PLoS ONE: Exome Sequencing Identificerer Tidlig Gastric Carcinoma som et tidligt tidspunkt i Advanced Gastrisk Cancer

Abstrakt

Gastric karcinom er en af ​​de hyppigste årsager til kræft dødelighed på verdensplan. Tidlig påvisning og behandling fører til en fremragende prognose hos patienter med tidlig mavekræft (EGC), mens prognosen for patienter med fremskreden mavekræft (AGC) forbliver fattige. Det er uklart, om egcs og AGC-kredsløb er adskilte enheder, eller om egcs er begyndelsen faser af AGC-kredsløb. Vi udførte hele exome sekventering af fire prøver fra patienter med EGC og sammenlignet resultaterne med dem fra AGC-kredsløb. I begge egcs og AGC-kredsløb, blev i alt 268 gener almindeligt muteret og uafhængige mutationer blev desuden findes i egcs (516 gener) og AGC-kredsløb (3104 gener). En højere frekvens af C G overgange blev observeret i tarm-typen i forhold til diffus-type karcinomer (

P

= 0,010).

DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5

UNC5C

gener er gentagne muteret i egcs og kan være involveret i tidlig carcinogenese

Henvisning:. Kang G , Hwang WC, Do IG, Wang K, Kang SY, Lee J, et al. (2013) Exome Sequencing Identificerer Tidlig Gastric Carcinoma som et tidligt tidspunkt i Advanced Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (12): e82770. doi: 10,1371 /journal.pone.0082770

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Modtaget: Juli 17, 2013; Accepteret: Oktober 27, 2013; Udgivet: 23 december, 2013 |

Copyright: © 2013 Kang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Grundforskningsfonden Korea (2012-P4KR 003) og en Samsung Biomedical Research Institute tilskud (# SBRI-SP1B20111). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. KW er ansat af Pfizer Inc. Men dette ikke ændre forfatterens tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes andre konkurrerende interesser.

Introduktion

Gastric carcinom (GC) er en heterogen sygdom med flere miljømæssige ætiologier, alternative veje for carcinogenese og ingen kendte højfrekvente onkogen forstyrrelse [1], [2], [3]. Den Lauren klassifikation har vist sig nyttig i en vurdering af den naturlige historie af GC, især med hensyn til incidens tendenser, clinicopathologic korrelationer og ætiologiske forstadier [4]. Lauren klassificeret gastrisk adenocarcinom i tarm og diffus efter morfologiske træk af tumoren [4], [5], [6]. Intestinal-type carcinomer menes at opstå sekundært til kronisk atrofisk gastritis forbundet med

H. pylori

og tarm metaplasi [7]. Diffus-typen GC’er er ikke forbundet med intestinal metaplasi og kan stamme fra encellede mutationer inden for normale gastriske kirtler [4], [8], [9].

GC er en af ​​de hyppigste årsager til kræft- mortalitet i hele verden. resultater tidlig påvisning og behandling i en fremragende prognose for patienter med tidlig mavekræft (EGC), mens prognosen for patienter med fremskreden mavekræft (AGC) stadig dårlig. Men det er uklart, om egcs og AGC-kredsløb er adskilte enheder eller er de samme tumor forløber fra tidligt til fremskredne stadier [10]. De molekylære signaturer adskiller EGC fra AGC er vigtige for at hjælpe identifikationen af ​​nye prognostiske markører og potentielle terapeutiske mål.

For nylig exome sekventering i 22 [11] og 15 [12] AGC prøver viste hyppige inaktiverende mutationer i celleadhæsion og chromatin-remodeling gener, og de genetiske ændringer forskelligt for undergrupper stratificeret efter Epstein-Barr virus (EBV) eller

H. pylori

infektion og mikrosatellit instabilitet (MSI) status. For yderligere at udforske de genetiske ændringer underliggende GCS, vi udførte hele exome sekventering i fire matchede par af EGC og normalt væv, og sammenlignet resultaterne med dem fra AGC-kredsløb.

Materialer og metoder

Prøveforberedelse

Tumor og ikke neoplastiske gastriske væv blev indsamlet fra gastrektomi prøver. Den foreliggende undersøgelse blev gennemført efter godkendelsen fra Institutional Review Board Samsung Medical Center, og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke før operation. For tumorprøver, masserne var 4 cm på grov inspektion, og overfladen slimhinde fra hver tumor blev indkøbt. Efter indlejring i OCT medium blev vævet skåret og H 90% tumor indhold blev udvalgt til DNA-ekstraktion med en Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) og behandlet med RNase A for at fjerne resterende RNA. DNA blev også ekstraheret fra parret upåvirket gastrisk væv, som blev opnået fjernt fra tumorstedet og bekræftet at være tumor-fri. MSI blev analyseret med fem NIC markører som tidligere beskrevet [13]. Tilstedeværelsen af ​​EBV blev påvist ved EBV-kodet RNA

in situ

hybridisering som tidligere beskrevet, og kun tilfælde med stærkt signal inden for næsten alle de tumor cellekerner blev betragtet som positive [14]. Yderligere oplysninger om de EGC prøver er angivet i tabel 1.

