PLoS ONE: farmakogenomisk tilgang til Identificer Drug Følsomhed i småcellet lungekræft

Abstrakte

Der er i øjeblikket ingen molekylære målrettede tilgange til behandling småcellet lungecancer (SCLC) ligner dem, der anvendes med succes mod ikke-småcellet lungekræft. Denne mangel skyldes vores manglende evne til at identificere klinisk relevante undertyper af denne sygdom. Således er der behov for en mere systematisk tilgang til lægemiddelforskning for SCLC. I denne forbindelse for nylig to omfattende undersøgelser offentliggjort i

Natur,

kræftcellen linje Encyclopedia og Cancer Genome Project, giver et væld af data om narkotika følsomhed og genomiske profiler af mange forskellige typer af kræftceller. I den foreliggende undersøgelse har vi minerede disse to undersøgelser for nye terapeutiske midler til SCLC og identificerede varmechokproteiner, cyclinafhængige kinaser og polo-lignende kinaser (PLK) som attraktive molekylære mål med ringe nuværende klinisk forsøg aktivitet i SCLC. Bemærkelsesværdigt, vores analyser viste, at de fleste SCLC cellelinjer samlet i en enkelt, dominerende undergruppe ved enten genekspression eller CNV analyser, der fører os til at tage en farmakogenomisk tilgang til at identificere undergrupper af narkotika-følsomme SCLC celler. Brug af PLK-inhibitorer som eksempel, vi identificeret og valideret et gen signatur for lægemiddelfølsomhed i SCLC-cellelinier. Dette gen signatur kunne skelne subpopulationer blandt humane SCLC tumorer, tyder på potentielle kliniske anvendelighed. Endelig blev Circos parceller konstrueret til at give et overblik over, hvordan transkriptionelle, kopiere nummer og mutationsmønstre elementer påvirker PLK følsomhed i SCLC-cellelinjer. Tilsammen denne undersøgelse skitserer en tilgang til at forudsige narkotika følsomhed i SCLC til nye målrettede lægemidler

Henvisning:. Wildey G, Chen Y, fasten jeg, Stetson L, Pink J, Barnholtz-Sloan JS, et al. (2014) farmakogenomisk tilgang til Identificer Drug Følsomhed i småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (9): e106784. doi: 10,1371 /journal.pone.0106784

Redaktør: Gagan Dyb, University of Colorado Denver, USA

Modtaget: 28. maj 2014; Accepteret: 31 juli 2014; Udgivet: 8 September, 2014

Copyright: © 2014 Wildey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Støttet af tilskud fra University Hospitals Seidman Cancer Center og National Cancer Institute U01 CA062502 (GW, AD), den Translationel Research Core Facility (IL JP) og Biostatistik Bioinformatik Core Facility (YC, JSB-S) i sag Comprehensive Cancer Center (National Cancer Institute P30 CA043703), og National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (LS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

småcellet lungecancer (SCLC) udgør 15% af alle lungecarcinomer og er typisk diagnosticeres når sygdommen har spredt [1], [2]. Desværre har der kun været mindre forbedringer i standarden for pleje af SCLC i de seneste tre årtier [3] – [5]. Der er i øjeblikket ingen molekylære målrettede tilgange til behandling SCLC ligner dem anvendt med succes over for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), såsom erlotinib målretning af mutant EGFR eller crizotinib målretning af EML4-ALK fusionsproteiner [6], [7] . Kirurgi er sjældent udført i denne sygdom (kun 1% af tilfældene), begrænse adgangen til tumorvæv for omfattende genomiske analyser. Desuden har de to skelsættende genomics undersøgelser for nylig offentliggjort på SCLC givet lidt terapeutisk indsigt i denne sygdom, og har primært analyseret den sjældne form for SCLC modtagelig for kirurgi, som ikke repræsenterer den klassiske, bredt metastatisk SCLC set i daglig klinisk praksis [8] [9].

er behov for en anden tilgang til lægemiddelforskning for SCLC og kan ligge i minedrift tilgængelige databaser på narkotika følsomhed SCLC cellelinjer. Det er, som de fleste SCLC celler stammer fra metastatiske steder eller pleuraekssudat, kan de være repræsentative for omfattende sygdom SCLC og tilhørende narkotika sårbarheder. I denne forbindelse for nylig to omfattende narkotika-screening undersøgelser offentliggjort i

Natur,

kræftcellen Linje Encyclopedia (CCLE) [10] og Cancer Genome Project (CGP) [11] undersøgte stof følsomhed kræft cellelinjer, herunder lunge, og forsøgte at knytte disse til genomiske profiler. De genomiske profiler inkluderet DNA mutationsstatus, genekspression og kopiere nummer variation (CNV) data.

