PLoS ONE: Et alsidigt bioreaktor for Dynamic Suspension Cell Culture. Ansøgning til Kultur af kræftcellen Spheroids

Abstrakt

En alsidig bioreaktor egnet til dynamiske undervogn cellekultur under afstemmelige shear stress betingelser er blevet udviklet og foreløbigt testet dyrkning kræftcelle sfæroider. Med vedtagelsen af ​​enkle teknologiske løsninger og undgå roterende komponenter, bioreaktoren udnytter de laminare hydrodynamik oprettelse inden for kulturen kammer muliggør dynamisk celle suspension i et miljø, der er gunstigt for massetransport, under en lang række afstemmelige shear stress betingelser. Den designfasen af ​​enheden er blevet støttet af multifysik modellering og har givet en omfattende analyse af de operative principper bioreaktoren. Desuden er et forklarende eksempel heri præsenteret med multifysiske simuleringer bruges til at indstille de korrekte bioreaktor driftsbetingelser for foreløbig

in vitro

biologiske test på en human lunge carcinom cellelinje. De biologiske resultater viser, at ultralav shear dynamiske undervogn tilvejebragt af anordningen er til gavn for dyrkning cancercellelinjer sfæroider. I forhold til den statiske kontrol suspension, dynamisk cellesuspension bevarer morfologiske træk, fremmer intercellulær forbindelse, øger klumpformet størrelse (2,4 gange stigning) og antal cykling celler (1,58-gange stigning), og reducerer beskadigelsen af ​​dobbeltstrenget DNA (1,5 gange reduktion). Det forudses, at alsidigheden i denne bioreaktor kan tillade efterforskning og udbygning af forskellige celletyper i fremtiden

Henvisning:. Massai D, Isu G, Madeddu D, Cerino G, Falco A, Frati C, et al . (2016) Et alsidigt bioreaktor for Dynamic Suspension Cell Culture. Ansøgning til kulturen i Cancer Cell Sfæroider. PLoS ONE 11 (5): e0154610. doi: 10,1371 /journal.pone.0154610

Redaktør: Maurizio Pesce, Centro Cardiologico Monzino, ITALIEN

Modtaget: December 23, 2015; Accepteret: April 15, 2016; Udgivet: Maj 4, 2016

Copyright: © 2016 Massai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering: Dette arbejde fik delvis finansiering fra (1) den Europæiske FP7 Samarbejde – Collaborative Project “Bioaktive meget porøse og injicerbare Stilladser Controlling Stem Cell Rekruttering, proliferation og differentiering. og Aktivering Angiogenese for Kardiovaskulære Engineered Væv “- BIOSCENT, 2009-2013 (ID 214.539), og (2) det nationale italienske PRIN 2012 Projekt” En Bioprocess for Optimering af 3D Cardiosphere-baserede konstruktioner for Cardiac regenerativ medicin “- BEAT3DHEART 2014 -2017 (20123E8FH4), samt yderligere finansiering internt på Politecnico di Torino og Università degli Studi di Parma. Bioexpansys Srl ydet finansiel støtte i form af løn for forfatterens GFDL og forskning materialer, men havde ingen yderligere rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller forfatterne artikuleres i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: Giuseppe Falvo D’Urso Labate tjener som CEO for Bioexpansys Srl, distributøren af ​​den dynamiske kultur-enheden. Ingen af ​​forfatterne har modtaget honorarer eller rådgivning gebyr skriftligt dette manuskript. Ingen andre potentielle interessekonflikter er relevante for denne artikel blev rapporteret. Hverken Bioexpansys Srl eller nogen anden privat virksomhed har haft nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Betingelserne for Dr. Falvo D’Urso Labate eller andre forfattere ansættelse ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politik om datadeling eller materialer.