Exome berigelse og sekventering

Exome berigelse (SureSelect Menneskelig All Exon Kit, Agilent Technologies) og Illumina sekventering biblioteker blev fremstillet i overensstemmelse til producentens anvisninger. Kort beskrevet blev 3 pg genomisk DNA blev klippet med Covaris S2 systemet; DNA-fragmenterne blev ultimo repareret, udvidet med et “A” base på 3′-enden, ligeret med parret-end-adaptere og forstærkes (fire cyklusser). Exome-holdige adaptorligerede biblioteker blev hybridiseret i 24 timer med biotinyleret oligo-RNA lokkemad og beriget med streptavidin-konjugeret magnetiske perler. De endelige biblioteker blev yderligere forstærket gennem 11 PCR-cykler og udsat for Illumina sekventering på en bane af HiSeq 2000 sequencer med en målrettet indsats størrelse på ~180 bp. Alle sekventering blev kørt med parrede-end 65-bp læser og blev udført ifølge Ilumina standard protokol. I gennemsnit ~136.3 millioner renhed-filtreret læser blev genereret for hver prøve. Den gennemsnitlige procentdel af duplikat læser skyldes PCR og optiske artefakter var 0% i vores datasæt, og ~123.7 mio entydigt kortlagt læsninger blev opnået for hver prøve. I gennemsnit 69,1% af læser i hver prøve havde mindst 50% overlappe med målregion ± 100 bp i SureSelect hele exome agn bibliotek. De målrettede regioner i hver prøve blev sekventeret til en gennemsnitlig dybde på 113,7 ×, med ~98.8% af de målrettede områder dækket ≥1 ×, ~94.3% ≥10 ×, ~82.4% ≥30 ×, ~70.8% ≥50 ×, ~66.4% ≥60 ×, ~62.2% ≥70 ×, ~58.2% ≥80 ×, ~54.4% ≥90 × og ~50.8% ≥100 ×. Detaljerede oversigter over rådata kvalitet er beskrevet i tabel S1. Til sammenligning er den samme algoritme (SMART), der anvendes i den tidligere datasæt af AGC prøver [11], blev anvendt til disse data til at identificere somatiske enkelt nukleotid variationer og indsættelser /sletninger (indels) ombygninger fra kort- læse sekventering data. Datasættet er blevet deponeret i den europæiske Nucleotide Archive og kan tilgås på https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB 4850.

Mutationer opdaget af exome sekventering blev yderligere valideret ved PCR og Sanger-sekventering. Kort fortalt primere designet ved hjælp af Primer3 software (https://frodo.wi.mit.edu), og sekvenserne er anført i tabel S3. De PCR-amplificerede produkter blev dernæst sekventeret under anvendelse af en BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit og et ABI 3700 automatisk sekventeringsapparat (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Resultater Salg

Somatic ændringer i egcs

i alt blev 2.389 somatiske mutationer identificeret i fire EGC prøver, hvoraf 1117 fandt sted i kodende regioner eller væsentlige splejsningssteder (627 missense, 32 nonsens, 10 afgørende splejsningssite, 169 indels og 279 synonyme) (figur 1 og tabel 2 og S2). En GC med MSI-høj havde 727 ikke-stumme mutationer herunder misforhold reparation gener (

MSH6

MSH3-

), mens de tre mikrosatellit stabile (MSS) prøver havde et gennemsnit på 37, en forskel på omkring 20 gange. De ikke-synonyme-til-synonymt forhold i MSS kræftformer tendens til at være højere end den MSI-høje cancer, men forskellen var ikke statistisk signifikant. C T og G A overgange var den mest almindelige mutation (61%) i egcs, og der var ingen signifikant forskel i enkelte baseparændringer mellem MSI-høj og MSS cancere (figur 2A og Tabel S4). Af 784 gener, der huser ikke-tavse mutationer, 13 blev muteret i to eller flere prøver. Disse omfattede gener vides at være involveret i gastrisk carcinogenese (

TP53

) og rapporteret i Katalog over somatiske mutationer i Cancer (COSMIC), der skal muteret i GC’er (

DYRK3, MCM10, PCDH17

UNC5C

) (tabel 3). Af de udvalgte til validering gener,

PCDH17

mutation blev sandsynligvis ikke valideret af Sanger-metoden på grund af lave frekvenser af mutant allel (tabel S3). Interessant nok i en diffus type EGC med MSI-høj, en

EGFR

(c.2224G A, p.V742I). Blev mutation identificeret

Stjernen (*) angiver resultater, på samme platform.

