PLoS ONE: miR-186 og 326 Forudsige Prognose for pancreas Ductal adenocarcinom og påvirke spredning og Migration af kræftceller

Abstrakt

MikroRNA’er kan fungere som vigtige tumorsuppressorer eller onkogener og fungere som biomarkører for kræft diagnose eller prognose. Selv high-throughput analyser har afsløret mange miRNA-biomarkører for pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC), kun nogle få er blevet valideret i uafhængige populationer eller undersøgt for funktionelle betydning i PDAC patogenese. I denne undersøgelse korrelerede vi ekspressionen af ​​36 potentielt prognostiske miRNA inden PDAC væv med klinisk-patologiske træk og overlevelse i 151 kinesiske patienter. Vi analyserede derefter de funktionelle roller og målgener af to miRNA i PDAC udvikling. Vi fandt, at høj ekspression af MIR-186 og MIR-326 forudsige fattige og forbedret overlevelse hhv. miR-186 var over-udtrykt i PDAC patienter sammenlignet med kontroller, især hos patienter med store tumorer ( 2 cm), lymfeknude metastaser, eller overlevelse på kort sigt ( 24 måneder). I modsætning hertil blev miR-326 nedreguleret hos patienter sammenlignet med kontroller og vises relativt forøget ekspression i patienter med langvarig overlevelse eller uden venøs invasion. Funktionelle eksperimenter viste, at PDAC celledeling og migration blev nedsat efter hæmning og forbedret efter overekspression af miR-186. I modsætning hertil blev det forbedret efter hæmning og faldt efter overekspression af miR-326. En luciferaseanalyse indikerede, at MIR-186 kan binde direkte til 3′-UTR af

NR5A2

at undertrykke genekspression. Disse resultater tyder på, at miR-186 overekspression bidrager til invasive potentiale PDAC, sandsynligvis via undertrykkelse af NR5A2, hvilket fører til en dårlig prognose; høj MIR-326-ekspression forlænger overlevelse sandsynligvis via faldende invasive potentiale PDAC celler. Disse to miRNA kan bruges som markører for klinisk diagnose og prognose, og de repræsenterer terapeutiske mål for PDAC

Henvisning:. Zhang Zl, Bai Zh, Wang Xb, Bai L, Miao F, Pei Hh (2015) miR-186 og 326 Forudsige Prognose for pancreas Ductal adenocarcinom og påvirke spredning og Migration af kræftceller. PLoS ONE 10 (3): e0118814. doi: 10,1371 /journal.pone.0118814

Academic Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Juli 8, 2014 Accepteret: 6 jan 2015; Udgivet: 5 Marts 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. projektet blev støttet af Social Development guide Plan of Xi’an (SF1203 (5)) og Support projekt for unge i Second Affiliated Hospital Xian Jiaotong Universitet (YJ (QN) 201.204). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i den industrialiserede verden og sjette i Kina [1,2]. Givet en mangel på forskellige kliniske manifestationer og praktiske metoder til tidlig påvisning, de fleste patienter ikke har mulighed for kirurgisk resektion når diagnosticeret [2]. Endvidere ca. 70% af patienter, som modtager kirurgi stadig undergår tidligt tilbagefald inden for 6-12 måneder som følge af de stærkt aggressive egenskaber PDAC [3]. I øjeblikket er den samlede 5-års overlevelse af patienter med PDAC er mindre end 5%, uanset behandling [3]. Forbedring af PC dødeligheden nødvendiggør opdagelsen af ​​nye værktøjer til tidlig påvisning, diagnosticering og monitorering af terapeutisk effekt.