Introduktion

produktion i stor skala af celler er et obligatorisk skridt til at etablere økonomisk rentable in vitro eksperimentelle modeller for grundforskning, sygdom modellering og test af lægemidler, og helt sikkert oversætte vævsteknologiske og regenerativ medicin strategier til den kliniske praksis til terapeutiske anvendelser. Men skalerbarhed og standardisering i cellulære fremstillingsprocesser er stadig store udfordringer. Især når et stort antal celler (10

10-10

12) er påkrævet, konventionelle todimensionale (2D) kultur strategier, primært baseret på manuel, ekstremt rum- og arbejdskraftintensive indgreb, er praktisk taget og økonomisk uholdbart [1-5].

i en optrapning perspektiv og inspireret af fremstillingsprocesser terapi i biofarmaceutiske industri [6,7], tre-dimensionelle (3D) suspension kultur har vist sig at være et fordelagtigt alternativ til monolag teknikker til storstilet udvidelse af celler [4,5,8,9]. I detaljer, er ofte blevet vedtaget suspension metoder: (1) for skalerbar og kontrolleret ekspansion af stamceller [10-15] og cancerceller [16-18]; (2) for at lede stamcelledifferentiering [13,19-22]; (3) til fremstilling af cellulære sfæroider og væv-lignende konstruktioner [23-25]. Tilvejebringelsen af ​​en 3D-suspension kultur miljø, efterligne mikromiljø af den cellulære niche, har vist sig at være gavnlig, fremme celle overlevelse og fastholde celle funktionelle egenskaber

in vitro

[9,26,27]. Desuden, når suspension opnås ved dynamisk blanding af dyrkningsmediet, (1) dannelsen af ​​gradienter i fx temperatur, pH, opløst oxygen, næringsstoffer /metabolitter forhindres, (2) transport af ilt og næringsstoffer øges, og (3) sedimentation af dyrkede celler /konstruktioner undgås, går dermed videre end de iboende begrænsninger af statiske dyrkningssystemer [4,7,9,28].

i dag, dynamisk affjedring kultur for skalerbar produktion og differentiering af celler er for det meste udført af tankreaktoren og roterende bioreaktorer [2,4]. Sådanne enheder er designet til at give en 3D homogen kultur miljø og for at muliggøre overvågning og kontrol af kultur parametre, hvilket fører til mere reproducerbare, robuste og omkostningseffektive processer [5, 29,30,31]. Men de fleste af disse bioreaktorer stadig lider kritiske spørgsmål, begrænser opskalering og standardisering af de ekspansion bioprocesser. Om tankreaktorer bioreaktorer, kan deres effektivitet af (1) kollisioner af cellerne med pumpehjulet og (2) indtræden af ​​turbulent strømning, der både kan inducere ikke-fysiologiske mekanisk og hydrodynamiske-forskydningsspændinger på cellerne og føre til celleskader. Desuden kan disse ugunstige betingelser påvirker celle vækst og metabolisme, forstyrre stamceller pluripotens, og begrænse effektiviteten og reproducerbarheden af ​​kulturen proces [4,9,28,30,32,33]. Roterende bioreaktorer generere en lav forskydningsspænding kultur miljø, gør det muligt at delvist at overvinde begrænsningerne ved tankreaktorer enheder. Men kompleksiteten af ​​de teknologiske løsninger, der er vedtaget for rotation gør, disse enheder ikke let skalerbare og uegnede til kontinuerlig medium udskiftning og real-time overvågning [4].

Vi præsenterer her en alsidig bioreaktor egnet til indstillelig forskydningsspænding dynamisk suspension cellekultur. I detaljer, ved at vedtage enkle teknologiske løsninger og undgå roterende komponenter, den foreslåede bioreaktor muliggør cellesuspension ved at sikre en laminar blanding flow regime, hvilket garanterer ilt og næringsstoffer transport og i sidste ende homogen kultur miljø under en bred vifte af shear stress betingelser.

for at gå ud over den eksperimentelle trial-and-error tilgang og for at nå en dybere forståelse af de fluid dynamik udvikler inde i kultur miljø [34,35], designfasen af ​​enheden er blevet understøttet af i silico multifysik modellering, der giver en omfattende analyse af de operative principper bioreaktoren. Desuden fund fra multifysiske simuleringer tjente som kriterier for at indstille de korrekte bioreaktor driftsbetingelser for foreløbige

in vitro

tests. Især blev denne første undersøgelse fokuserede på at vurdere egnetheden af ​​bioreaktoren som ultralav forskydningsspænding dynamisk affjedring enhed til kræftcellen klumpformet kultur. Til dette formål blev den Calu-3 humane lunge carcinom cellelinje udsat for ultralav forskydning dynamiske undervogn fra enheden. De biologiske resultater viser, at denne fremgangsmåde bevarer cancercellevækst

in vitro

, herunder kugleformet dannelse, og foreslå egnetheden af ​​den foreslåede bioreaktor til undersøgelse på celle funktionelle egenskaber og til ekspansion af forskellige celletyper.

