PLoS ONE: Single nukleotidpolymorfisme af SREBF-1 Gene associeret med en øget risiko for endometriecancer i kinesisk Women

Abstrakt

Sigt

Forhøjede niveauer af sterol regulatorisk element-bindende protein-1 (SREBP-1) er blevet fundet i endometriecancer (EF), hvilket antyder, at det er afgørende for udviklingen af ​​EF. Fedme og diabetes er blevet etableret som kendte risikofaktorer for EF, mens også blevet fundet SREBF-1-genet polymorfier at være forbundet med fedme og type II diabetes. Vi derfor hypotesen, at enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) i SREBF-1 genet kan være forbundet med øget risiko for EF.

Metode

Vi analyserede sekvensen af ​​SREBF-1 i vævsprøver fra 30 EF sager og 6 godartede kontrol ved hjælp af high throughput metode. Baseret på de primære resultater, valgte vi en SNP (rs2297508) som en genetisk markør til at gennemføre et hospital-baserede case-kontrol undersøgelse med 139 EF tilfælde og 129 godartede kontroller. Prøverne blev undersøgt under mikroskop for at bestemme deres histopatologi forud for SNP analyse ved hjælp af RT-PCR.

Resultater

Gennem sekvensanalyse, fandt vi 10 SNPs af SREBF-1 i forbindelse med EF, herunder 3 nye SNP’er. Fjorten procent af EF viste rs2297508 SNP med C-allel, mens kun 7% havde C-allel var til stede i godartede kontroller (p = 0,027, OR = 1.983). Endvidere blev C-allel i forbindelse med cancer differentiering (p 0,05) og dybden af ​​myometrielle invasion (p 0,05).

Konklusion

Vores undersøgelse indikerer, at SNP (rs2297508) af SREBF -1 kan tjene som en genetisk disposition faktor for udviklingen af ​​EF og screening af sådanne genetisk markør kan være nyttige i sin tidlig påvisning

Henvisning:. Qiu CP, Lv QT, Dongol S, Wang C, Jiang J (2014) enkelt-nukleotid polymorfisme af SREBF-1 Gene associeret med en øget risiko for endometriecancer i kinesiske kvinder. PLoS ONE 9 (3): e90491. doi: 10,1371 /journal.pone.0090491

Redaktør: Kwang-Hyun Baek, CHA University, Republikken Korea

Modtaget: August 24, 2013; Accepteret: 31 januar 2014; Udgivet: 10 marts 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev gennemført i det kardiovaskulære laboratorium Qi Lu Hospital of Shandong University og blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81072121, 81372808 [JJ] og 81173614 [QTL]) samt planlægning af Videnskab og Teknologi Development of Shandong (2011GSF12122 [XZ] og 2012G0021823 [JJ]). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer (EF) er den mest almindelige gynækologiske malignitet i den vestlige verden og den fjerde mest almindelige kræftform hos kvinder. Forekomsten af ​​EF er steget med 21% siden 2008, og dødeligheden er steget betydeligt i de seneste to [1] årtier. The American Cancer Society anslået 49.500 nye tilfælde og 8.200 dødelighed i 2013 [2]. Ætiologien af ​​EF er multifaktoriel og involverer øget eksponering for østrogen [3] og genetiske risikofaktorer. Hidtil er det blevet bevist, at flere SNPs er forbundet med en øget risiko for EF, såsom nukleosid difosfat kinase 1 (nm23-H1, rs16949649 og rs2302254), serpin peptidase hæmmer, clade E (PAI-1, rs1799889) og progesteron receptor (PGR; rs11224561) [4] – [6]. For at forstå de genetiske risikofaktorer omfattende og finde effektive mål, er det nødvendigt at identificere de relaterede SNPs.