I den foreliggende undersøgelse har vi specifikt udpakkede data om SCLC cellelinjer fra disse to undersøgelser, og skitsere en bioinformatisk tilgang til at identificere nye lægemidler til behandling af SCLC hjælp polo-lignende kinase (PLK) hæmmere som et eksempel.

Resultater

i første omgang søgte vi et globalt syn på SCLC narkotika følsomhed i CCLE [10] og CGP [11 ] undersøgelser. Der var 53 og 31 SCLC celle testet for væksthæmning af 24 og 92 stoffer i disse undersøgelser, henholdsvis linjer. Resultaterne er vist i figur 1 (CGP) og S1 (CCLE) som boxplots. En tabel med de numeriske data for narkotika effektivitet samt vildskuddet cellelinjer, er også givet i tabel S1 (CGP) og S2 (CCLE). Denne grafiske analyse tillod os at identificere lægemidler, der var stort set effektiv mod de fleste SCLC celler. Vi definerede »effektive« stoffer som dem, der inducerer væksthæmning i de fleste celler ved lave doser (median IC

50≤1 uM), repræsenteret ved paclitaxel. “Ineffektiv ‘narkotika, repræsenteret ved erlotinib og sunitinib, gav ingen væksthæmning i de fleste SCLC celler (IC

50≥8 uM), selv om’ outliers ‘kan være til stede. »Selektive ‘narkotika, repræsenteret ved rapamycin, viste en lang boxplot og kan betragtes som effektive for kun en delmængde af SCLC-cellelinjer.

Der er 31 cellelinjer til småcellet lungekræft. De boxplots viser lægemidler opført på x-aksen og de tilsvarende IC

50 værdier (i uM) noteret på y-aksen. Den “loft” for narkotika effekt blev fastsat til 8 uM; hvis IC

50 af alle testede celler var over denne koncentration en enkelt linje ville vises øverst i grafen. Dette repræsenterer en ineffektiv lægemiddel. Hvis derimod alle testede celler var følsomme overfor et givet lægemiddel, ville en smal kasse og whisker plot vises nederst på grafen. Linjen inden for de enkelte kasser repræsenterer medianen IC

50 værdien af ​​alle testede celler og cirklerne repræsenterer “outlier” celler, hvis IC

50 værdier ikke falder inden for 25-75% fraktil af alle IC

50 værdier målt for at narkotika (repræsenteret ved kassen)

som vist i tabel 1, narkotika klassificeres som »effektive« for de fleste SCLC celler omfatter CGP-60.474, en CDK-inhibitor.; BI-2536 og GW-843682X begge PLK-hæmmere; bortezomib, en proteasominhibitor; og elesclomol, en HSP70 inhibitor. Desuden flere stoffer rettet mod PI3K-AKT-mTOR pathway falder inden for denne kategori, herunder A-443.654, temsirolimus og NVP-BEZ235. To lægemidler med en median IC

50 lige uden for en uM omfatter AZD-7762, en CHK-hæmmer; og JW-7-52-1, en mTOR-inhibitor. HSP90 (17-AAG) og HDAC (panobinostat) hæmmere kan også repræsentere »effektive« stoffer, selv om deres effektivitet varierede blandt de to undersøgelser. “Effektive ‘narkotika sandsynligvis bære den bedste translationel potentiale.