Materialer og metoder

dynamisk suspension bioreaktor

designet af enheden (fig 1A) blev drevet af to vigtigste krav: (1) at give dynamisk affjedring kultur med korrekt blanding; (2) for at sikre en afstemmelig ultralav til moderat forskydningsspænding kultur miljø, indstillelig på grundlag af kultur krav ved tilpasse driftsbetingelser. Disse mål blev opnået kombinere de ejendommelige geometriske træk ved bioreaktoren kultur kammer med den kontinuerlige recirkulation af dyrkningsmediet sikres ved et lukket kredsløb recirkulation kredsløb, undgå brug af skovlhjul og /eller roterende komponenter. Denne kombination fremmer etableringen af ​​blomstrende hvirvler i kultur kammer, der opretholder celler /konstruktioner i dynamiske undervogn, minimere deres sedimentation.

(A) Skematisk drage af bioreaktoren viser de interne komponenter og dens aksiale symmetri (rød linjer). (B) Billede af bioreaktoren. (C) Skematisk gengivelse af opsætningen af ​​bioreaktoren forbundet til lukket sløjfe recirkulationskredsløbet og anbragt i inkubatoren.

Bioreaktoren (Fig 1B, ydre mål = 95 mm x 70 mm x 70 mm) består af: en AISI 316L rustfrit stål; et polycarbonat kultur kammer til indkapsling celler /konstruktioner (kammer volumen = 75 ml); et polycarbonat låg. Krumningen og formen af ​​den indvendige væg af dyrkningskammeret blev udformet og optimeret til generering af blomstrende hvirvler i præparatbehandling suspension (som beskrevet detaljeret i det følgende). Suspenderede celler /konstruktioner er afgrænset af kulturen kammeret ved hjælp af tilstedeværelsen af ​​(1) en AISI 316L rustfrit stål envejs kontraventil (som forhindrer tilbagestrømning og garanterer en symmetrisk strømning indløb), og (2) et dyrkningsmedium-permeabelt filter ( Durapore

®, MerckMillipore, Tyskland), som forhindrer utilsigtede output af celler. Bioreaktoren er del af et lukket sløjfekredsløb til recirkulation af iltet dyrkningsmedium (Fig 1C). Sådan recirkulation kredsløb er sammensat af et medium reservoir, oxygen-permeabel peroxid-hærdet silikone slange (Masterflex L /S

®, Cole-Parmer, IL, USA) med lynkoblingssystem koblinger, og en peristaltisk pumpe (Masterflex L /S

®, Cole-Parmer, IL, USA), til et samlet arbejdsvolumen på ca. 200 ml. For at sikre tilstrækkelig forsyning af ilt inden for kulturen kammeret blev recirkulation kredsløb størrelse ved hjælp af en analytisk ilt massebalance model i overensstemmelse med Orr et al. [36].

fungerende princip i bioreaktoren er baseret på den kontinuerlige recirkulation af dyrkningsmediet inde kulturen kammer under laminar strømning, opnået ved modulering af recirkulationskredsløbet strømningshastighed den, for at frembringe fra ultralav til moderat forskydning stress dynamiske undervogn betingelser. I detaljer mediet strømmer gennem kontraventilen, drevet af den peristaltiske pumpe mod det statiske trykgradient, og gennemstrømmer dyrkningskammeret. Successivt passerer mediet gennem filteret og strømmer ud fra låget, flytte tilbage til reservoiret i en kontinuerlig lukket sløjfe proces. Dannelsen af ​​blomstrende hvirvler inde i kultur kammer tillader den dynamiske suspension af de dyrkede celler /konstruktioner (S1 Film).

