PLoS ONE: opregulering af miR-96 Forbedrer Cellular spredning af prostata cancer celler gennem FOXO1

Abstrakt

afvigende ekspression af miR-96 i prostatakræft er tidligere blevet rapporteret. Imidlertid rolle og virkningsmekanisme af MIR-96 i prostatacancer ikke er blevet bestemt,. I denne undersøgelse blev de diagnostiske og prognostiske egenskaber af MIR-96 ekspressionsniveauer undersøgt ved QRT-PCR i to veldokumenterede prostatakræft kohorter. MIR-96 ekspression blev fundet at være signifikant højere i prostatacancerpatienter og korrelerer med WHO grad, og faldt samlet overlevelsestid; patienter med lave niveauer af miR-96 levede 1,5 år længere end patienter med høje miR-96 niveauer. Det terapeutiske potentiale blev yderligere undersøgt in vitro, som viser, at ektopiske niveauer af MIR-96 øger vækst og cellulær proliferation i prostatacancerceller, hvilket indebærer, at MIR-96 har onkogene egenskaber i denne indstilling. Vi viser, at MIR-96-ekspression reducerer Transcript og proteinniveauer af FOXO1 ved binding til en af ​​to forudsagte bindingssteder i FOXO1 3’UTR-sekvensen. Blokering dette bindingssted fuldstændigt hæmmede væksten enhancement transporteres af MIR-96. Dette fund blev bekræftet i en stor ekstern prostatacancer patient kohorte hvor miR-96 udtryk omvendt korreleret til FOXO1 udtryk. Tilsammen indikerer disse resultater, at MIR-96 spiller en central rolle i prostatacancer cellulær proliferation og kan forbedre prostatakræft progression. Denne viden kan udnyttes til udvikling af nye terapeutiske redskaber til prostatakræft

Henvisning:. Haflidadóttir BS, Larne O, Martin M, Persson M, Edsjö A, Bjartell A, et al. (2013) opregulering af miR-96 Forbedrer Cellular spredning af prostata cancer celler gennem FOXO1. PLoS ONE 8 (8): e72400. doi: 10,1371 /journal.pone.0072400

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: 17. april, 2013; Accepteret: 10. juli 2013; Udgivet: 12. august 2013 |

Copyright: © 2013 Haflidadóttir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen ført til disse resultater har modtaget støtte fra den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7 /2007-2013) under tilskudsaftale n ° 201.438, det svenske forskningsråd, Gunnar Nilssons Cancer Foundation, Jeanssons fundament og Gyllenstiernskanska Krapperups fundament. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige kræftform i europæiske og nordamerikanske mænd og en af ​​de vigtigste årsager til kræft dødsfald [1]. Mens begrænset til prostata kirtlen er canceren hærdes ved enten prostatektomi eller strålebehandling [2]. Når tumoren skrider frem, vil man udvikle de evner til at invadere omgivende væv, inducerer angiogenese, og metastaserer. Androgen deprivationsbehandling, enten kemisk eller kirurgisk kastration, er guld standard behandling for avanceret PCa. Denne behandling option resulterer i signifikant klinisk regression i næsten alle patienter [3,4]. Men de fleste af tumorerne bliver kastrationsresistent og genoptager væksten inden 12-18 måneder og for tilbagevendende tumorer findes kun palliative behandlinger. For at overleve og genoptage vækst i et androgen forarmet omgivende, skal cellerne enten tilpasser androgen receptor (AR) pathway eller inducere alternative overlevelse og vækst pathways. Mekanismer underliggende tilpasning af AR kan forøges ekspression af AR, øget lokal produktion af androgener, overfølsomhed eller konstitutivt aktive trunkerede former af AR, promiskuitet, og /eller ligand uafhængig aktivering via kinase krydstale. I PCa dereguleret microRNA (miRNA) ekspression er blevet rapporteret [5-7] og miRNA menes at bidrage til tumorudvikling gennem inddragelse i celleproliferation, apoptose, invasion, metastase og kastration modstand indtræden [revideret i 8-10]. Vi og andre har tidligere vist, at MIR-96 niveauer opreguleres i PCa [5,7,11], og at det også i høj grad udtrykkes i flere andre typer cancer, herunder lymfom, lever, bryst, ovarie, lunge, colon, testikel og kolorektal cancer [5,12]. MIR-96 er blevet foreslået at virke som en oncomiR regulerer celleproliferation og DNA-reparation [13], men også som en tumorsuppressor inducere apoptose i pancreasceller [14]. I brystcancer, MIR-96 fremmer celleproliferation ved at målrette tumorsuppressorgenet Forkhead box O transskriptionsfaktor, FOXO3a og cyclin-afhængige kinaseinhibitorer p27