Årtiers undersøgelser viste, at vedvarende ændringer i genekspression tilskrives epigenetiske modifikationer, genmutationer og sletninger er afgørende for udviklingen, progression, og vedligeholdelse af pancreas tumorer [4]. Skønt der er fundet talrige ændringer i genekspression i PDAC, har det været en udfordring at identificere de vigtigste gener, der er ansvarlige for carcinogenese og progression af pancreascancer. En strategi at frasortere cancer-fremmende gener eller onkogener er at korrelere post-transkriptionelle biomarkører med klinisk-patologiske funktioner og overlevelse. Et gen, der væsentligt forudsiger cancer progression og prognose kan deltage direkte i carcinogenese eller interagere med et gen, der fungerer i patogenesen af ​​cancer [5]. Desuden identificerer nye markører er nyttigt for at udvikle nye metoder til tidlig diagnose og forbedre den dystre prognose [6].

microRNA (miRNA) er en ny familie af små (typisk 18-25 nukleotider), enkeltstrenget ikke-kodende RNA. miRNA binder specifikke mål mRNA i 3’utranslaterede område (UTR) med perfekt eller næsten perfekt komplementaritet, hvilket resulterer i mål mRNA nedbrydning eller oversættelse hæmning hhv. Der er 2.042 modne humane miRNA aktuelt fastlagt, at der forventes at regulere mere end 30% af target humane mRNA’er [7]. For nylig, viser stigende tegn på, at miRNA deregulering bidrager til carcinogenese ved at fremme ekspressionen af ​​proto-onkogener eller ved at inhibere ekspressionen af ​​tumorsuppressorgener [8]. Sådanne “kræftpsykologisk miRNA” er også blevet påvist i PDAC: miR-196a fremmer kræft progression ved at målrette NFKBIA, og miRNA-126 og 148a hæmme kræft cellevækst ved at nedregulere Cdc25B og ADAM9 henholdsvis [9-12]. Desuden blev fundet mange microRNA skal udtrykkes afvigende i PDAC hjælp udtryk profilanalyse, selv om deres funktionelle roller i bugspytkirtlen carcinogenese er stadig uklart, [13-17]. I betragtning af de liberaliserede genekspression netværk i bugspytkirtelkræft [18], post-transkriptionel regulering for target-genet i PDAC af miRNA er værdig yderligere udforskning.

Den intelligente betydning microRNA udtryk for klinisk-patologiske funktioner og kliniske resultaterne af PDAC har også tiltrukket omfattende opmærksomhed. Brug high-throughput microarray chips har tusindvis af microRNA blevet evalueret i små prøver af patienter med PDAC, og enkelte blev rapporteret til at være statistisk signifikante biomarkører for overlevelse [17,19,20]. Bloomston på el. profileret miRNA udtryk i 65 par PDAC væv og matchede godartede tilstødende pancreas vævsprøver [17]. De fandt, at 21 miRNA var opreguleret og fire miRNA blev nedreguleret i PDAC og at en undergruppe af seks miRNA (MIR-452, mir-105, mir-127, miR-518a-2, mir-187, og MIR -30a-3p) var i stand til at skelne langsigtede overlevende med lymfeknude-positiv sygdom fra dem, der døde inden for 24 måneder. Jamieson et al. associeret miRNA udtryk profiler i 48 PDAC væv med deres clinicopathologic funktion og prognose og fandt, at 20 miRNA, herunder miR-21 og miR-34a, forudsagde samlede overlevelse [20]. Det skal bemærkes, at microRNA biomarkører afdækket af disse undersøgelser ikke er i overensstemmelse, som er delvist tilskrives den heterogenitet i karakteristika for de patienter, samt variable design studie og analysemetoder statistiske. De fleste biomarkører afsløret af disse high-throughput undersøgelser er ikke valideret i andre uafhængige undersøgelser, og deres funktionelle rolle i PDAC udvikling er heller ikke klart, [17,19,20]. Disse uoverensstemmelser fremhæve et behov for replikation af resultaterne i en stor stikprøvestørrelse at validere de prædiktive betydninger i disse microRNA. I den foreliggende undersøgelse, valgte vi 36 miRNA, der blev rapporteret til at blive dereguleret i PDAC eller væsentligt forudsige prognosen i tidligere undersøgelser og evaluerede deres prædiktive betydning for overlevelse i 151 kinesiske patienter med PDAC. Derudover analyserede vi de funktionelle rolle og målgener af to potentielle miRNA-biomarkører i PDAC udvikling.