Computational modeller

En beregningsmæssige multifysik tilgang støttede design og optimering faser af enheden, muliggør identifikation af (1) den optimale geometri kultur kammer, og (2) de driftsbetingelser for dynamisk affjedring cellekultur under definerede shear stress værdier. En massiv antal simulationer blev udført variere både celle /konstruere dimensioner (i form af deres diameter) og højt fortyndede celleinokulering tætheder, for at undersøge følsomheden af ​​fluidstrømmen til disse kultur parametre i kammervolumen.

Teknisk set drage fordel af den aksiale symmetri af indretningen (fig 1A), blev et sæt aksesymmetriske tidsafhængige numeriske simuleringer udføres ved anvendelse af en tilpasset teknik baseret kommerciel software endeligt rumfang (flydende, ANSYS Inc., PA, USA). Væsken domæne blev diskretiseres ved anvendelse ICEM CFD-software (ANSYS Inc., PA, USA). En mesh kardinalitet lig med 6.5×10

3 firesidige celler blev overvejet. Som i tidligere undersøgelser [21,37], blev den samtidige tilstedeværelse af dyrkningsmedium og celler modelleret ved hjælp af Eulerske-Eulerian Multifase modellen, der giver blandinger af flere adskilte endnu interagerende faser af et kontinuum, der skal beskrives. For hver fase de styrende bevægelsesligninger, Navier-Stokes ligninger, blev løst ved den numeriske solver. Dyrkningsmediet, betragtes som den primære fase, blev antaget at være newtonsk med fysiske egenskaber af dyrkningsmedier typisk anvendes i celledyrkningsapplikationer (dynamisk viskositet = 1×10

-3 Pa · s, densitet = 1000 kg /m

3) [21]. Suspenderede celler, betragtes som den sekundære nedsænket fase, blev modelleret som ikke-deformerbare sfæriske perler. I den forklarende eksempel rapporteret i dette arbejde, en densitet lig med 1070 kg /m

3 [38] og en gennemsnitlig diameter lig med 20 um (dvs. den målte diameter af Calu-3 cancerceller) blev overvejet. Tilstedeværelsen af ​​filteret blev modelleret som et porøst medium karakteriseret ved en værdi af Darcy hydrauliske modstand lig med 96×10

4 m

-2 til dyrkningsmediet og fastsætte den maksimale hydrauliske modstand accepteret af løseren (1×10

20 m

-2) for cellerne, der filteret en gennemsnitlig porestørrelse på 5 um, således at være uigennemtrængelige for dem. Celleinokulering blev antaget at være ensartet i det nedre område af dyrkningskammeret. Denne antagelse blev oversat til den beregningsmæssige ramme ordinering, som begyndelsestilstand en ensartet volumenfraktion (VF) optages af cellerne (den sekundære fase) i nedre kar region (10 ml, i den forklarende eksempel ved anvendelse af Calu-3 cellelinie) . Simuleringerne er foretaget overvejer altid højt fortyndede suspensionskulturer (Stokes numre spænder lavere end 1, VF-værdi på under 1%), for hvilke variationer i den oprindelige VF ikke mærkbart påvirker strømmen på den primære fase. Som en vejledende grænseværdi for sedimentering, en VF-værdi højere end 20% blev anset, svarende til ca. en tredjedel af den maksimale pakning grænse på 63%, dvs. pakning grænsen for ikke-deformerbare sfæriske perler regelmæssigt pakkede [21]. Simuleringer blev forlænget over flow rate værdier i området 5-120 ml /min, med en simuleret dyrkningstid lig med 60 min, hvilket blev anset for tilstrækkeligt til at beskrive dynamikken i mediet inden dyrkningskammeret fuldt. Fase-koblede SIMPLE ordning blev anvendt til tryk-hastighed kobling. Anden Order mod vindens retning og QUICK formulering blev anvendt til rumlig diskretisering af momentum og den sekundære fase transport hhv. Detaljer i forbindelse med model ligninger og randbetingelser er rapporteret i S1 Text.