Kip1 og p21

Cip1 [15]. MIR-96 har også vist sig at målrette FOXO1 i endometrial [16], bryst [17], hepatocellulære cancerceller [18] og Hodgkin lymfom [19]. Forkhead box O proteiner FOXO1, FOXO3a, FOXO4, og FOXO6 er transkriptionsfaktorer involveret i biologiske processer, såsom DNA-skader reparation [20], cellecyklus [21,22] og apoptose [21,23]. Den FOXO1 tumor suppressor er placeret på 13q41, et område, der ofte slettes i PCa og andre kræftformer, og både nuklear FOXO1 og transkriptniveauer har vist sig at være nedsat i PCa [24,25]. Phosphatase og tensin homolog (PTEN) er ofte tabt i prostatakræft [26,27], som også ville føre til tab eller nedsat funktion af nedstrømseffektorer såsom FOXO1 [21]. FOXO1 har vist sig at forbedre apoptose [17,21] og nedgang proliferation [17,21]. I PCa celler specifikt FOXO1 inducerer apoptose og cellecyklusstop [21,28], og har også vist sig at være en del af en regulerende feedback-sløjfe med AR i PCa. FOXO1 undertrykker både androgen-afhængige og androgen-uafhængige aktivitet af AR [24,29,30], og AR inhiberer DNA-bindingsaktivitet af FOXO1 ved dannelse af en protein-protein-kompleks med FOXO1, som gør FOXO1 stand til at inducere apoptose og celle cellecyklusstandsnings [30].

Derfor har vi den hypotese, at i PCa, mIR-96 virker som en oncomiR, påvirker tumorudvikling. I denne undersøgelse blev de prognostiske egenskaber af MIR-96 analyseret i to kohorter af PCA patienter og udtrykket korreleret til kliniske parametre. Effekten af ​​miR-96 på cellevækst og proliferation blev vurderet

in vitro

FOXO1 blev identificeret som et direkte mål for miR-96 i PCA celler.

Materialer og Metoder

Etik erklæring

Etisk godkendelse for alle prøver, der er beskrevet er indhentet fra “regionala etikprövningsnämnden i Lund” (den lokale Etisk Review Board i Lund, Sverige), godkendelse #: LU909-03 og personoplysningerne anonyme. Den etiske komité frafaldes behovet for skriftligt samtykke og på deres forslag information om forskning, som indeholder anvisninger fravalg proceduren blev offentliggjort i alle større lokale aviser. Vi overholder erklæringen fra Helsinki og databeskyttelsesdirektivet.

Patientprøver

Kohorte 1, beskrevet tidligere [31,32], og i tabel S1, blev anvendt til at analysere miR-96-ekspression . Den består af vævsprøver indsamlet fra transuretral resektion af prostata (turps), indsamlet 1990-1999 i Malmö, Sverige. Kort fortalt blev materialet fikseret i 4% bufret paraformaldehyd og paraffinindlejret. Prøverne blev gradueret ifølge WHO standard og diagnosen var baseret på histopatologisk diagnose i tilfældigt udvalgte sager med tegn på prostata adenokarcinom i 50 patienter og benign prostatahyperplasi (BPH) (det vil sige ingen tegn på PCA) i en anden 25 mænd. Tilstedeværelsen af ​​PCa og vurdering af beløbet (%) af kræftceller blev gjort ved hjælp sektioner støder op til dem, der anvendes for miRNA analyser [31]. One (1/50) kræft prøve blev ikke fundet at indeholde PCa i den tilstødende sektion og blev udelukket fra den endelige datasæt. Aldersgruppen på tidspunktet for TURP var 63-89, med et gennemsnit på 76 år for mænd diagnosticeret med kræft, og 56-86, med et gennemsnit på 71 år for mænd med BPH. Kohorte 2 består af 93 formalin fast paraffin indlejrede (FFPEs) væv fra radikale prostatektomi, gradueret ifølge WHO og Gleason. Prøverne blev udtaget på Malmø Hospital 1999-2002 og er beskrevet i tabel S2. Aldersgruppen på tidspunktet for prostatektomi var 48-73 med et gennemsnit på 62 år. Passende etiske godkendelser er opnået fra den etiske komité, Lunds Universitet, og vi har levet op til Helsinki-erklæringen.