sterolestere regulatoriske element-bindende proteiner (SREBPs) er transkriptionsfaktorer af helix-loop-helix-leucin zipper ( HLH-LZ) familie. Tre isoformer af SREBP er blevet identificeret i mammale celler: SREBP-1a, SREBP-1c og SREBP-2 [7]. To gener (SREBF-1 og SREBF-2) er ansvarlige for at udtrykke disse proteiner, hvoraf SREBF-1 genet er lokaliseret på kromosom 17 p11.2. Der er et overlap i veje og funktioner mellem de enkelte SREBPs, men de fleste undersøgelser tyder på, at SREBP-1 regulerer hovedsageligt fedtsyre metabolisme og SREBP-2 er den vigtigste regulator af kolesterol stofskiftet [8]. SREBP-1 regulerer lipid homeostase ved at styre ekspressionen af ​​de vigtigste hastighedsbegrænsende enzymer er nødvendige for cholesterol og fedtsyresyntese [9]. Aberrant lipogenese er en vigtig metabolisk funktion involveret i hurtig proliferation af maligne tumorceller. Flere undersøgelser har vist, at tumorceller er i stand til at reaktivere de novo lipid syntese og ekspression forhøjede niveauer af fedtsyresyntase (FASN) [10], som er reguleret af SREBP-1 [11]. I overensstemmelse med disse resultater, har SREBP-1 blevet påvist at have en forening med mange andre maligne tumorer som brystkræft, prostatakræft og tarmkræft samt [12] – [15]

Gennem mekanisme. lipidbiosyntese, SREBP-1 er blevet foreslået at være en årsagsfaktor af fedme [16]. Fedme derimod anses ansvarlig for forskellige mekanismer, der udfældes i carcinogenese [7]. Gennem den mekanisme af insulinresistens, fedme inducerer sekretionen af ​​insulin fra pancreasceller. Insulin igen har en stimulerende virkning på SREBP1 [17]. For nylig er blevet påvist højere SREBP-1 i EC-celler sammenlignet med det normale endometrium, og som var mere fremtrædende i højere kvalitet EF. Derudover knockdown af SREBP1 viste sig at effektivt undertrykke den stadig kapacitet EC-celler og tumorvækst in vitro, hvilket yderligere indikerer, at SREBP-1 spiller en vigtig rolle i progressionen af ​​EF [18].

Så vidt vi ved , ingen undersøgelse til dato har rapporteret den potentielle sammenslutning af SREBF-1 genetisk polymorfisme med risiko for EF. Vi hypotesen, at SNP’er i SREBF-1 kan være forbundet med øget risiko for EF, sammen med flere kliniske kriterier som patologisk kvalitet, kliniske stadium, patologisk type, osv SNP’eme SREBF-1 kan tjene som genetisk disposition faktorer for udviklingen af ​​EF og screening af sådanne genetiske markører kunne være af stor værdi for en tidligere påvisning af denne sygdom.

Materialer og metoder

Etik erklæring

De godkendte skriftlige informerede samtykke blev erhvervet fra alle deltagerne og prøverne blev indsamlet med godkendelse fra den etiske komité på Qilu Hospital i Shandong University.

i vores undersøgelse har vi gennemført en case-kontrol-analyse med i alt 139 tilfælde og 129 kontroller. Vi først screenet hele genet af SREBF-1 i 30 ubeslægtede EF patienter og 6 knapper til at identificere den tilhørende SNP’er. Baseret på de resultater, vi opnåede, vi valgte et SNP (rs2297508), som blev fundet i otte ud af de tredive patienter og ingen af ​​de seks kontroller og gennemførte en case-kontrol undersøgelse for at kontrollere sin tilknytning til EF.

Undersøgelse emner

i alt 268 upartiske kandidater blev rekrutteret stokastisk. Prøverne af 139 EF prøven og 129 godartede kontroller blev indsamlet på grundlag af deres patologiske rapporter. De endometrie prøver fra 139 kræftpatienter blev opnået ved et kirurgisk resektion efter hysterektomi udføres på Qilu hospital Dept. of gynækologi. De vævsprøver for kontroller blev indsamlet fra patienter uden fertilitetsproblemer og med godartede patologier som leiyomyomas, adenomyose etc. De enkelte prøver blev undersøgt under mikroskopet for patologisk diagnose for begge grupper. De EF patienter blev inddelt i to grupper, 91 uden diabetes og fedme og 48 med diabetes og /eller fedme og disse oplysninger blev fik fra hospitalet optegnelser. De normale kontroller med diabetes eller fedme (BMI ≧ 28 kg /m

