres gennem inhibering af Shh signalering.

Inhibering af Gli forøger virkningen af ​​sulforaphane på sfæroid dannelse i pancreas CSCS

Desuden at bestemme effekt af SFN på Shh signal hæmning på pancreas CSC spredning og selvstændige fornyelse, vi udførte sfære dannelse assay. Pancreas CSCS blev behandlet med SFN (0-20 pM) i 1 uge og vurderet for dens iboende evne til at danne primære sfærer i kultur. Ved udgangen af ​​en uge blev samlede antal kugler målt og evne til at danne sekundære sfærer blev yderligere vurderet i en anden uge. Humane pankreatiske CSCS afledte sfærer blev inhiberet signifikant ved behandling med SFN, hvilket tyder på klonogene udtynding af CSCS (fig. 5A).

(A), inhiberende virkninger SFN på CSC sfæroide levedygtighed. Pancreas CSCS blev podet som beskrevet ovenfor og behandlet med SFN (0 og 20 uM). Efter 7 og 14 dage blev primære og sekundære sfæroider dissocieret og levedygtige celler blev talt ved trypan blue assay. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @ Og $ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (B), blev pancreas CSCS transduceret med enten krypteret shRNA eller Gli1 og Gli2 shRNA udtrykkende lentivirusvektorer (pLKO.1), og cellelysater blev opsamlet og Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af anti-Gli1 eller Gli2 antistof. (C), CSC /krypteret og CSC /Gli shRNA blev podet som beskrevet ovenfor og behandlet med SFN (0-20 uM). Efter 7 dage blev sfæroider opsamlet og cellesuspensioner fremstilledes og levedygtige celler blev talt ved trypan blue assay. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @,%, Og * = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (D), Gli shRNA forøger de inhiberende virkninger af SFN på CSC sfæroide levedygtighed. CSC /krypteret og CSC /Gli shRNA blev podet som beskrevet ovenfor og behandlet med SFN (0 og 20 uM). Efter 7 dage blev sfæroider photomicrographed.

I betragtning af kravet om Hedgehog signalering i kræft i bugspytkirtlen, vi undersøgt, om Hedgehog blokade af sulforaphane kunne målrette stamceller befolkning kræft i bugspytkirtlen. For at forstå den rolle, Shh signalering i SFN induceret hæmning af pancreas CSC proliferation, forsøgte vi at inhibere Shh signalering i pancreas CSCS ved at banke ned Gli transkriptionsfaktoren ved hjælp lentiviral medieret transduktion af Gli shRNA inhibere både Gli1 og 2-ekspression. Ekspressionen af ​​Gli i pancreas CSC blev undertrykt med næsten 100% ved anvendelse af de shRNAs målretning Gli1 og Gli2 som kvantificeret ved Western blotting (fig. 5B). Som vist i (Fig. 5C-D), blev procentdelen af ​​kugle dannende evne pancreas CSCS signifikant reduceret i Gli knock-down celler i forhold til kontrolcellerne. Endvidere indblanding Shh- Gli signalering gennem lentiviral – medieret tavshed markant blokeret SFN inducerede hæmmende virkninger demonstrerer kravet om en aktiv vej for vækst af kræft i bugspytkirtlen stamceller

SFN hæmmer ekspressionen af ​​pluripotens opretholde transkriptionsfaktorer.

Vi har for nylig vist, at bugspytkirtlen CSC udtrykker stamceller markører CD133, CD44, CD24, ESA, udtrykker høje niveauer af pluripotens opretholde faktorer og narkotika resistensgener MDR1 og ABCG2 sammenlignet med normale bugspytkirtlen celler og bugspytkirtelkræftceller [22]. Vi kendetegnet derfor CSCS isoleret fra humane pankreatiske tumorer ved flow cytometery anvendt i den foreliggende undersøgelse. Som vist i (Fig. 6A-D), pancreas CSCS ekspres stamcellemarkører CD44, ESA, CD133, og CD24. Interessant, bugspytkirtlen CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ CSCS udtrykte også CK19 (kræft i bugspytkirtlen specifik epitelial markør) og ABCG2 narkotika resistensgener (fig. 6E-F).