Cell kultur og transfektion

PCA cellelinjer 22Rv1, LNCaP klon FGC, DU145 og PC3 blev opnået fra American Type Culture Collection og VCap og PNT2 cellelinier blev opnået fra European Collection of Cell Culture. Cellerne blev dyrket i overensstemmelse med leverandørens anbefalinger. Celler blev transient transficeret med miRIDIAN microRNA Mimic (C-300.514 til 07, 80 nm sonde, Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE) og parallelt; celler blev transficeret med miRIDIAN microRNA Mimic negativ kontrol (KN-001000-01-05). For at hæmme endogene miR-96, blev cellerne transficeret med miRCURY LNA-hæmmere (100 nM probe, Exiqon A /S, Vedbæk, Danmark), miR-96 inhibitor (kat. Nr. 410.467 til 00) og parallelt med Negative Control A (kat . nr. 199.004 til 00). Celler blev transficeret ved hjælp Oligofectamin reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Isolering af RNA

RNA isoleret fra PCA og BPH vævsprøver i kohorte 1 er tidligere beskrevet [31]. Kort beskrevet RNA blev ekstraheret fra 20 um sektioner af 75 formalinfikseret paraffinindlejret (FFPEs) prostata vævsprøver. Små RNA’er ekstraheret med en let modificeret protokol mirVanaTM miRNA Isolation Kit (Ambion); prøverne blev deparaffinised af xylen behandling og fordøjes af protease før den organiske ekstraktion. Efter vaskning af filtret, der indeholder små RNA blev prøverne DNase behandlet (RECOVERALL, Ambion) og vasket igen. I kohorten 2 blev totalt RNA ekstraheret fra prostatavæv kerner (1-4 mm). Totalt RNA blev ekstraheret ifølge en modificeret protokol af

mir

Vana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) som beskrevet i Hagman et al. [31]. Alle RNA-koncentrationer blev målt ved anvendelse af en NanoDrop (ND-1000, Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific Inc.). RNA-ekstraktion fra 27 humane væv af forskellig oprindelse har tidligere [33] blevet beskrevet. Fra cellelinierne blev totalt RNA isoleret ved anvendelse af Trizol reagens ifølge producentens anvisninger (Invitrogen), og behandlet med DNase (Promega Biosciences, San Luis Obispo, CA). RNA-koncentrationen blev målt under anvendelse af en NanoDrop. Til ekstern validering af sammenhængen mellem miR-96 og FOXO1 transkriptniveauer analyserede vi en ekstern microarray datasæt fra Taylor et al. udgør 110 prostatakræft vævsprøver og 28 ikke-maligne tilstødende godartede prostata vævsprøver [34] (GEO tiltrædelse nummer GSE21036).

Reverse transskription reaktion og QRT-PCR

De miRNA niveauer blev kvantificeret ved TaqMan Micro-RNA assays protokol (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner med mindre ændringer. Kort fortalt blev 5 eller 10 ng små RNA’er omvendt transkriberet med MIR-96 specifikke primere (Assay nr. 000.186). RT produkt blev amplificeret i 10 pi reaktioner ved QRT-PCR i 384-brønds plader på et 7900 HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Prøverne blev kørt i firdobbelte, og kvantificering blev udført ved den sammenlignende Delta Ct metode. Log

2-transformerede værdier blev normaliseret ved at dividere med det geometriske gennemsnit af de 3 husholdning generne RNU48, RNU66 og U47 i studiet af patientprøver. I undersøgelsen af ​​miR-96-ekspression i væv fra forskellige human oprindelse og PCa cellelinjer det geometriske gennemsnit af RNU48 blev RNU66, RNU24 og RNU44 brugt. Ekspressionen af ​​FOXO1 (primer: Hs01054576m1) i cellelinier og efter MIR-96 overekspression i 22Rv1 celler, blev gennemsnittet af GAPDH (Hs02758991_g1), og PGK1 (Hs9999906) anvendt som kontrol. Disse husholdning gener tjente også som kontrol for RNA integritet. Sammen med revers transkription og QRT-PCR, en intet enzym negative kontrol, og en ingen skabelon kontrol blev kørt for at udelukke PCR kontaminering og genomisk DNA.