Gene-array data er blevet udbredt i kræftforskning at identificere Udtrykket» underskrifter “, der kan være enten prognostisk eller forprogrammeret tumor adfærd. Derfor undersøgte vi, hvis genekspression clustering kunne anvendes til at identificere undergrupper af lægemiddel-sensitive SCLC-cellelinier, især for lægemidler som viste et bredt virkningsområde mod SCLC celler i figur 1. Vi anvendte data fra CGP undersøgelsen, fordi den indeholdt den største mængde lægemiddel følsomhed data. Unsupervised konsensus gruppering af genekspression data viste, at tre klynger af SCLC celler var optimale (figur 2). Der var 1006 betydelige gener, definerede de genekspression undertyper (Kruskal-Wallis test p-værdi. 0,05, anført i tabel S3 Vi visualiseret så effekten af ​​genekspression grupperingen på lægemiddeleffektivitet anvendelse af en mosaik plot (fig 3). dette plot vi anvendte en farveskala, der delte lægemiddelfølsomhed i seks grupper. Drugs, opført på y-aksen, blev samlet ifølge målmolekyler. Celler, der er anført på x-aksen, blev grupperet i samme rækkefølge som den, der opnås ved uovervåget gruppering af deres genekspression. Der syntes ikke at være nogen korrelation af lægemiddel følsomhed over for genekspression klyngedannelse, men som lægemiddelfølsomhed syntes at være tilfældigt fordelt over alle cellelinier for ethvert givet lægemiddel. Denne grafisk analyse gjorde fremhæve flere udvalgte agenter med enestående bredt baseret effektivitet mod SCLC-cellelinjer. Disse stoffer indgår bortezomib, BI-2536 og GW-843682X, samt HSP hæmmer elesclomol og CDK-inhibitor CGP-60.474, dog med lavere effektivitet. Disse lægemidler er identiske med dem vist i tabel 1.

Unsupervised konsensus klyngedannelse blev udført under anvendelse alle 31 cellelinjer (kun 27 havde genekspression data til rådighed; 3 af dem er identiske og de gennemsnitlige værdier blev opnået for yderligere analyse ) og viste, at 3 klynger var optimal for dette datasæt. Med denne opgave, ikke-parametrisk envejs-ANOVA (Kruskal-Wallis test p-værdi 0,05) blev udført på disse 3 klynger og 1006 betydelige gener blev opnået. Den Heatmap blev genereret med disse betydelige gener.

Drug følsomhed var farvekodet ifølge legenden i bunden. Lægemidler er grupperet langs y-aksen i henhold til deres målmolekyle. Celler er anbragt langs x-aksen er identisk med deres genekspression clustering identificeret i figur 2.

Derefter bestemte vi, om CNV klyngedannelse kunne anvendes til at identificere undergrupper af lægemiddel-sensitive SCLC-cellelinier. Tre klynger blev igen identificeret ved hjælp af alle 426 interrogerede gener (figur 4); men der ikke syntes at være nogen sammenhæng mellem genekspression og CNV klyngedannelse. Omlægning af mosaik plottet i figur 3 af CNV klyngedannelse også afslørede ikke nogen synlige korrelationer (Figur S2). Taget sammen viser disse resultater, at lægemiddel-sensitive SCLC celler ikke klynge i undergrupper ved enten genekspression eller CNV. Vi besluttede derfor at anvende en farmakogenomisk fremgangsmåde til at karakterisere undergrupper af SCLC celler.

Unsupervised konsensus klyngedannelse blev udført under anvendelse alle 30 cellelinjer med 426 gen kopiantal, og 3 klynger viste sig at være optimalt for dette datasæt. Alle disse 426 gener blev anvendt til at generere Heatmap. CNV-data blev re-kodet efter følgende regel: 0-komplet tab; 1-delvist tab; 2-ingen ændring; 3~7-delvis gevinst; større eller lig med 8-komplet gevinst.

Vores analyser identificerede PLK hæmning at have lovende effekt og lidt klinisk forsøg aktivitet i SCLC. Derfor brugte vi PLK inhibering som et eksempel på, hvordan man bruger de CGP datasæt til at udvikle en genomisk profil SCLC lægemiddelfølsomhed. Først forsøgte vi at validere effekten af ​​PLK inhibitorer i SCLC. I disse Valideringsforsøg anvendte vi SCLC-cellelinier, samt inhibitorer, der var forskellige fra dem, der anvendes i de oprindelige undersøgelser for at fremhæve effekten af ​​disse nye terapeutiske midler. De SCLC anvendte cellelinjer var H1048, H1688, SW1271 og DMS454. PLK hæmmere inkluderet BI-6727 (volasertib) og ON-01.910 (rigosertib). I disse eksperimenter irinotecan tjente som en positiv kontrol, mens erlotinib tjente som en negativ kontrol. Resultaterne er vist i figur 5. Det er klart, at IC

50 værdier for de PLK inhibitorer i de fleste cellelinjer er mellem 10-100 nM, støtter vores hypotese om, at SCLC celler er stort set følsomme for PLK-inhibitorer.