Materialer og metoder

2.1 Patienter og prøvetagning

Den foreliggende undersøgelse indskrevet 151 patienter, som gennemgik helbredende pankreatektomi på The Second Affiliated Hospital i Xian Jiaotong Universitet i perioden 2005 til 2010. Alle patienter blev patologisk diagnosticeret med primære humane pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) ifølge WHO klassifikationen. Ingen af ​​patienterne havde modtaget præoperativ kemoterapi. De demografiske og klinisk-patologiske karakteristika for de patienter blev opnået ved at gennemgå de medicinske journaler og kontakte læger i gebyr. Den samlede overlevelse tid blev beregnet ud fra tidspunktet for diagnosen til døden for bugspytkirtlen kræftdødsfald eller datoen for sidste kontakt eller død af andre årsager til censurerede tilfælde. I alt 151 formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) PDAC væv fra resektion vævsprøver af disse patienter blev anvendt til miRNA ekspressionsanalyse. Desuden blev 15 cancervæv og 14 hosliggende normale pancreas væv fra det dissekerede kirurgi enheder af 15 patienter med PDAC. Alle procedurer undersøgelsens blev godkendt af Medical Ethics Committee of The Second Affiliated Hospital i Xian Jiaotong Universitet (certifikat nr MEC2012023). Alle undersøgelsens deltagere forudsat informeret skriftligt samtykke.

2.2 miRNA udvælgelse

Vi gennemgik litteraturen om den prædiktive betydning miRNA til bugspytkirtlen overlevelse kræft offentliggjort 2007-2012 i PubMed database. I alt 36 miRNA blev udvalgt til validering i vores patient kohorte baseret på to kriterier: 1) de blev rapporteret til at blive dereguleret i PDAC eller forudsige overlevelse PDAC; 2) De er ikke valideret i nogen uafhængige patient- kohorte. De undersøgte miRNA inkluderet miR-196a-2, miR-219, miR-452, miR-105, miR-127, miR-518a-2, miR-187, miR-30a-3p, miR-17-5p, miR- 125b, miR-141, miR-154 *, miR-181b, miR-186, miR-193, miR-221, miR-223, miR-224, miR-29c, miR-30a, miR-30c, miR-30d , miR-31, miR-33a, miR-34a, miR-378, miR-423, miR-455, lad-7b *, miR-1207-3p, miR-1296, miR-1914 *, miR-197, miR -326, miR-3610, miR-4290.

2.3 cellelinier

De humane PDAC cellelinjer, MiaPaCa-2, BxPC3, Panc-1, og human pancreas ductal epitel (HDPE) celler blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640-medier (Gibco, Life Technologies, Shanghai, Kina), som suppleres med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies, Shanghai, Kina). Celler blev holdt ved 37 ° C med 5% CO

2 i en befugtet inkubator og høstet med trypsin-EDTA i en eksponentielt voksende fase.

2.4 RNA-isolering og kvantitativ RT-PCR

miRNA blev isoleret fra FFPE sektioner ved hjælp af en Qiagen miRNeasy FFPE Kit (Hilden, Tyskland) ved at følge fabrikantens protokol. Kort fortalt kræft væv var makro-dissekeret fra 4-6 lysbilleder af FFPE PDAC prøver efter en gennemgang af den repræsentative H de blev derefter behandlet med proteinase K ved 37 ° C natten over. Lysatet blev blandet med bindingsbuffer RBC og overført til en gDNA Eliminator spin-kolonne for at fjerne genomisk DNA. Derefter blev en RNeasy MinElute søjle anvendes til at binde totalt RNA fra den resterende væske. Det oprensede RNA blev elueret fra denne søjle ved RNase-frit vand og blev kvantificeret ved absorbans ved 260 nm med et ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop, Wilmington, DE, USA). Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler og Mikrodissekterede celler under anvendelse en Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA). Ekspressionsniveauerne af hver miRNA blev undersøgt med en TaqMan kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) under anvendelse af individuelle, specifikke primere og prober ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). For mRNA kvantificering, blev cDNA syntetiseret fra 2 ug af det store RNA fraktionen under anvendelse af M-MLV revers transkriptase, og real-time PCR analyser blev udført med SYBR