(A-D), Ekspression af pancreas stamcellemarkører. Flow cytometri af pancreas CSCS udtrykke blev udført ved hjælp af stamceller markører CD44 -PE, ESA-PerCP, CD133-APC, CD24-FITC og passende kontroller. (E-F), Ekspression af pancreasepitelceller markører og lægemiddelresistente gener. Flowcytometrisk analyse af pancreas CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ CSCS udtrykte også CK19-PE og ABCG2-PE hhv.

Nanog er afgørende for pluripotens, sammen med andre ES som signatur faktorer, såsom OCT4 er også afgørende for pancreas CSCS og andre kræftformer [23], [24]. De godtages Hh målgener samt. Faktisk kan niveauerne af OCT4 inducerer epitel dysplasi hos mus, og er blevet impliceret i forskellige humane tumorer som også reguleres af Hh-Gli signalering. Vi er derfor, søgt at undersøge virkningerne af SFN på ekspressionen af ​​disse faktorer

in vitro

. Som vist i (Fig. 7A-B), SFN inhiberede mRNA ekspression af Nanog, og Oct-4 i pancreas CSCS. Endvidere, som bekræftet ved Western blotting i (fig. 7C), SFN hæmmede protein udtryk for Nanog, og Oct-4 i pancreas CSCS. Disse data viser, at Shh signalering kan fremme bugspytkirtlen CSCS spredning gennem øget celle selvfornyelse.

(A-B), Effekter af SFN på ekspressionen af ​​Hh målgener i pancreas CSCS. Real time PCR (Q-RT-PCR) blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​Nanog og Oct4 og data blev normaliseret med GAPDH. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og blev beregnet på grundlag af ΔΔ

C

t metode. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @ Og% = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (C), blev pancreas CSCS behandlet med SFN (0-20 uM), og cellelysater blev opsamlet og Western blot-analyse blev udført under anvendelse anti Nanog, Oct4 eller β-actin antistof. (D-E), Virkninger af SFN på ekspression af Hh målgener involveret i celleproliferation i de Langerhanske CSCS. Real time PCR (Q-RT-PCR) blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​PDGFRα og cyclin D1, der er involveret i opretholdelse af proliferation blev analyseret og normaliseret med GAPDH. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og blev beregnet på grundlag af ΔΔ

C

t metode. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @,%, Og $ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (F), pancreas CSCS blev behandlet med SFN (0-20 uM), og cellelysater blev indsamlet og Immunobloted for anti- PDGFRα, cyclin D1 eller β-actin antistof.

Hedgehog signalering blockadge af sulforaphane inhiberer celleproliferation og inducerer apoptose i pancreas CSCS

Vi næste undersøgt virkningerne af SFN på mRNA-ekspression af gener nedstrøms for Gli transkription, som er involveret i celleproliferation. Som vist i (Fig. 7D-E), SFN inhiberede downstream mål for Gli transkription cyclin D1 og PDGFRα i pancreas CSCS som er kendt Hh target gener involveret i proliferation. Endvidere blev inhiberingen af ​​protein ekspression af disse mål ved SFN i pancreas CSCS bekræftet ved Western blotting (Fig. 7F). Disse data antyder, at SFN kan regulere pancreas carcinogenese ved at inhibere Shh pathway og dens downstream targets.

Vi har desuden vist, at SFN induceret apoptose i pancreas CSCS ved at inhibere Bcl-2-ekspression og gennem aktivering af caspase 3 /7 (fig. 8A-B). Inhiberingen af ​​proteinet ekspression af BCL2 og opregulering af spaltet caspase-3 blev bekræftet ved Western blotting som vist i (Fig. 8C). Endvidere flowcytometrianalyse med PI farvning af SFN-behandlede celler i (fig. 8D), viser, at stigende doser af SFN øget apoptose i pancreas CSCS på en dosis-afhængig måde. Disse data antyder, at SFN kan inhibere celleproliferation og inducerer apoptose i pancreas CSCS ved at målrette Shh pathway og dets målgener.

(A), Virkninger af SFN på Bcl-2expression. q-RT-PCR blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​bcl-2. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og blev beregnet på grundlag af ΔΔ

C

t metode. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @,% Og $ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (B), Virkninger af SFN på caspase-3/7-aktivitet. Pancreas CSCS behandlet med SFN (0-20 uM) i 24 timer, og caspase-3/7-aktivitet blev målt i henhold til producentens anvisninger. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. @,%, Og $ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (C), blev pancreas CSCS behandlet med SFN (0-20 uM), og cellelysater blev opsamlet og Immunobloted for anti-Bcl-2, spaltet caspase 3 eller β-actin antistof. (D), Virkninger af SFN på apoptose. Pancreas CSCS blev behandlet med SFN (0-20 uM) i 48 h, og apoptose blev målt ved PI farvning ved anvendelse af flowcytometri.