Adhærente celler blev inkuberet med de angivne koncentrationer af lægemidler i 24 timer. Celledyrkningsmediet blev udskiftet og cellelevedygtighed blev målt ved en DNA-assay efter 48 timers inkubation. Hver koncentration lægemiddel blev analyseret ved anvendelse af fem gentagelser. Resultaterne er repræsentative for mindst 2 eksperimenter.

I første omgang søgte vi at identificere et gen signatur, der kan forudsige følsomhed over for PLK inhibitorer i patientkohorter, da ikke alle SCLC celler viste lige så stor følsomhed. Vi sammenlignede genekspression data for de fem mest følsomme SCLC celler (H82, H446, H526, COR L88, IST SL1) med, at der for de fem mindst følsomme SCLC cellelinier (DMS114, H64, DMS79, H2171, IST SL2); som defineret i den CGP deres BI-2536 IC

50 værdier. Vi identificerede en liste over 185 gener, der blev væsentligt forskelligt udtrykte mellem disse to grupper (nævnt i tabel S4). Disse 185 gener blev anvendt til at udføre ukontrollerede gruppering af alle de SCLC-cellelinier, hvilket resulterer i Heatmap vist i figur 6. Især de fem mindste (grøn top boks) og mest (rød top boks) følsomme cellelinjer grupperet ved modsatte ender af den heatmap mens alle de andre celler (gule kasser indikerer mellemliggende følsomhed og grå felter angiver ukendt følsomhed) grupperet i midten. Vi næste udført leave-one-out analyse af PLK gen signatur med de 26 tilgængelige cellelinjer. Fra denne analyse, vi genereret 26 heatmaps, hvor i hvert Heatmap følsomme og resistente celler forblev grupperet sammen undtagen i tre heatmaps; hvor en eller to følsomme cellelinier blev kategoriseret. Resistente celler altid klynge. Vi vurderer derfor, at denne PLK gen signatur er robust i kategorisere følsomme og resistente SCLC-cellelinjer.

De fem SCLC cellelinier demonstrerer mest (H2171, H64, IST-SL2, DMS-114, DMS-79 ) og mindst (IST-SL1, COR-L88, H526, H446, H82) resistens over for PLK inhibitor BI-2536 i CGP undersøgelse blev anvendt som standarder til at identificere et gen signatur for PLK følsomhed. Alle SCLC-cellelinier i CGP undersøgelse, der indeholdt genekspression data blev derefter underkastet ikke-overvåget klyngedannelse. Den Heatmap viser resultatet af denne analyse. De farvede kasser på toppen af ​​Heatmap angiver CGP BI-2536 følsomhed. Grøn = resistent celle, rød = følsom celle, gul = celle i mellemliggende, men kendt, følsomhed, grå = celle af uprøvede følsomhed, men med genekspression data.

For at validere at PLK genet signatur gør faktisk forudsige følsomhed over for PLK-hæmmere, vi bestemt effekten af ​​PLK inhibitor BI-6727 i en cellelinje, H1092, som havde genekspression data, men ingen PLK følsomhed data i CGP undersøgelsen, repræsenteret ved en grå boks i toppen af ​​figur 6. Som kontroller, brugte vi en resistent cellelinje, DMS79 (grøn boks), og to følsomme cellelinjer, H82 og H526 (røde kasser). Disse celler blev valgt, fordi de alle er vokset i suspension og kunne underkastes identiske narkotikabehandling protokoller. Resultaterne, der er vist i figur 7, viste, at H82 og H526 celler var følsomme over for PLK inhibitor BI-6727 mens DMS79 celler ikke var, svarende til resultaterne rapporteret for BI-2536. Endvidere demonstrerede, at H1092-celler, med ukendt PLK følsomhed, var for det meste resistente over BI-6727 som DMS79 celler, som forudsagt af Heatmap.

suspensionsceller blev kontinuerligt inkuberet med de angivne koncentrationer af lægemidler til 72 h, når cellelevedygtighed blev målt ved MTS-assayet. Hver koncentration lægemiddel blev analyseret ved anvendelse af fem gentagelser. Resultaterne er repræsentative for 2 forsøg.