Desuden for at undersøge indflydelsen af ​​den dynamiske blandingszone oprettelse inden dyrkningskammeret om udviklingen af ​​fysiske og miljømæssige mængder, transport af et skalar størrelse inden for kulturen kammeret blev modelleret. I detaljer blev transporten af ​​oxygen opløst i mediet, der strømmer inde dyrkningskammeret simuleres ved at løse advektion /diffusion transport ligning, kombineret med Navier-Stokes ‘ligning. En fuldt anoxisk dyrkningsmedium inde dyrkningskammeret blev betragtet som første betingelse (worst case). Denne beregningsmæssige model kan generaliseres til alle de opløste arter er kendetegnet ved lignende Peclet numre (dvs. forholdet mellem advektiv og diffusive transportpriser). Detaljer om modellens antagelser og ligninger er rapporteret i S2 Text.

In vitro

cellekultur

ydeevne bioreaktoren var forklarende testet i ultralav forskydningsspænding dynamisk kultur ramme (indførelse af en strømningshastighed på 5 ml /min), som identificeret fra in silico analoge in vitro forsøg (se resultater). Den ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinie Calu-3 (American Type Culture Collection, ATCC, VA, USA) blev valgt, og resultaterne af den dynamiske kultur blev sammenlignet med en statisk suspensionskultur kontrol. I detaljer blev celler dyrket i komplet medium Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Sigma-Aldrich, MO, USA) tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin /streptomycin (P /S) og 1% ikke-essentielle amino Acids (NEAA, Sigma-Aldrich, MO, USA), og opretholdt under standard cellekultur betingelser ved 37 ° C i en vandmættet atmosfære af 5% CO

2 i luft. Efter ekspansion i celle kultur flasker, 9×10

6 Calu-3 celler (1.92×10

5 celler /ml) blev inokuleret i bioreaktoren kultur kammer og dyrket i 5 dage i dynamiske undervogn med komplet vækstmedium. Bioreaktoren blev drevet ved en strømningshastighed på 5 ml /min. Parallelt hermed blev Calu-3-celler podet på samme tæthed på lave fastgørelse dyrkningskolber (Corning Inc., NY, USA) anvendt som kontrol, der repræsenterer en model af statisk suspensionskultur. Efter 5 dage blev dynamiske og statiske suspenderede dyrkede celler reddet fra bioreaktoren og ringe fastgørelse dyrkningskolbe henholdsvis og resuspenderes i frisk vækstmedium til yderligere analyse. Tre uafhængige statiske og dynamiske suspensionskulturer blev udført.

Vurderinger af

in vitro

cellekultur

Calu-3 celler høstet fra bioreaktoren og ringe tilknytning kultur kolbe og resuspenderes i frisk vækstmedium blev undersøgt ved omvendt mikroskop (Olympus CK40, Japan). Mikrofotografier blev opsamlet og analyseret ved en billedanalyse-software (Image Pro-plus 4,0, Media Cybernetics, USA) efter en (1) til at beregne antallet af enlige Calu-3-celler og antallet af Calu-3-celler danner sfæroider, og (2) at bestemme sfæroide størrelser.

Desuden var Calu-3 celler fra dynamisk og statisk suspenderet kultur forarbejdet til Transmission Electron Microscopy (TEM) analyse og for immuncytokemi. For TEM-analyse blev Calu-3 celler fikseret i Karnovsky opløsning (4% formaldehyd, 5% glutaraldehyd). Prøver blev efterfikseret i 1% osmiumtetroxid og dehydreret ved stigende koncentration af alkohol. Derefter blev prøver vasket med propylenoxid og indlejret i epoxyharpiks. Dele af 0,5 um tykkelse blev farvet med methylenblåt og safranin til morfologisk vælge interesseområde. Efterfølgende blev ultratynde sektioner indsamlet på en 300-mesh kobber gitter og efter farvning med uranylacetat og bly citrat, blev kvalitativt undersøgt under TEM (Philips EM 208S, Holland). For at evaluere den del af cellerne i aktiv cellecyklus, tilstedeværelsen af ​​reversibel DNA dobbelt-strengbrud, og den apoptotiske celledød, cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd og cytocentrifuged på en glasplade for at opnå en densitet på 10