2) blev udelukket på grund af den mulige sammenhæng af SNP (rs2297508) med begge de stofskiftesygdomme, som beskrevet i den undersøgelse, som Liu JXet al. [20 ]. Også kontrollerne havde ingen kendte historie af diabetes, fedme eller andre maligniteter i deres familie. Gennemsnitsalderen for 48 patienter med fedme og /eller diabetes var 53,09 ± 6,7, og at af de 91 patienter uden diabetes eller fedme var 54,36 ± 9,7 (P = 0,196). Gennemsnitsalderen for de normale kontroller (52.46 ± 7,7) var sammenlignelig med den for de 91 patienter (p = 0,215). De EF patienter blev behandlet kirurgisk i Qilu Hospital fra 2008 til 2012. De blev kategoriseret i endometrioide (type I) og ikke-endometrioide (type II), EF, og tumorer blev iscenesat i overensstemmelse med den 2009 International Federation of Gynækologi og obstetrik (FIGO ) klassificering.

DNA forberedelse

De friske vævsprøve indsamlet blev opbevaret ved -80 ° C køling. Genomisk DNA blev ekstraheret fra væv ved anvendelse af en QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, USA) ved at følge fabrikantens protokol. Det ekstraherede DNA blev opløst i TE-buffer [10 mM Tris (pH 7,8), 1 mM EDTA], og derefter blev målt med en henvisning til OD-værdi på 260 nm (BIO-RAD SmartSpec Plus). Det endelige præparat blev opbevaret ved -20 ° C til PCR-amplifikation. Amplificeringer blev udført under anvendelse af en 5 min indledende denaturering ved 94 ° C, efterfulgt af 30 cykler hver varer 30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C, 30 sekunder ved 72 ° C og en 10-min endelig udvidelse ved 72 ° C. De fremadrettede og reverse primere var 5’GACCTGAGGCTCCTGTGCTAC 3 ‘og 5’ AAGTCAGTCCATCCTCCCGT 3 ‘henholdsvis.

Udvælgelse af SREBF-1 polymorfi punkter

For at få adgang fyldestgørende oplysninger om den potentielle sammenslutning af SNPs i SREBF 1 med endometriecancer, vi først screenet hele genet af SREBF-1 i 30 ubeslægtede patienter og 6 kontroller ved high throughput sekventering teknik bruger PSTAR-II plus (IDN01-M-P2). De 36 personer blev tilfældigt valgt og matches på basis af deres alder. Vi var i stand til at identificere 10 SNPs, herunder tre nyligt fundne dem. Alle resultaterne blev analyseret af PSTAR-II 6.0.4 build3 software. For foreningen undersøgelsen, valgte vi kun én SNP (rs2297508) baseret på sin allel frekvens, som udviste en oplagt og markant forhold til EF.

SREBF-1 genotyping

Real-time polymerasekædereaktion analyse blev anvendt til genotype SNP (rs2297508) i SREBF-1. Primersekvenserne for SNP var som følger: GF 5’CTCCCCCAGCACCTACGG 3 ‘, cF 5’CTCCCCCAGCACCTACGC 3’ som den fremadrettede primer og R5 ‘CTCCCCACTCCTCCCACTAAC 3’ som den reverse primer. Reaktionssystemet (20 ul) for RT-PCR omfattede 10 ul All-In-One qPCR Mix, 0,4 ul fremadrettet primer F (2 uM), 0,4 ul reverse primer R (2 uM), 2 ul genomisk DNA og 7,2 ul ddH2O . Proceduren Reaktionen blev udført på en real time PCR instrument (Step One Plus (ABI)) opdeling i tre faser: holding fase ved 95 ° C i 20 s, cykling fase af 40 cykler hver omfatter 3 s ved 95 ° C og derefter 30 s ved 60 ° C, smeltekurveanalyse fase ved 60 ° C i 60 s efterfulgt af 95 ° C i 15 s.