Diskussion

Kræft i bugspytkirtlen bliver klinisk synlige på sent stadier og det modstår alle former for konventionel kemoterapi og strålebehandling [1], [2]. Vi har for nylig vist, at CSCS deler molekylære karakteristika med normale stamceller (SCS) og spille kritiske roller i lægemiddelresistens og kræft metastaser. Pancreas CSCS også demonstrere opregulering af molekyler vigtige i udviklingsmæssige signalveje, herunder sonisk pindsvin (Shh) vej. Ukontrolleret aktivering af Shh pathway er blevet impliceret i progressionen og opretholdelsen af ​​pancreas-adenocarcinomer [25], [26]. Pathway aktivering via Smo kan således forekomme enten ved Hh-protein stimulering eller gennem tab af ptch aktivitet, som det ses i sporadiske cancere eller dem, der opstår i familiær cancer prædisposition syndrom, BCNS (basalcelle nevus syndrom, der er forbundet med heterozygot mutation af den humane ptch gen). Aktivering af Shh signalvejen er involveret i reguleringen af ​​spredning af pancreas CSCS [27]. Midler, der inhiberer Shh pathway har potentiale til at forhindre sygdomsudvikling og metastatisk spredning [28]. Samt lægemidler, der selektivt målrettet CSCS tilbyder en mere lovende for forebyggelse og terapi kræft. Dette projekt er baseret på den forudsætning, at SFN, en naturlig forbindelse fra korsblomstrede grøntsager, kan bruges til forebyggelse og /eller behandling af human bugspytkirtelkræft. Således er hovedformålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge den rolle, sonisk pindsvineoverføringsvejen i bugspytkirtelkræft og undersøge de molekylære mekanismer, som sulforaphane hæmmer pancreas CSC egenskaber, og vurdere dens kemoforebyggende /terapeutisk potentiale mod kræft i bugspytkirtlen ved at målrette CSCS.

SFN er et naturligt forekommende isothiocyanat med lovende kemoforebyggende aktivitet [29]. Epidemiologiske undersøgelser har vist, at mennesker, der spiser korsblomstrede grøntsager har reduceret forekomst af kræft i bugspytkirtlen og andre kræftformer. Dyreforsøg har vist, at fodring SFN reducerede frekvensen, størrelsen og antallet af tumorer af forskellig oprindelse. Det var godt og hurtigt absorberet og vises en absolut biotilgængelighed på 82% [30]. Det er en fase 2 enzyminducer [31], og hæmmer benzo [a] pyren-DNA og 1,6-dinitropyrene-DNA addukter formation. Det fungerer som en antioxidant, antiproliferativ, antitumor, og anti-angiogent middel, og dermed en ny kandidat til chemoprevention [19], [32], [33], [34]. Nogle af de seneste undersøgelser af kræft i bugspytkirtlen stamceller fra humane cellelinjer er blevet rapporteret, hvor de har vist, at SFN kan hæmme deres vækst gennem hæmning af NFKB [35]. Disse undersøgelser antyder kraftigt, at SFN kan modulere ekspressionen af ​​gener vides at spille roller i carcinogenese proces, og derfor kan være en potentiel agent for chemoprevention mod kræft i bugspytkirtlen. Så vidt vi ved er dette den første undersøgelse for at vise, at sulforaphane kan inhibere væksten af ​​primære pancreatiske CSCS afledt af humane tumorer

in vitro

gennem hæmning af Sonic pindsvineoverføringsvejen og således betragtes som meget roman.