Det var af interesse at bestemme, om PLK genet signatur var til stede i patientens tumorer og kan potentielt anvendes til at forudsige tumor følsomhed over for PLK-inhibitorer. Den største undersøgelse af SCLC tumor genekspression er at Rudin et al. [8], der analyserede 30 primære tumorer ved RNAseq. Vi udvindes derfor tæller data for 185 sonder til stede i vores PLK signatur (som repræsenterer 173 gener, kun 169 gener blev fundet og anvendt fra Rudin datasæt) og standard normaliseret til at skabe surrogat PLK genekspression arrays for disse tumorer. Denne normaliserede data blev derefter underkastet ikke-overvåget clustering at generere Heatmap vist i figur 8. Vi også inkluderet i denne analyse H82 SCLC cellelinie, som havde RNAseq data fra Rudin undersøgelsen og blev også bekræftet af os i figur 7 som er følsomme over for den PLK inhibitor BI-6727. Resultaterne demonstrerer to vigtige punkter: For det første kan identificeres undertyper af SCLC tumorer ved hjælp af PLK gen signatur, og for det andet, grupperet de H82 cellelinie data mellem en delmængde af otte primære tumorer. Taget sammen tyder disse resultater på, at PLK genet signatur frembragt ved anvendelse af SCLC cellelinje data kan være nyttig til at forudsige følsomheden af ​​specifikke tumorer til PLK inhibitorer.

RNAseq data fra Rudin et al. [8] blev transformeret til at tælle data. Data for gener, der omfattede den PLK genekspression signatur blev ekstraheret og anvendt under ikke-overvåget konsensus gruppering af SCLC tumorer og H82-cellelinjen. Den røde farvet boks på toppen af ​​Heatmap angiver placeringen af ​​H82-cellelinje, som var en CGP cellelinje valideret som PLK følsomme.

Endelig har vi brugt Circos plots [12], der er vist kondenseret i figur 9 og fuld-view i figur S3, at visualisere de genomiske forskelle mellem SCLC cellelinier følsomme og resistente til PLK inhibitor BI-2536. Bemærkelsesværdigt, de Circos plots påvise, at alle resistente celler besad nonsense eller rammeforskydningsmutationer i enten

TP53

eller

RB1 ​​

, og nogle gange begge gener, mens alle følsomme celler viste mutationer af ukendt protein betydning (intron og missense), typisk i kun én af disse gener. Alle undtagen en af ​​genmutationer var homozygot, hvilket indikerer, at resistente celler sandsynligvis ikke har nogen funktionel RB1 eller TP53 protein. Alle sensitive celler vise

MYC

(H82, H446),

MitCN

(H526, IST SL1) eller

MYCL Hotel (CORL88) forstærkning, mens kun én resistente cellelinje skærme

MYC

forstærkning (H2171). Der synes også at være lidt eller ingen CNV på X-kromosomet i følsomme celler i forhold til resistente celler, som typisk viser nogle CNV tab. Gener på kromosom 13 er generelt opreguleret i PLK sensitive celler og nedreguleres i PLK resistente celler, hvorimod gener lokaliseret på kromosom 19 generelt nedreguleres i PLK sensitive celler og opreguleres i PLK resistente celler. Tilsammen disse resultater tyder på, at genekspression, CNV og mutationsstatus kan alle bidrage til følsomheden af ​​SCLC celler til PLK hæmning.

Circos plots vises (venstre til højre, i anførte rækkefølge) for de fem mest følsom (H82, H446, H526, COR-L88, IST-SL1) og mest modstandsdygtige (DMS-114, H64, DMS-79, H2171, IST-SL2) SCLC celler til BI-2536 væksthæmning, som defineret i CGP studere. Den ydre sorte ring betegner kromosomet placering; den næste indre ring angiver ekspressionsniveauet for PLK signatur gener; og den indre mest ringen indikerer CNV. CNV-data blev re-kodet efter følgende regel: 0 komplet tab; 1 delvist tab; 2 ingen ændring; 3~7 delvis gevinst; større eller lig med 8 komplet gevinst. I centrum er mutationen status af gener (åben trekant: intron SNP, sort cirkel: missense SNP, sorte firkant: nonsens SNP, rød trekant: frame-shift indsættelse, grønne trekant: frame-shift tekst udgår). Alle mutationer var homozygote bortset rammen-shift indsættelse.