Premix Ex Taq

kit (Takara Bio, Otsu, Japan ). Primerne til mRNA kvantificering blev indkøbt fra AuGCT, Inc. (Beijing, Kina), og sekvenserne er vist i S1 tabel. Ekspressionsniveauerne for hver modne miRNA og mRNA blev vurderet ved anvendelse af sammenlignende tærskelcyklus (Ct) fremgangsmåde og normaliseret til U6 snRNA (2

-ΔCt). Fold ændring af hver miRNA /mRNA blev beregnet ud fra tumorvæv /celler versus normale væv /celler og behandlede celler versus ubehandlede celler. miRNA udtryk blev bestemt til at være høj, når ekspressionsniveauet var lig med eller over gennemsnittet for kohorten og lav, når det var under gennemsnittet for kohorte.

2,5 miRNA efterligne og hæmmer transfektion

Funktionelle konsekvenser af afvigende miR-186 og miR-326-ekspression blev undersøgt ved forbigående transfektion deres efterligner (miR-186 efterligner og miR-326 efterligner), hæmmere (Anti-miR-186 og Anti-miR-326, Mirvana miRNA efterligner /inhibitor , Life technologies, Shanghai, Kina), og tilsvarende negative kontroller (Anti-miR-NC og miR-NC for hver miRNA, GenePharma, Shanghai, Kina) ind MiaPaCa-2, BxPC3, Panc-1 celler. Celler blev podet på en plade med 24 brønde ved 10.000 celler per brønd og transficeret 24 timer senere med en miRNA inhibitor eller efterligner i en slutkoncentration på 10 nm ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. 48 timer efter transfektion blev cellerne høstet til Western blot eller QRT-PCR-analyser.

2.6 Cell Proliferation Assay

Celleproliferation blev testet ved kolorimetrisk assay under anvendelse af et WST-1 reagens Kit (Roche Applied Science, Basel, Schweiz). I alt 5000 celler som havde gennemgået 48 timers transfektion blev anbragt i hver brønd i en plade med 24 brønde og inkuberet i yderligere 48 timer. Derefter blev 10 pi WST-1 reagens tilsat og inkuberet i 3 timer. Absorbansen ved 450 nm blev målt og sammenlignet med referenceværdien ved 650 nm ved hjælp af en mikropladelæser og analyseret med SoftMax Pro 5-softwaren. Hver eksperimentel gruppe omfattede mindst 8 replikatbrønde, og alle forsøg blev gentaget mindst tre gange uafhængigt af hinanden. Den relative celledeling blev normaliseret med den tilsvarende kontrol.

2.7 Transwell Cell Invasion Assay

BD Falcon 8,0-mm pore Transwell cellekultur indsatser (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) var anvendes til at evaluere invasivitet af PDAC celler transficeret med forskellige miRNA eller negative kontroller. Indsatsene blev anbragt i en 24-brønds plade i 30 minutter før såning celler. I alt 3 × 10

4 celler blev anbragt i hver brønd i det øvre kammer og blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO

2. Efter inkubation blev migrerede celler, der forblev på bundfladen fikseret med 4% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, Shanghai, Kina) opløsning i 10 minutter, vasket med PBS og farvet med 0,5% krystalviolet (Sigma-Aldrich, Shanghai, Kina ) i 10 minutter. Celletælling blev udført ved anvendelse af en mikropladelæser. Alle forsøgene blev udført selvstændigt i tre eksemplarer.

2.8 MIR-186 mål for forudsigelse

De formodede miRNA mål blev forudsagt af Targetscan [21], Miranda [22], og PITA [23 ], RNAhybrid algoritmer [24] ved brug af standard parametre, der indgår i softwaren for hver. De formodede målgener blev yderligere screenet ud ved at vurdere bugspytkirtlen udtryk database (https://www.pancreasexpression.org) [18]. Vi valgte de gener, der mødtes to standarder: 1) de blev identificeret ved alle fire algoritmer; 2) de blev afsløret reguleres sammen med PDAC udvikling i tidligere undersøgelser.