i den foreliggende undersøgelse har vi påvist for første gang, at kræft præventivt middel SFN inhiberer ekspressionen af ​​komponenter af Shh pathway i humane pancreas CSCS. SFN inhiberede ekspression af receptormolekylet Smo, samt effektorer Gli 1 og 2, hvilket tyder på den kliniske betydning af Shh pathway i bugspytkirtelkræft progression. Den påtvungne aktivering af Shh eller inhibering af Gli1 plus Gli2 ekspression ved shRNA blokeret de inhiberende virkninger af SFN, hvilket tyder virkningerne af SFN medieres via inhibering af Shh pathway. SFN hæmmer selvfornyelse kapacitet af humane pancreas CSCS ved at hæmme pluripotens opretholde faktorer og Shh pathway. Specifikt SFN hæmmer selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS ved at hæmme ekspressionen af ​​pluripotensbestemmende opretholde transkriptionsfaktorer (NANOG og Oct-4), komponenterne i Shh pathway, og inducerer apoptose ved at inhibere Bcl-2, cyklin D2, og aktivering caspase -3 og 7. samlet vores foreliggende studier foreslår kraftigt, at SFN er en potent biologisk inhibitor af human pancreas carcinogenese, reducere deres proliferative og invasive aktiviteter. Disse undersøgelser hæver det perspektiv, at sulforaphane kan være et nyttigt middel til forebyggelse og /eller behandling af kræft i bugspytkirtlen ved målretning CSCS.

Siden CSCS /stamceller spiller vigtige roller i kræft initiering, progression, tilbagefald og resistens hæmning af CSC vækst og deres selvfornyelse kapacitet med sulforaphane kunne blive betydelige for forvaltningen af ​​kræft i bugspytkirtlen og er for nylig blevet revideret i flere papirer som kemoforebyggende strategi kosten agenter til at målrette kræft stamceller [36], [37]. Belysning af mekanismen (er) for antiproliferativ aktivitet af SFN er afgørende for den samlede vurdering af dens potentielle kliniske anvendelighed. Sådanne oplysninger vil ikke kun give en rationel udformning af sulforaphane, baserede strategier til forebyggelse og /eller behandling af kræft i bugspytkirtlen, men kunne også lette udviklingen af ​​mekanisme-drevne protokoller for optimale kliniske virkninger.

Konklusioner

Vi har demonstreret her for første gang, at SFN hæmmede selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS isoleret fra humane primære tumorer og hæmmer pancreas CSC egenskaber. De inhibitoriske virkninger af SFN medieres via inhibering af Shh pathway. SFN inhiberede ekspression af transkriptionsfaktorer (Nanog og Oct-4) som kræves for at opretholde stamcelle pluripotens. SFN potent eliminerer pancreas CSCS egenskaber ved at påvirke clonogenecity, kugleformet dannelse sammen med signalering involveret i apoptose modstand og spredning. Således regulering af Shh signalvej i CSCS af ikke-toksisk middel sulforaphane, kan betragtes som en ny strategi til behandling og /eller forebyggelse af pancreas cancer. Da afvigende Shh signalering forekommer i bugspytkirtlen tumorigenese, kan midler, som er rettet mod Shh pathway forbedre resultaterne af patienter med kræft i bugspytkirtlen ved at målrette CSCS og også lette udviklingen af ​​mekanisme-drevne protokoller for optimale kliniske virkninger.

Materialer og metoder

Reagenser

Antistoffer mod GAPDH og Gli blev købt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). SFN indkøbtes fra LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). Forøget kemiluminescens (ECL) Western blot afsløring reagenser var fra Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). Alle andre kemikalier blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cell kultur

Humane normale pancreas stamceller (HPSC) og menneskelige bugspytkirtelkræft stamceller (CD133

+ /CD44

+ /CD24

+ /ESA

+) blev opnået fra Celprogen Inc. (San Pedro, CA). De blev isoleret fra primære tumorer og er blevet beskrevet tidligere [38]. Disse CSCS består af en bulk pancreascancer stamcellepopulation, og kan derfor ikke betragtes som en cellelinie. De CSCS blev dyrket i DMEM suppleret med 1% N2 Supplement (Invitrogen), 2% B27 Supplement (Invitrogen), 20 ng /ml human blodplade vækstfaktor (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (Invitrogen) og 1 % antibiotikum-antimykotikum (Invitrogen) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. Humane pankreatiske normale duktale epitelceller (HPNE) blev opnået fra

Lonza, Clontetics og opretholdt i DMEM suppleret med vækstfaktor bullet kit. Salg

Tumor kugleformet assay

Sfæroide danner assays blev udført som beskrevet andetsteds [22], [39].