Diskussion

Små-cellet lungekræft er en sygdom i akut behov for nye lægemidler behandlingsformer. Desværre, den begrænsede adgang til tumorvæv hindrer erhvervelsen af ​​komplette genomiske krævede analyser for identifikation og validering af nye drugable mål i denne kræftform. Således behøver alternative lægemiddelforskning strategier, der skal udvikles, indtil vores forståelse af genomforskning kørsel SCLC kan begynde at tilnærme den, NSCLC, som nyder godt af omfattende analyser af store kohorter af patientens tumorer, såsom The Cancer Genome Atlas (TCGA).

i denne rapport har vi taget en bioinformatisk tilgang til lægemiddelforskning for SCLC af data mining to store drug screening studier i dyrkede cellelinjer, den CCLE [10] og CGP [11]. Som et modelsystem, SCLC cellelinjer bevarer genmutationstestene profiler (COSMIC) og kopiere nummer ændrer [13], [14] ligner humant SCLC. Derfor har vi ekstraheret og analyseret datasæt for SCLC cellelinjer for at identificere narkotika følsomheder er specifikke for denne sygdom, da dette ikke var hensigten med de oprindelige undersøgelser, som var at samle data på tværs af en lang række cellelinjer for at identificere genomisk determinanter for lægemiddelfølsomhed. Vi identificerede polo-lignende kinaser som attraktive molekylære mål med lidt strøm erfaring fra kliniske forsøg i SCLC. Væksthæmning af PLK-hæmmere blev valideret i vores undersøgelse, som omhandler bekymringer i en nylig rapport om inkonsistens i narkotika respons data i store drug screening undersøgelser [15]. Den translationelle potentiale PLK inhibitorer i behandling SCLC understøttes af vores påvisning af, at lægemidlet følsomhed profil af de SCLC-cellelinier afspejler, hvad der observeres klinisk til metastatiske SCLC-tumorer [16]. Det vil sige, de fleste celler var ekstremt følsomme overfor topoisomerase og mikrotubulus inhibitorer, kemoterapeutiske midler, der har aktivitet mod kemo-naive SCLC; derimod mange tyrosinkinasehæmmere var ineffektive.

CGP undersøgelsen også identificeret overfølsomhed overfor medicin, der havde en tendens til at klynge på tværs af alle cellelinjer (se Supplement tabel 1 med henvisning 11) og lægemiddelfølsomhed profil for SCLC celler, som vist i tabel 1, er meget lig klynge 4 i CGP undersøgelse [klynge 4 = GW-843682X (PLK1), BI-2536 (PLK1 /2/3), A-443.654 (Akt1 /2/3), epothilon B (mikrotubuli), CGP-60.474 (CDK1 /2/5/7/9), Paclitaxel (mikrotubuli) og MS-275 (HDAC)]. Mens det er i øjeblikket uklart, om disse narkotika klynger indikerer en fælles målrettet pathway (s), der fører til væksthæmning, kan disse klynger et praktisk udgangspunkt til at teste kombinatoriske lægemiddelterapier til synergistisk aktivitet i SCLC. Faktisk vores egen foreløbige data viser synergisme mellem PLK og CDK-inhibitorer.

Vi har udviklet en meget integreret analyse af PLK følsomhed i SCLC-cellelinjer, grafisk afbildet i figur 9 som Circos plots, der inkorporerer genekspression, CNV og gen mutation data. En analyse af denne dybde er aldrig tidligere blevet anvendt på SCLC, og viser, hvad der kan opnås afhøre en enkelt celle afstamning og narkotika klasse i CCLE og CGP datasæt. Endvidere vores konklusion, at PLK genet signatur for SCLC-cellelinier blev dispergeret blandt SCLC tumor model ekspressionsprofiler (figur 8) viser tydeligt, at disse celler bevarer tumor fænotyper. Funktioner i de Circos plots såsom den dobbelte mutation af både

TP53

og

RB1 ​​

i PLK resistente celler, såvel som den reciprokke udtryk for PLK signatur gener på kromosomerne 13 og 19, er let tilsyneladende og skal undersøges i større kohorter at bestemme deres individuelle bidrag til den samlede PLK-hæmmer følsomhed. Tilsammen denne type analyse kan hjælpe med at identificere opstrøms genomiske begivenheder, der korrelerer med downstream fænotyper såsom PLK følsomhed.