Stjernen (*) angiver signifikant forskel mellem tarm- og diffus-typen i alle mikrosatellitmarkørerne stabile kræftformer (

P

= 0,010).

sammenligning mellem EGC og AGC

til sammenligning af vores resultater på EGC med dem i AGC-kredsløb, blev brugt to nyligt offentliggjorte hele exome sekventering oplysninger [11], [12] . Wang

et al

. opdaget 164 ikke-lydløs og 48 synonyme mutationer i gennemsnit i 22 AGC prøver med 116 × gennemsnitlig dækning dybde [11]. Zang

et al

. registreres i gennemsnit 50 ikke-lydløs og 16 synonyme somatiske mutationer i 15 AGC prøver med 96 × gennemsnitlig dækning dybde [12]. I direkte sammenligning mellem de fire egcs og 37 AGC-kredsløb, var der ingen signifikant forskel i antallet af mutation type (figur 1). De enkelte ændringer basepar i egcs svarede til en tidligere rapport fra Wang

et al

. [11], der viser en tydeligt højere antal C T og G A overgange i både MSS og MSI-høje tumorer (Figur 2A og Tabel S4). Interessant, C G overgange var mere almindelige i tarm-type end i diffust-type GCS på tværs af alle MSS prøver, som omfattede tre egcs og 18 AGC-kredsløb (Wilcoxon rank sum test,

P

= 0,010) (figur 2B og tabel S4).

i 37 AGC og 4 EGC prøver, blev påvist ikke-tavse mutationer (missense, nonsense, afgørende splejsningssite og indels) i 3.372 og 784 gener, hhv. I begge egcs og AGC-kredsløb, blev 268 gener almindeligt muteret;

BCORL1, LRP2, LRP12, MACF1, PRKCI

TP53

gener muteret i mindst to EGC prøver, og

ACVR2A, CCNL1, CTNNB1, FMN2, PTEN, RPL22

TTN

gener, såvel som andre, var signifikant associeret med AGC-kredsløb med en falsk opdagelse på 0,2 [11], [12] (Figur 3). Funktionel anmærkning analyse ved hjælp DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov) at undersøge generne fundne overlapning mellem de to prøvesæt viste, at de væsentligt beriget vilkår inkluderet actin binding, cytoskelettet, celle projektion og celle-celle krydset (tabel . S5)

Understreget og fed skrift angiver de gener med protein-ændre mutationer i mindst to tidlige kræft prøver og de udvalgte gener med højere end forventet mutationsrater i avancerede gastrisk kræft (falsk opdagelse sats 0,2 ), henholdsvis.

diskussion

Selvom hele exome sekventering er blevet rapporteret for 37 AGC prøver [11], [12], der ikke har været en sådan undersøgelse til evaluering tidlig carcinogenese på det genetiske niveau. At udforske det komplette repertoire af somatiske mutationer i egcs, vi udførte hel exome sekventering af fire parrede EGC prøver, og fundet tydelige og fælles genetiske signaturer mellem egcs og AGC-kredsløb, der kan identificere gener involveret i tidlig carcinogenese og efterfølgende progression.

Epiteliale kræftformer har ofte variabel mutation spektre peger på bestemte mutagene stimuli [15], [16]. For eksempel, høje A C og C blev observeret T overgange i esophageal adenokarcinomer og sol-eksponerede melanomer henholdsvis, hvilket tyder på, at disse mutationer kan henføres til gastroøsofageal reflux og ultraviolet eksponering [15], [17]. En tidligere genom-dækkende sekventering undersøgelse i to gastriske adenokarcinomer viste hyppige C A og T En ændringer sammenlignet med normale genomer [18]. Her fandt vi hyppige C G overgange i tarm-type carcinomer i forhold til diffus-type GCS efter udelukkelse af MSI-høje GC’er. Vores unikke observation garanterer fremtidige undersøgelser for at definere specifikke ætiologi, der potentielt bidrager til forståelse af de komplekse og dårligt forståede molekylære veje for tarm-typen GCS.