2.9 Luciferaseassayreagens

For at konstruere det grønne fluorescerende protein (GFP) reporter plasmid, 3′-UTR af fragment af NR5A2 mRNA indeholdende den forudsagte mIR-186 bindingssted blev amplificeret ved PCR under anvendelse af primerne, der er anført i S1 tabel og indsat nedstrøms for GFP-genet i pcDNA3.1 /CT-GFP-TOPO-vektor (Promega, Madison, WI, USA) . Den resulterende vektor blev navngivet pGFP-NR5A2 3′-UTR. Site-directed mutagenese af MIR-186 målområde i NR5A2 3′-UTR blev udført under anvendelse af et QuickChange mutagenesis kit (Stratagene, San Diego, CA, USA) med NR5A2 3′-UTR som skabelon og blev navngivet NR5A2 3 ‘-UTR-Mut. I den muterede konstrukt, den MIR-186 målstedet 5’-ATTCTTT-3 ‘blev erstattet med en 5′-ACTGAAT-3′-fragment. NR5A2 3′-UTR-Mut blev klonet ind i pcDNA3.1 /CT-GFP-TOPO-plasmid til konstruktion pGFP-NR5A2 3′-UTR-Mut. Alle insertionerne blev bekræftet ved sekventering. MiaPaCa-2, BxPC3, og Panc-1 celler blev transficeret med pGFP-NR5A2 3’-UTR eller-Mut sammen med miR-186 efterligner /Anti-miR-186 eller tilsvarende kontrol vektorer (miR-NC eller Anti-miR- NC). Alle transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Otteogfyrre timer efter transfektion blev luciferaseaktiviteter målt ved Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Hvert forsøg blev gentaget tre gange.

2.10 Western blot-analyse

Western blotting blev udført for at bestemme NR5A2 proteinekspression. Det samlede protein blev ekstraheret fra PDAC væv og normale væv. Proteiner blev kvantificeret ved Bradford-metoden ifølge producentens protokol (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Prøver (50 ug protein) blev opløst på en 10% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. Membranerne blev probet med antistoffer for NR5A2 og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH). Alle antistoffer blev indkøbt fra Abcam selskab og blev anvendt i en fortynding på 1: 500 for anti-NR5A2 og 1: 1000 for anti-GAPDH. Den Labworks indsamling og analyse billede software (UVP, Upland, CA, USA) blev anvendt til at kvantificere båndintensiteter.

2.11 Statistisk analyse

Overlevelseskurver blev konstrueret med Kaplan-Meier analyse og sammenlignet ved anvendelse en log-rank test for at vurdere indflydelsen af ​​enkelte miRNA og klinisk kovariat på resultatet. Vi brugte en multivariat Cox proportionel risiko tilstand at vurdere den samlede overlevelse risikoen via beregning af hazard ratio (HR) med 95% fortrolige intervaller (CIS) med justering for konkurrerende risikofaktorer i en baglæns trinvis. De variable med

P

0.1 om univariat analyse blev inkluderet i multivariat analyse. En χ

2 test blev udført for at foretage en sammenligning af de kategoriske variable. T-test, Mann-Whitney U-test og variansanalyse blev udført for at sammenligne de kontinuerlige variabler efter behov. Alle de

in vitro Salg eksperimenter blev udført tredobbelt og blev gentaget mindst to gange, med data ekspression som middelværdi ± SD. Alle

P

-værdier er tosidet og betragtes statistisk signifikant, når mindre end 0,05. For flere test, var falsk opdagelse sats (FDR) beregnet ved hjælp af metoden beskrevet af Benjamini og Hochberg [25]. FDR anslår andelen af ​​de resultater, der blev erklæret positivt, at der faktisk falsk, og resultaterne med FDR 0,05 for flere tests er betragtet som statistisk signifikant. Statistisk analyse blev udført på SPSS 16,0 software.