Det blev for nylig rapporteret, at mutationer i

PLK1

gen selv var hovedansvarlig erhvervet resistens over for BI2536 i en dyrket human coloncancer cellelinie [17]. Det er usandsynligt, at være en modstand mekanisme i SCLC-cellelinjer, fordi CCLE lister kun fire cellelinjer med et enkelt

PLK

mutation blandt alle fire PLK familiemedlemmer (PLK1-4) og 53 SCLC cellelinjer undersøgt. Ingen af ​​disse PLK muterede cellelinier blev inkluderet i vores undersøgelse. Vores PLK gen underskrift gælder dog indeholde gener på kromosomer typisk slettet (4Q, 13q) og forstærkede (19p) i SCLC [9], [13], [14], selv om vores Circos plots viser ingen indlysende sammenhæng mellem de to. Interessant kromosom XQ, som typisk ikke ses som en vigtig region af CNV i SCLC, var hjemsted for flere af de mest betydningsfulde differentielt udtrykte gener, der omfatter PLK genet signaturbase- alle var medlemmer af MAGE-A, eller melanoma- associerede antigen-A, underfamilie. Denne underfamilie af gener er lokaliseret på kromosom Xq28 og kun udtrykkes i testis kimceller og tumorceller [18]. Selv om deres biologiske funktion er uklar, de repræsenterer en klasse af tumorantigener, der bliver aktivt undersøgt som et mål for immunterapi [19], [20]. MAGE-A-generne blev opreguleret i PLK-følsomme cellelinier i forhold til PLK-ufølsomme cellelinier. Endvidere kan disse ekspressionsmønstre korrelerer med CNV, som følsomme celler demonstrerede lidt CNV på kromosom X, mens de fleste resistente celler viste nogle CNV tab. Vi tester i øjeblikket betydningen af ​​dette gen familie som en biomarkør for PLK følsomhed.

Under vores undersøgelse en rapport fra Sos et al. [21] blev offentliggjort i PNAS, som specifikt undersøgt kun SCLC-cellelinier (44 i alt) til lægemiddelfølsomhed. Af de 267 testede forbindelser i denne undersøgelse blev kun 13 også undersøgt i CCLE og /eller CGP undersøgelser. Interessant, når Sos et al. kiggede for narkotika følsomhed specifikt i

MYC

-amplified cellelinjer, de også fundet PLK inhibitor BI-2536 til at være aktiv, svarende til vores resultater, men ikke forfølge det yderligere. De viste også, at størstedelen af ​​celler følsomme over for Aurora kinase inhibitor VX-680 demonstreret

MYC

-amplification. Interessant, CGP også omfattede to Aurora kinaseinhibitorer (VX-680 og ZM-447.439) i deres undersøgelse; dog har den ikke finde nogen væsentlig gruppering af PLK med Aurora kinase hæmmere, hvilket indikerer nogen forbindelse mellem disse to klasser af inhibitorer når de analyseres i den almindelige befolkning af cancer cellelinjer.

I den foreliggende undersøgelse konsekvent identificeret vi tre undertyper af SCLC-cellelinjer hjælp uovervåget gruppering af enten genekspression eller CNV datasæt fra CGP eller CCLE (Figur S4 og tabel S3) undersøgelser. Bemærkelsesværdigt var der lidt overensstemmelse mellem disse to analyser, bortset fra at et stort flertal af celler samlet i en dominerende undertype, mens de resterende celler delt ulige mellem to mindre undertyper. Genekspression og CNV undertyper heller ikke ud for lægemiddelfølsomhed i almindelighed (se figur 3 og S2) eller PLK følsomhed i særdeleshed. Dette tyder på, at en samlet genomics tilgang, såsom Circos plot analyse, er forpligtet til at identificere kritiske determinanter for narkotika følsomhed og andre fænotyper i SCLC. Denne integrerede tilgang kan bidrage til at vælge SCLC patienter, som ville drage størst fordel af enkeltstofbehandling brug af stoffer såsom HDAC [22] og PLK [23] hæmmere, der stort set effektive tværs SCLC-cellelinjer, men demonstrerer begrænset aktivitet i kliniske forsøg.