5-celler per stedet. Cell pletter blev farvet af anti-Ki67 (Ki67, muse monoklonalt, DAKO, Italien) og anti-gamma histon H2AX (γH2AX, kanin polyklonale, Bethyl Laboratories, TX, USA) antistoffer og afsløret af DAB (3,3′-diaminobenzidin) peroxidase (HRP) Substrat Kit reaktion (DAKO, Italien). Den kvantitative vurdering af den del af Ki67 og γH2AX positive celler blev udført ved at beregne antallet af positive kerner i alt 900-2000 kerner tælles på hver analyseret prøve. Den apoptotisk celledød på enkeltcelle-niveau blev undersøgt ved hjælp af in situ Celledød Detection Kit, Fluorescein assay (enzymopløsning TdT, Label Solution fluorescein-dUTP, Roche). Grøn fluorescens positivitet nuklear blev målt ved anvendelse Olympus mikroskop BX60. Kerner blev anerkendt af den blå fluorescens af 4 ‘, 6-diamidine-2-phenyndole (DAPI, Sigma, Italien). Fraktionen af ​​døde celler blev vurderet ved at tælle antallet af apoptotiske kerner i alt næsten 1000 celler. Data blev analyseret under anvendelse af envejs ANOVA-test. Resultater blev betragtet som statistisk signifikant, når p 0,05. For at undersøge den mulige utilsigtet vedhæftning af celler /sfæroider på filteret efter 5 dages dynamisk kultur i bioreaktoren blev filteret fikseret med 4% paraformaldehyd og inkuberet med DAPI i 15 minutter ved stuetemperatur, og successivt undersøgt ved hjælp af fluorescens mikroskop at vurdere tilstedeværelsen af ​​kerner på overfladen. Endelig, for at vurdere tilstedeværelsen af ​​adhærerede Calu-3 celler og sedimentering i det nedre område af dyrkningskammeret, efter celle redde den indvendige væg af dyrkningskammeret blev raspes af en celleskraber og vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) . PBS blev derfor indsamlet inden for en petriskål og observeret af inverteret mikroskop til at påvise tilstedeværelsen af ​​Calu-3 celler.

Resultater

Flow dynamik inden for bioreaktor kultur kammer

Multiphysics numeriske simuleringer lov til at karakterisere strømningsfeltet inde i bioreaktoren kultur kammeret. Fig 2 viser skematiske fremstillinger af de typiske medium flow strukturer oprettelse inde dyrkningskammeret, der skyldes den gensidige vekselvirkning mellem mediet (primær fase), og cellerne /konstruktioner (dispergeret fase), afhængigt af den pålagte strømningshastighed. I detaljer, i tilfælde af strømningshastigheden værdier lavere end 20 ml /minut (fig 2A og 2A1), mediet streaming i kulturen kammer gennem ventilen har ikke tilstrækkelig energi til markant interagere med sidevæggen af ​​kulturen kammeret. Balancen mellem hydrodynamiske og tyngdekraften fører til dannelse af en dynamisk stor opdrift vortex placeret langt fra væggen af ​​kammeret (Fig 2A1). Denne flydende vortex er omgivet af mindre hvirvlende strukturer placeret tættere på væggen, der sikrer en suspension af de dyrkede celler og øge blanding og transport (fig 2A1). Som et eksempel, Fig 3 viser tidsudviklingen af ​​VF besat af suspenderede celler inde dyrkningskammeret, opnået simulere tilstedeværelsen af ​​9×10