Resultater

3.1 Karakteristik af patienternes

Tabel 1 opsummerer de demografiske og klinisk-patologiske karakteristika for de 151 PDAC patienter inkluderet i vores undersøgelse. De fleste patienter havde stadium-T2 /3 klasse-1/2 tumorer, med perineurale og venøs invasion, positive lymfeknuder, og positive resektion marginer. Den mediane samlede overlevelse var 16,2 måneder. Blandt disse patienter, 110 patienter døde inden for 24 måneder efter resektion (defineret som kortsigtede overlevende), og 41 patienter overlevede 24 måneder efter resektion (defineret som langsigtede overlevende). Der var ikke signifikante forskelle i demografiske og klinisk-patologiske variabler mellem kortsigtede overlevende og langsigtede overlevende (FDR 0,05, tabel 1). Desuden univariat analyse for disse 11 variable med en log-rank test afslørede, at dårlig samlede overlevelse var signifikant associeret med venøs invasion (

P

= 0,006, FDR = 0,033, Fig. 1A) og resektion margin involvering (

P

= 0,004, FDR = 0,033, fig. 1B), men blev nominelt associeret med tumor differentiering (

P

= 0,021, FDR = 0,077, fig. 1C) og adjuverende kemoterapi (

P

= 0,042, FDR = 0,116, fig. 1D). De klinisk-patologiske faktorer med

P Drømmeholdet værdi mindre end 0,10 blev anvendt til efterfølgende multivariat analyse.

Overlevelseskurver blev sammenlignet med log-rank analyse for 11 demografiske og klinisk-patologiske variabler , og dem med

P

0,05 er vist i denne figur. FDR for hver testresultat blev beregnet ved Benjamini og Hochberg metode.

3.2 miRNA ekspression i PDAC prøver og deres klinisk-patologiske og prognostisk signifikans

Vi målte ekspressionsniveauerne af 36 miRNA i 151 FFPE væv af PDAC efter QRT-PCR og korreleret deres ekspressionsniveauer med klinisk-patologiske træk. Vi fandt 1 miRNA differentielt udtrykt baseret på tumorstørrelse, 2 for lymfeknudemetastaser, og 3 for venøs invasion efter kontrol for FDR 0,05 (tabel 2). Kræft væv med en størrelse, der var større end 2 cm udtrykt øget miR-186 end dem, der var mindre end 2 cm (

P

0,0001, FDR = 0,004). Lymfeknudemetastase signifikant korreleret med forhøjet miR-186 (

P

= 0,002, FDR = 0,030) og miR-224 (

P

= 0,0001, FDR = 0,002). Tumor progression etape havde en signifikant sammenhæng med øget miR-186-ekspression (fase I ~ II vs III ~ IV

P

≤ 0,0001, FDR = 0,004). Venøs invasion blev ledsaget af øget miR-224 (

P

= 0,001, FDR = 0,012) og reducerede miR-326 (

P

0,0001, FDR = 0,001) og miR-452 (

P

. 0,0001, FDR = 0,001)

Vi efterfølgende evalueret den prognostiske værdi af disse 36 miRNA ekspressionsniveauerne i PDAC ved hjælp af to metoder beskrevet af Bloomston et al. [17]. Først, vi vurderede miRNA, der havde et absolut udtryk niveau, der kunne skelne mellem kort- og langsigtede overlevende. Vi fandt, at miR-186, miR-221, og miR-224 var differentielt overudtrykt i patienter med kortere overlevelse, mens miR-125b og miR-326 var over-udtryk i patienter med længere overlevelse med

P

værdier på 3,3 × 10

-6-0.005 og FDR ,0001-,036 (tabel 3). Dernæst har vi udført en log-rank-analyse for at sammenligne Kaplan-Meier-overlevelseskurverne for to patientgrupper, der blev defineret som høj eller lav ekspression i forhold til den gennemsnitlige ekspression af hvert miRNA på QRT-PCR. Fem miRNA viste nominelle forskel i overlevelse kurver vedrørende høj vs. lav ekspression (

P

0,05, figur 2.), Men kun miR186 og miR-326 forblev statistisk signifikant efter korrektion for FDR. Høj udtryk for miR-186 signifikant forudsagt en dårligere prognose (median overlevelse på 13,8 måneder for høj ekspression vs. 22,5 måneder for lav udtryk,

P

0,0001, FDR = 0,001). Høj udtryk for miR-326 korreleret med en bedre prognose (median overlevelse på 17,5 måneder for høj ekspression vs 8,8 måneder for lav udtryk,