Statistical Analysis

Hardy-Weinberg ligevægt analyser blev udført for at sammenligne genotypefrekvenser bruge χ

2 test blandt kontroller (χ

2 = 1,24, p = 0,26). Sammenligning af genotypefrekvenser mellem EF patienter og kontroller blev udført ved hjælp af Pearson χ

2 test. Vi evaluerede også forholdet mellem genotype distribution af SREBF-1 SNP’er og de kliniske kriterier for EF (opdelt på grundlag af tilstedeværelse eller fravær af diabetes og fedme, alder, histologisk type, patologisk sortering og kliniske faser). Analyserne blev udført ved hjælp af computersoftware SPSS (version 17.0). P 0,05 blev betragtet som den grad af statistisk signifikans

Resultater

SNP identifikation og genotyping

Vores screening identificeret 10 polymorfier (SNP1 til SNP10), herunder 3 nyligt fundne steder (. fig. 1). C-allelen i SNP9 (rs2297508) blev påvist i otte af tredive patienter (26,7%), men i ingen af ​​kontrollerne. Andre fundne SNP’er viste lille forskel mellem patienter og kontroller. (Tabel 1) Derefter valgte vi SNP9 (rs2297508) for yderligere undersøgelse og analyseret alle eksperimentelle prøver og kontroller ved hjælp af real-time polymerase kædereaktion. Resultaterne (GG, GC eller CC) blev analyseret ved Step One Software V2.1. Genotypebestemmelse blev gennemført på grundlag af de forskellige forstærkning kurver observeret for forskellige genotyper (figur 2.)

A:. SNPs i SREBF-1-genet. Hele SREBF-1gene indeholder 22 exons. Ti SNP’er (SNP1 til SNP10) blev identificeret i SREBF-1 i vores undersøgelse. FIG. 1 B: SNP ID. SNP1 til SNP10 er opført fra 5′-3 ‘af SREBF-1. “CHR-id” viser kromosom ID på ti SNP’er i SREBF-1. Børsnoterede “RS ID” er blevet rapporteret i UCSC eller NCBI hjemmeside, “-” udtrykker nyligt opdaget SNP. “Funktion” kolonnen opført ændret genetisk kodet funktion af SNPs. “Ref SNP” viser SNP form oprindelige henvisning sekvens. I “mRNA placering”, er tilsvarende mRNA positioner viste i overensstemmelse med hver SNP. (For detaljer: Sequence id’er inkluderet i CCDS 32583,1). NCBI db er tilgængelig fra https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP.

Fig. 2 A, B og C viser GG, CC og GC genotype henholdsvis som det fremgår af resultaterne opnået ved RT-PCR.

associering mellem SNP rs2297508 og risiko for EF

allelen fordeling af SNP (rs2297508) på SREBF-1 genotyper i kontrolgrupper er i overensstemmelse med Hardy-Weinberg ligevægt, som testet af χ

2 test (χ

2 = 2,27, P = 0,13). Variationen i fordelingen af ​​C-allel mellem EF patienter og normale kontroller blev tydeligt vist (P = 0,027). Den χ

2 test afslørede, at GC /CC genotyper eller C allel luftfartsselskaber havde en øget risiko for EF (OR = 1,966 og OR = 1,983) sammenlignet med GG eller G luftfartsselskaber henholdsvis. Konfidensintervaller for odds ratio (OR) blev anvendt til at beskrive de begrænsninger, inden for hvilke de estimerede beregninger skal kunne anvendes. Sammenligningen af ​​genotypiske og allele frekvenser af SNP mellem EF patienter og normale kontroller er vist i tabel 2. Resultaterne var i overensstemmelse med vores foreløbige high throughput eksperiment.

associering mellem SNP rs2297508 og patologisk kvalitet og dybden af ​​myometrisk invasion af EF