6 inokulerede celler (indledende VF = 0,48%) og indførelse af en strømningshastighed på 5 ml /min (ultralav shear stress tilstand, i lighed med den eksperimentelle in vitro test). Det kan observeres, at dyrkede celler opretholdes meste ensartet fordelt i det nedre område af dyrkningskammeret. I detaljer, efter en transient af omkring 5 min, er den 95,3% af de inokulerede celler suspenderes til en gennemsnitlig VF værdi på ca. 0,33%, hvilket er tæt på den oprindelige VF-værdi (0,48%), med toppen af ​​tæthedsfunktionen (PDF) værdi svarende til 2,5, svarende til VF-værdier mellem 0 og 0,5% (fig 4A). Ved bunden af ​​dyrkningskammeret, er et lille volumen af ​​ca. 194 pi kendetegnet ved en VF værdi omkring 6%, som dynamisk involverer kun 2% af de inokulerede celler (figur 3). Denne pakning værdi er mere end tre gange lavere end tærskelværdien for sedimentering, der blev indstillet (20%) og omkring ti gange lavere end den maksimale pakning grænse på 63%. Især når en strømningshastighed på under 20 ml /min er vedtaget, fordelingen af ​​shear stress værdier opleves af cellerne i kultur kammer viser, at de højeste shear stress levels er lavere end 1 MPa (Fig 4B) med middelværdi og median værdier tæt på 1×10

-2 mPa (den såkaldte ultralav forskydningsspænding betingelse).

Flow felt visualisering af den gensidige vekselvirkning mellem mediet (primær fase) og cellerne /konstruktioner (dispergeret fase) inden dyrkningskammeret for ultralav (A og A1) og lav til moderat (B og B1) shear stress betingelser. Flow felt er afbildet under anvendelse af både lineære integrerede foldning linjer (A og B), og en klassisk strømline repræsentation (A1 og B1). Gule pile angiver strømningen indløb og udløb. Blå pile angiver de primære opdrift hvirvler. Røde pile viser de sekundære hvirvler.

Contour plots af den tidsmæssige udvikling af VF besat af de suspenderede celler inde i bioreaktoren dyrkningskammeret fra 0 til 60 min på simulerede tid, med en pålagt strømningshastighed på 5 ml /min (ultralav shear stress tilstand, i lighed med den eksperimentelle in vitro test) og 9×10

6 inokulerede celler (indledende VF = 0,48%). Efter en forbigående på ca. 5 minutter, er de 95,3% af de inokulerede celler suspenderes til en gennemsnitlig VF værdi på ca. 0,33%, meget tæt på den oprindelige VF værdi. Ved bunden af ​​dyrkningskammeret, pi et lille volumen på ca. 194 er kendetegnet ved en VF værdi omkring 6%, mere end tre gange lavere end den indstillede tærskelværdi på sedimentation (20%), som dynamisk involverer kun 2% af de podede celler.

sandsynlighedsfordelinger (PDF) af celle VF (A) og forskydningsspændinger (B) værdier opleves af den cellulære fase i bioreaktor kultur kammer efter 60 min, med en pålagt flow hastighed på 5 ml /min og 9×10

6 podede celler

Forøgelse af strømningshastigheden ud over 20 ml /min fremmer forekomsten af ​​Coanda effekt [39] i bioreaktor kultur kammer:. jet indtastning dyrkningskammeret tiltrækkes til den nærliggende væg og på grund af den særegne væg krumning, en adskillelse region opstår langt fra bundvæggen af ​​kammeret (fig 2B og 2B1). Som et resultat heraf er en stor uret opdrift vortex, der opvejer tyngdekraften og dermed opretholder celler /konstruktioner i suspension, genereres (Fig 2B1). Nær den ydre væg, en yderligere mindre vortex udvikler sig, som kan spille den retmæssige rolle forbedre blanding og suspension af flydende konstruktioner (Fig 2B1). Vedtagelsen af ​​en sådan flowhastighed interval (30-120 ml /min), skæv højre shear stress distributioner blev opnået, med gennemsnitlige værdier fra 2 til omkring 7 mPa, med peak shear stress værdier inden for kultur kammer lavere end 50 mPa (lav til moderat shear stress tilstand, se detaljer i S3 Text).

med hensyn til transport af opløst ilt i kultur kammer indførelse af en fuldt anoxisk første betingelse for mediet, den numeriske simulering viser klart, at inden for 840 s ( 14 minutter) partialtrykket af det opløste oxygen efterfyldes i mere end 90% af dyrkningskammeret volumen (S2 Movie, S2 tekst). De opnåede resultater kan generaliseres til transport af andre arter opløst i dyrkningsmediet, fordi deres transport er kendetegnet ved Peclet numrene to-tre størrelsesordener højere end enhed, der bekræfter, at flydende strukturer oprettelse inde i kammeret fremme transport af opløst ilt og næringsstoffer gennem blanding, hvorved homogenisering deres koncentration.