P

= 0,0005, FDR = 0,009). Endelig syv miRNA med

P

0.1 i de to foregående tests for overlevelse blev inkluderet i en multivariat model sammen med potentielle prognostiske klinisk-patologiske faktorer. Cox proportionel risiko regressions analyse bekræftede, at høj ekspression af miR-186 (HR = 1,655, 95% CI: 1,137-2,410,

P

= 0,009), miR-224 (HR = 1,445, 95% CI: 1,033-2,021,

P

= 0,032) og miR-221 (HR = 1,432, 95% CI: 1,007-2,036,

P

= 0,046) forblev uafhængige prædiktorer for dårligt resultat, hvorimod høj udtryk for miR-326 (HR = 0,476, 95% CI: 0,317-0,715,

P

0,001) og adjuverende kemoterapi (HR = 0,649, 95% CI: 0,443-0,950,

P

= 0,026) uafhængigt forudsagt bedre overlevelse (tabel 4).

Overlevelseskurver blev sammenlignet med log-rank analyse for 36 miRNA, og dem med

P

0,05 er vist i denne figur. FDR for hver test resultat blev beregnet af Benjamini og Hochberg metode.

3.3 Funktionelle konsekvenser af miR-186 og miR-326 regulering i humane PDAC celler

Først målte vi miR-186 og miR-326 niveauer i tre PDAC cellelinjer, Æske med HDPE celler, PDAC væv og tilstødende normale væv ved QRT-PCR. Sammenlignet med normal pancreas væv eller Æske med HDPE-celler, MIR-186 forøgede ekspressionsniveauet mere end 4,4 gange i både PDAC vævsprøver og cellelinier. Omvendt MIR-326-ekspression faldt mere end 0,5 gange i både PDAC væv og cellelinjer (fig. 3A og B). Desuden blev 48 timer efter transfektion i tre PDAC cellelinier, MIR-186 og MIR-326 reduceres med ca. 0,3-0,6 gange efter transfektion af deres inhibitorer og blev forøget 5-30 gange efter transfektion med deres efterligner (fig. 3C og D). Næste vi evaluerede virkningerne af nedregulering af disse to miRNA eller deres overekspression på celleproliferation, koloni-dannelse, og migration i disse tre PDAC cellelinjer. Vi observerede, at hæmning af miR-186 udtryk i alle tre cellelinjer førte til et signifikant fald i cellevækst (~ 50-79%;

P

0,01), mens overekspression af miR-186 i disse celler resulterede i en signifikant stigning i celleproliferation (~ 96-420%;

P

0,05) sammenlignet med de respektive negative kontroller (figur 3E.). I modsætning til de miR-186 resultater, miR-326 hæmning forårsagede en signifikant stigning i cellevækst (~ 19-35%;

P

0,001), mens dens opregulering af transfektion medført signifikant fald af celleproliferation (ca. 21-32%;

P

0,01) sammenlignet med de respektive negative kontroller (fig 3F.). Tilsammen både GAIN- og tab af funktion eksperimenter konsekvent støttet de medvirkende virkninger af miR-186 og undertrykkende virkninger af miR-326 på PDAC celleproliferation. Transwell analyser blev udført for at bestemme virkningerne af miR-186 eller miR-326 regulering på celle migration. Vores data viser, at migrationen af ​​alle tre PDAC cellelinjer blev væsentligt forbedret via miR-186 over-udtryk, der blev induceret ved sin efterligner (ca. 250-900%,

P

0,001) og blev hæmmet af dens undertrykkelse (ca. 35-62%;

P

0,01;. figur 3G). I modsætning hertil miR-326 overekspression resulterede i et signifikant fald i migreringen af ​​BxPC3 celler (ca. 43%,

P

0,01), og dens undertrykkelse forårsaget en betydelig forhøjelse af migration i alle tre PDAC cellelinjer (ca. 150-500%,

P

0,001;. figur 3H).