Gennem sammenlignende analyse identificerede vi 268 overlappende gener med ikke-tavse mutationer delte af både egcs og AGC-kredsløb (figur 3). Omkring en tredjedel af de ikke-stumme mutationer i egcs deles med AGC-kredsløb og 8% af de ikke-tavse mutationer findes i AGC-kredsløb deles med egcs. En tidligere undersøgelse med genekspression analyse viste, at størstedelen af ​​ændringer forbundet med egcs fastholdes i AGC-kredsløb, og yderligere ekspressionsvektorer ændringer markerer overgangen fra EGC til AGC [10]. Samlet indikerer disse resultater, at EGC repræsenterer et tidligt molekylær fase af AGC og de almindeligt muterede gener spiller en vigtig rolle i progressionen fra EGC til AGC. Vi bekræftede, at

TP53

er den hyppigst muterede gen i GC’ers, med

TP53

mutationer findes i halvdelen af ​​EGC og to tredjedele af AGC prøver. Blandt de overlappende gener,

AKAP9, CAMTA1, COL1A1, CTNNB1, KDM5A

og

RPL22

blev kommenteret som onkogener, mens

ATM, FBXW7, MSH6, NF1, PTEN, SETD2

og

TP53

var tumorsuppressorgener ved Sanger Gene Census (https://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/census). Af kræft Census generne, vi først identificeret en

EGFR

mutation (c.2224G A, p.V742I) i en diffus type EGC med MSI-høj. I en nylig undersøgelse af 63 MSI-høj GCS,

EGFR

mutation ikke blev påvist ved direkte sekventering af kinasedomænet (exonerne 18, 19, 20 og 21) [19]. Den samme V742I mutation er rapporteret hos en patient med endometriecancer og i en gliom-cellelinje [20], [21]. Den kliniske betydning af denne sjældne mutation skal valideres i den nærmeste fremtid.

Selvom forekomsten af ​​tilbagevendende mutationer i egcs var forholdsvis lav, 13 gener blev muteret i mindst to prøver, og havde meget få synonym, introniske og /eller utranslaterede mutationer. Blandt disse 13 gener, kan

DYRK3, GPR116, MCM10, PCDH17, PCDHB1, RDH5

UNC5C

være specifik for tidligt GC, hvilket tyder på en mulig rolle i den tidlige carcinogenese. I vores serie,

PCDH17

mutationer forekom i tarm-typen GCS med MSS, herunder en EBV-positive prøve. Tidligere globale genomiske analyser af kolorektale og pancreascancer afslørede også missense mutationer i nogle medlemmer af

PCDH

(protocadherin) underfamilier [22], [23]. Imidlertid blev de fundne i vore egcs ved Illumina sekventering mutationer ikke bekræftet af Sanger sekventering, sandsynligvis fordi de muterede allelfrekvenserne var meget lave.

UNC5C

tilhører den funktionelle afhængighed receptor familie, hvis medlemmer deler evnen til at inducere apoptose i fravær af deres ligander [24], [25]. Afvigende methylering af dette gen er blevet rapporteret i løbet af gastrisk carcinogenese, og denne methylering forsvandt i meget avancerede GCS [26]. For de resterende gener, deres funktionelle relevans i GC fortsat uklar.

Tab af funktion i celleadhæsionsmolekyler øger evnen af ​​tumorceller at invadere omgivende væv, og dysfunktion i kromatin-remodeling kompleks fremmer kromosomal ustabilitet, der driver tumorigenese [27]. Ingen af ​​vores EGC prøver havde protein-ændre mutationer af kromatin-remodeling gener findes i AGC-kredsløb, såsom

ARID1A, MLL3, PBRM1

MBD2

[11], [12], hvilket tyder kromatin ændringen indtræder sent i udviklingen af ​​GC.

Samlet set vores undersøgelse tyder på, at EGC og AGC deler fælles somatiske mutationer, og AGC er forbundet med yderligere kumulative genetiske ændringer i celleadhæsion og kromatin-remodeling gener. De molekylære signaturer adskiller EGC fra AGC er vigtige for at identificere nye prognostiske markører og potentielle terapeutiske mål. Større undersøgelser er nødvendige for at bestemme den biologiske betydning af de gentagne muterede gener i egcs.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Oversigt over hele exome sekventering statistik for fire par gastrisk prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s001

(PDF)

tabel S2.

Liste over alle somatiske mutationer i tidlige gastrisk kræft identificeret ved exome sekventering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s002

(XLS)

tabel S3.

Primere til Sanger sekventering, allel frekvens og valideringsresultater

doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s003

(PDF)

Tabel S4.

Sammenligning af somatisk punktmutation spektre i gastrisk kræft ved tumor stat og histologiske type

doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s004

(PDF)

tabel S5.

DAVID pathway analyse af de 268 overlappende gener mellem tidlige og fremskredne gastrisk kræft

doi:. 10,1371 /journal.pone.0082770.s005

(XLS)