Vi har forsøgt at forklare den rolle polymorfe locus rs2297508 på co-eksisterende sygdomme som diabetes, fedme, samt på forskellige aldersgrupper, patologiske typer og patologiske kvaliteter af kræft , kliniske stadier og myometrisk invasion i EF-patienter (tabel 3). Da diabetes og fedme er to store risici, der vides at være tæt forbundet med EF, og SNP er et afgørende markør af genetisk disposition for EF, kunne det antages, at der var en potentiel virkning af denne særlige polymorfi på betingelse. Vi delte EF patienterne i to grupper (med diabetes eller fedme og uden). Men ingen signifikant forskel i allelfrekvens var tydelig mellem de to. Andre kriterier for at opdele de emner i forskellige grupper blev bestemt i henhold til tidligere rapporter samt klinisk betydning [4], [5]. Resultaterne viste, at SNP C variant luftfartsselskaber havde højere patologisk kvalitet og dybere myometrisk invasion (OR = 2,042 og OR = 2,233) sammenlignet med G luftfartsselskaber. Desuden blev GC /CC genotype og C-allelen signifikant associeret med patologisk bedømmelse (χ

2 = 4,095, P = 0,043 og χ

2 = 3,893, P = 0,048 henholdsvis) og myometrisk invasion (χ

2 = 4,018, P = 0,045 og χ

2 = 4,170, P = 0,041 henholdsvis). Andre kriterier såsom alder, patologisk type og klinisk fase viste ingen signifikant association med SNP.

Diskussion

Lipid biosyntese er afgørende for opretholdelsen af ​​cellulære homeostase mens øget de novo lipid syntese er en almindelig metabolisk træk ved carcinogenese [19]. Den øgede ekspression af FASN og LDLR (Low density lipoprotein receptor) i tumorceller bevidne denne erklæring [20]. SREBPs kan regulere forskellige enzymer involveret i fedtsyrer og cholesterolbiosyntese. Bortset fra at påvirke flere enzymer involveret i lipogenese, SREBP deltager også i omdannelsen af ​​androgen til østrogen via aromatisering reaktion således øge niveauet af østrogen i kredsløbet. Fedme er også blevet fundet ansvarlig for at sænke niveauerne af progesteron, som har en stærk modvirkende effekt på kræftfremkaldende funktion af østrogen [21]. Desuden er SREBP1 også forbundet med modulering af transskription af enzymet 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 12 (17 β -HSD12), som er ansvarlig for omdannelsen af ​​østron (E1) til en mere potent form estradiol (E2) [22], [23]. Så kan vi udlede, at SREBP aktivitet er nødvendig for tumorvækst, hvilket indebærer, at SREBP spiller en væsentlig rolle i onkogenese. Derudover har afvigende øget ekspression af SREBP-1 blevet fundet i flere kræftformer, herunder EF [18].

I denne forskning, vi postulerede, at SNP’er i SREBF-1gene har potentielle rolle i genetisk disposition for EF. En tidligere undersøgelse påvist 19 polymorfier i SREBF-1 og demonstrerede associationen mellem SREBF-1 polymorfier og fedme samt type II diabetes [19]. Desuden har epidemiologiske undersøgelser bekræftede, at fedme er en af ​​de største risikofaktorer for EF mens SREBF-1-genet polymorfier har foreninger med metaboliske sygdomme (type2 diabetes og fedme) [24]. En anden undersøgelse konkluderede, at SNP rs2297508 og rs11868035 i SREBP-1c gen har relationer med øget risiko for T2DM og dyslipidæmi i den kinesiske befolkning. Den samme undersøgelse viste også, at SNP (rs11868035) er signifikant associeret med insulinresistens (IR) i diabetespatienter [25]. Men de undersøgelser, som viser sammenhængen mellem SREBF-1 genetiske polymorfier og cancere, er sjældne. Indtil nu, har kun Daniele Campa og hans medarbejdere undersøgt forholdet mellem SNP’er i SREBF-1 og onkogenese af brystkræft, men ingen statistisk signifikante associationer blev fundet mellem SNP’er detekteret og risikoen for brystcancer [26]. Således har vi også yderligere vurderet vores hypotese, at de genetiske polymorfier er forbundet med diabetes og fedme sammen med få andre kliniske kriterier er forbundet med EF.