Analyse af miR-186 (A) og miR-326 (B) udtryk i tre PDAC cellelinjer, Æske med HDPE-celler, PDAC væv og tilstødende normale pancreas væv. (C) Analyse af miR-186 udtryk i tre PDAC cellelinier efter transfektion af miR-186 efterligner, Anti-miR-186, og de respektive negative kontroller. (D) Analyse af miR-326-ekspression i tre PDAC cellelinier efter transfektion af miR-326 efterligner, Anti-miR-326, og respektive negative kontroller. Celleproliferation blev vurderet i PDAC cellelinjer transficeret med miR-186 efterligner, Anti-miR-186 eller tilsvarende negative kontrol (E) og i PDAC cellelinjer transficeret med miR-326 efterligner, Anti-mir-326 eller tilsvarende negativ kontrol (F) ved anvendelse af WST-1 assay. Relativ cellevækst blev normaliseret med sine respektive kontrol-behandlede celler. Graferne viser relativ cellemigration efter enten hæmning eller over-ekspression eksperimenter for MIR-186 (G) og MIR-326 (H), som vurderet af Transwell migration assay. Relativ cellemigration blev normaliseret til deres respektive kontrol-behandlede celler. Viste data er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelser fra middelværdien. *,

P

0,05, **,

P

0,01 og **,

P

0,001.

3.4 Validering af NR5A2 som miR-186 Target Gene

Tre målgener for miR-186 (NR5A2, FAM150B, CTNND2) og seks målgener for miR-326 (PLXNA2, CUGBP2, RUNX3, HSD11B1, PKIA, SULF1) blev valgt af en kombineret søgning i bioinformatik databaser over formodede miRNA mål og bugspytkirtlen udtryk databasen. Forrige beviser foreslået, at disse gener kan reguleres under PDAC udvikling. Flere algoritmer forudsagde også de kan være mål for disse to miRNA. For at afgøre, om de kan reguleres ved de to miRNA, vi først foretaget en QRT-PCR assay at observere udtryk ændring af disse gener i PDAC celler ved hver miRNA GAIN- og tab af funktion. Blandt disse gener, er det kun NR5A2 genet viste tilsvarende ændringer i udtryk ifølge miR-186 overekspression og undertrykkelse. MIR-186 overekspression i MiaPaCa-2, BxPC3, Panc-1 celler resulterede i et signifikant fald i NR5A2 udtryk (ca. 24-58%,

P

0,01). Hæmning af endogen miR-186-ekspression i disse celler signifikant forøget NR5A2 mRNA-niveau (ca. 124-142%,

P

0,001;. Figur 4A).

(A) QRT-PCR analyser af NR5A2 ekspressionsniveauer efter behandling af MiaPaCa-2, BxPC3, Panc-1-celler med mIR-186 inhibitorer eller efterligninger. (B) Humant NR5A2 3′-UTR fragment indeholdende et vildtype (WT) eller mutant (Mut) MIR-186-bindende sekvens blev klonet nedstrøms for luciferasereportergenet. (C) Intensiteten af ​​EGFP fluorescens blev reduceret i cancerceller transficeret med både MIR-186 efterligner og NR5A2 WT 3′-UTR, men var uændret i de transficeret med både MIR-186 efterligner og 3′-UTR-mutant vektor. (D) Relativt lavere ekspression af NR5A2 blev fundet i tumor prøver sammenlignet med deres normale modstykker anvendelse af Western blot-assay. (E) Der er en omvendt korrelation mellem ekspressionsniveauet af miR-186 og NR5A2. Udtrykket forholdet blev bedømt ved Pearsons korrelationsanalyse.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. *,

P

0,05, **,

P

0,01 og **,

P

0,001. HSA Homo sapiens; Ptr, Pan troglodytes; MML Macaca mulatta; Oga, Otolemur garnettii; MMU, mus.

Næste, vi brugte en EGFP reporter assay at validere målområdet i NR5A2 mRNA 3′-UTR. Vi konstruerede plasmider, som indeholdt EGFP og enten en MIR-186-bindingssted (pEGFP-NR5A2 3′-UTR) eller en mutant websted (pEGFP-NR5A2 3′-UTR-Mut) (fig. 4B). Vi derefter observeret, om miR-186 modulation af dets efterligner eller Anti-miR-186 kunne regulere EGFP reporter udtryk. Når NR5A2 3′-UTR blev transficeret, blev intensiteten af ​​EGFP fluorescens signifikant reduceret med MIR-186 efterligner i MiaPaCa-2, BxPC3, Panc-1-celler.