der er taget

Andre unikke tilgange til at identificere nye og effektive behandlinger for SCLC. Jahchan et al. identificeret en overraskende følsomhed SCLC celler til tricykliske antidepressiva i et lægemiddel repositionering undersøgelse, der anvendte bioinformatik at finde lægemidler, der inducerede ændringer i genekspression modsat genekspressionsprofilen af ​​SCLC celler [24]. Omvendt fase proteinarrays (RPPA) blev anvendt til at identificere PARP1 og EZH2 som potentielle terapeutiske mål i SCLC [25]. I sidste ende er der et behov for at afsløre den underliggende biologi SCLC hvis vi ønsker at foretage forbedringer i behandlingen af ​​denne sygdom i lighed med NSCLC. Desværre har kun omkring halvtreds SCLC tumorer gennemgået omfattende genomisk analyse til dato-flertallet er fra primær, tidligt stadium sygdom [8], [9]. Derfor vil øjeblikkelig terapeutisk fremskridt på dette område afhænger opdagelse i modelsystemer, som den er skitseret her, efterfulgt af validering i patientkohorter.

Materialer og metoder

Cell kultur og væksthæmning undersøgelser

Alle celler blev opnået fra ATCC og dyrket i deres anbefalede medium. Celleproliferation blev bestemt kvantitativt ved fluorescerende DNA-analysen [26] for vedhængende celler eller MTS assay ved hjælp af CellTiter 96 vandige One Solution Cell Proliferation Assay Kit fra Promega Corp. (Fitchburg, WI) for suspension celler. Celler blev tilsat til en plade med 96 brønde i 100 pi komplet medium. Lægemiddelholdige medium blev tilsat i de angivne koncentrationer én dag efter podning. Irinotecan blev opnået fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), mens alle andre lægemidler blev opnået fra Selleck Chemicals (Houston, TX). Efter inkubering i tre dage ved 37 ° C blev assayet udført ved at følge producentens instruktioner. For DNA-assayet, blev fluorescens målt ved anvendelse 355/460 nm excitation /emission filtre mens absorbans for MTS-assayet blev målt ved 490 nm. Begge assays blev målt med en 96-brønds plade-læser. Hver eksperimentel betingelse blev analyseret under anvendelse af fem gentagelser. Lægemiddelholdige medium blev fjernet fra adhærente celler efter 24 timers inkubation og erstattet med 100 pi komplet medium, mens suspensionsceller blev dyrket i den kontinuerte tilstedeværelse af lægemiddel i 72 timer.

Datasæt

Den offentligt tilgængelige CCLE og CGP narkotika følsomhed (IC

50), genekspression, CNV, og mutation data blev hentet fra https://broadinstitute.org/ccle (CCLE) og https://cancerrxgene.org (CGP) [10], [11]. De RNAseq data opnået i den undersøgelse, som Rudin et al. [8] blev hentet fra den europæiske Genome database. Alle data manipulation og statistiske analyser blev udført ved hjælp af SAS-version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC) eller R 2.15.3 (https://www.r-project.org/).

IC

50 dataanalyse

i SCLC kun, 24 lægemidler og 53 cellelinier blev inkluderet i CCLE, mens 92 lægemidler og 31 cellelinier blev inkluderet i CGP. Alle IC

50 større end 8 pM i CGP blev tærsklingsbehandlet ved 8 uM. Boxplots blev trukket for IC

50 fra de to datasæt henholdsvis bruger R (https://www.r-project.org/). Mosaik parceller blev trukket ved hjælp af proc sgrender i SAS-version 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Gene udtryk dataanalyse

Normalisering af genekspression data (Affymetrix U133 Plus 2,0 for CCLE , Affymetrix U133A for CGP) involverede fire trin: 1) rå data blev normaliseret via den robuste multi array gennemsnit (RMA) metode; 2) prober uden et gen navn blev fjernet; 3) genniveau data blev opnået ved at tage gennemsnittet sonden værdi inden hvert gen og 4) genniveau data blev derefter standard normaliseret ved gen. For genekspression data, den CCLE inkluderet 51 cellelinjer, mens CGP inkluderet 30 cellelinjer, blandt hvilke tre cellelinjer havde dobbeltbestemmelser. Gennemsnittet af dubletter genererede 27 unikke cellelinjer til CGP. Unsupervised konsensus klyngedannelse blev udført på de normaliserede gen niveau data med R-pakken “Konsensus Cluster Plus”;