Så vidt vi ved, er dette den første rapport undersøger rolle SREBF-1 gen polymorfier i EF. I vores undersøgelse fandt vi, at fordelingen af ​​SNP (rs2297508) havde en særskilt afgrænsning mellem EF patienter og benigne kontroller. C allel i SNP var forbundet med højere modtagelighed for EF. Derfor forudser vi stor mulighed for C-allel i SNP har en afgørende forhold med risiko for EF, og vi mener, at yderligere udforskning ville føre forskerne at udvikle en ny terapeutisk mål til behandling af EF.

Vi yderligere analyseret sammenslutningen af ​​forskellige kliniske karakteristika i EF patienter med SNP. Først, vi evaluerede association mellem diabetes og /eller fedme og genotypisk eller allel frekvens i EF-patienter. Men ingen statistisk signifikans blev fundet mellem de to grupper. Det vil sige, at SNP har samme fordeling i EF patienter uanset tilstedeværelse eller fravær af risikofaktorer som diabetes og fedme. Det foreslået, at der var unormal lipidmetabolisme forbundet med SNP i EF, som er uafhængig af diabetes og fedme. Så vi sammenlignet alderskriterier, patologiske typer og kliniske faser, men ingen signifikante associationer blev opnået, hvilket giver bevis for, at der ikke findes nogen sammenhæng mellem SNP og de kliniske karakteristika. Konsistens med den rapport, som Li W. et al. [21], C-allelen i SNP udviste en signifikant sammenhæng med højere kvalitet tumor. Endvidere patienter med C-allel viste en højere risiko for at udvikle en dybere myometrielle invasion i forhold til dem med G-allelen ved SNP-locus. Dette resultat kan skyldes sen påvisning af sygdommen, men vi kan ikke udelukke muligheden for indflydelse af SNP. Der kan være en potentiel sammenhæng mellem patologisk kvalitet af tumor samt dybden af ​​myometrisk invasion. Men der er behov for yderligere forskning for at afklare dette begreb. Sammenfattende C allelen synes at være en markør for en højere lønklasse tumor og dybere myometrisk invasion i EF, og derfor kunne fungere som en uundværlig markør, der skal tages i betragtning i klinisk evaluering og behandling af EF i den nærmeste fremtid.

som konklusion vores undersøgelse undersøgte hovedsagelig associationen mellem SNP (rs2297508) i SREBF-1 og risikoen for EF og fandt, at C-allel af SNP’en er potentielt en risikofaktor for EF. Samtidig analyserede vi foreningen af ​​SNP med forskellige kliniske kriterier i EF, og resultaterne viste, at patienter med højere C allel frekvens var mere modtagelige for at udvikle høj kvalitet tumor og dyb myometrisk invasion. Resultaterne indikerede, at SREBF-1 polymorfi kan spille en væsentlig rolle i at øge den genetiske modtagelighed for EF. vi antager derfor, at dette kan hjælpe lægen i klinisk diagnose af tilstanden og ville også guide til en målrettet klinisk terapi.

I vores undersøgelse anvendte vi high throughput sekventering, en pålidelig teknik med stor nøjagtighed og præcision, at opdage 10 SNPs forbundet med EF, herunder tre nye, som kan være af betydning for andre undersøgelser i fremtiden. Desuden har vi bekræftet, at SNP (rs2297508) i SREBF-1 har en betydelig indflydelse på EF-modtagelighed og kliniske kriterier. Men vores undersøgelse har visse begrænsninger. På emnet niveau, har vi ikke livsstil data, såsom kostindtag, fysisk aktivitet, hormonel prævention mv, der kan forventes at påvirke modtageligheden af ​​SNPs til EF risiko. Endvidere er det uvist, om SNP arbejder i samarbejde med andre SNPs i at øge risikoen for EF. Fremtidige undersøgelser af større stikprøve vil være nødvendigt at undersøge indflydelsen af ​​disse faktorer på sammenhængen mellem SNP og risikoen for EF.

Støtte oplysninger

Information S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0090491.s001

(DOC)

Tak

Vi vil gerne takke Dr. Judith A. Stærk, Institut i anæstesiologi, Univerisity af Cincinnati College of Medicine for hendes kommentarer /forslag i udarbejdelsen af ​​manuskriptet.