In vitro

kultur udfald

Efter 5 dages suspension kultur celler blev reddet fra den lave vedhæftede kultur kolbe (statisk suspension ) og fra bioreaktoren kultur kammer (dynamisk suspension). For det første blev de morfologisk analyseret: iagttaget ved fasekontrastmikroskopi, Calu-3 dyrkes under statiske suspension viser individuelle celler eller meget små klynger (Fig 5A), mens celler dyrket i bioreaktoren under dynamisk suspension viser klart dannelsen af ​​sfæroider (Fig 5B ). Især er forholdet mellem Calu-3-celler, der danner sfæroider og enlige Calu-3 celler er 59,7 for Calu-3-celler, der er høstet fra det lave fastgørelse kultur-kolbe og 76,0 for Calu-3-celler dyrket i bioreaktoren.

Efter 5 dages suspensionskultur, (A) Calu-3 celler dyrket i statisk suspension viser individuelle celler eller meget små klynger, (B) Calu-3-celler dyrket under dynamiske undervogn viser dannelsen af ​​sfæroider. Scale bars 200 um.

Desuden ultrastrukturelle analyse af TEM gør det muligt at konstatere, at Calu-3 fra statisk suspension delvist er forbundet med svage og små compliance vejkryds (Fig 6A og 6A1) med morfologiske ændringer ( S1 fig). Omvendt sfæroiderne høstet fra bioreaktoren kultur kammer er 2,4 gange (p 0,001) større (gennemsnitlig areal = 23.699 ± 5645 um

2) end klynger reddet fra den lave vedhæftede kultur kolbe (gennemsnitlig areal = 9787 ± 2202 um

2), og er sammensat af celler, der er kendetegnet ved de typiske morfologiske træk af Calu-3, som fremtrædende nucleoli og membraner mikrovilli (fig 6B), med veludviklede compliance vejkryds (fig 6B1).

TEM billeder viser (a) en lille klynge (3 celler) af Calu-3-celler dyrket i statisk suspension, og (B) et større sfæroid (9 celler) af Calu-3-celler dyrket i bioreaktoren, høstet både efter 5 dages suspensionskultur. Fremtrædende nucleoli (N: kerner), cytoplasmatiske strukturer og i længderetningen og tværgående orienterede mikrovilli er karakteristiske træk ved NSCLC cellelinie Calu-3. Høje forstørrelse synspunkter områder indgår i sorte rektangler i panel A og B vist henholdsvis (A1) en enkelt lille vedhæftning junction (pilespids) blandt celler dyrket under statisk suspension, og (B1) adskillige veludviklede compliance vejkryds (pilespidser) udviklet af Calu-3 dyrkes i bioreaktoren. Skalapanelerne: A og B = 5 um; A1 og B1 = 1 um.

Disse observationer understøttes af vurderingen af ​​Ki67 immunfarvning, hvilket indikerer, at den del af cykling Calu-3 celler er betydeligt højere (1,58-dobling), når de dyrkes i dynamisk snarere end i statiske suspension betingelser (figur 7A). Endvidere har den kvantificering af DNA dobbelt-strengbrud, er det muligt at konstatere en nedadgående tendens (1,5 gange reduktion, selv om det ikke statistisk signifikant) i den del af γH2AX

POS Calu-3-celler dyrket i bioreaktoren sammenlignet til cellerne dyrket under statiske suspension (fig 7B). Dette bekræftes af den apoptotiske celledød assay, ja den del af apoptotiske Calu-3 celler høstet fra den statiske kontrol suspension (46,5 ± 4,5%) var 16,9 gange højere end celler, der er høstet fra bioreaktoren (2,7 ± 0,2%), ( p 0,05)

(A) Søjlediagram af målingen af ​​Ki67-positive celler, der viser den del af cykling Calu-3 celler efter statisk og dynamisk suspensionskultur (*: p. 0,05 vs statisk suspension).