Cell nummer og cellevækst

Cell nummer blev talt i triplikater prøver transficeret med mIR-96 mimic sammenlignet med en negativ kontrol på fire tidspunkter, 2, 3, 4 og 5 dage efter transfektion. Cellerne blev trypzinised og talt på en Bürkner kammer. Sulforhodamin B (SRB) assay blev anvendt til måling af cellevækst indirekte ved farvning det totale indhold af celler transficeret med MIR-96 efterligner protein sammenlignet med celler transficeret med den negative kontrol. Celler blev fikseret i iskold 10% trichloreddikesyre og farvet med 0,4% SRB (S9012-5G fra Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) i 1% eddikesyre i 15 minutter. Ubundet SRB blev vasket af med 1% eddikesyre. Bundet SRB blev opløst i 10 mM Tris-base, og absorbansen blev aflæst ved 490 nm under anvendelse ELx808 IU Ultra Microplate Reader (Biotek Instruments, Inc., Winooski, VT). Celler transficeret med MIR-96 efterligner blev høstet 72-120 timer efter transfektion blev DU145 celler høstet 72 timer efter transfektion PC3-celler 96 timer, og 22Rv1 celler 120 timer efter transfektion.

Celleproliferation

Celler transficeret med mIR-96 eller den negative kontrol (in triplo) inkuberedes med 5-brom-2 deoxyuridin (BrdU, GE healthcare, Wauwatausa, WI) ved en fortynding på 1: 1000 i normalt vækstmedium. Efter 1 time blev cellerne trypsiniseret, vasket med PBS og talt i en Bürkner kammer. Cellerne blev fikseret i iskold 70% ethanol. Fikserede celler blev inkuberet med 2 M HCl indeholdende 0,2 mg /ml pepsin i 20 minutter for at fordøje de celleproteiner. Efter vask blev prøverne inkuberet med blokeringsbuffer (1% BSA, 0,5% Tween-20 i PBS). Prøverne blev inkuberet med Alexa Fluor® 488 mærket BrdU muse monoklonalt antistof (Klon MoBU-1) (Kat. Nr. B35139 fra Invitrogen) i en koncentration 1:60 i blokerende puffer og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time under forsigtig blanding. Prøver blev vasket med PBS og inkuberet med 5 pi af 7-AAD cellelevedygtighed Solution (kat. Nr. 559.925, BD, Franklin Lakes, NJ) i PBS, i mørke natten over ved 4 ° C. Cellerne blev analyseret på en CyFlow ® Space PARTEC flowcytometer.

Western blot

Proteinlysater af tre biologiske tredobbelte blev høstet ved hjælp af M-PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Pierce Scientific, Thermo Fisher Scientific Inc.) suppleret med Halt

TM Protease inhibitor cocktail (1: 100), (Thermo Fisher Scientific Inc. Kat nr 87.785..) og 0,5 mM EDTA. Proteinkoncentration blev målt på NanoDrop og samme mængde protein prøver blev læsset på en NuPAGE

®Novex 4-12% Bis-Tris færdigstøbte geler (kat. Nr. NP0321BOX, Life Technologies, Carlsbad, Californien). Proteinerne blev overført til en Immobilon

®-P Transfer Membrane, PVDF (kat. Nr. IPVH00010, EMD Merck Millipore Corporation, Billerica, MA). Membranerne blev inkuberet med FOXO1 (C29H4), kanin-monoklonalt antistof i en koncentration 1: 500 (# 2880, Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA). GAPDH (GAPDH, muse monoklonalt, MAB374, Merck Millipore, Billerica, MA), blev anvendt som indlæsning kontrol. Signaler fra HRP koblede antistoffer blev genereret ved ECL

TM Prime Western Blotting Detection Reagent (RPN2232 fra GE Healthcare) og detekteret ved anvendelse af et CCD-kamera (LAS-3000, Fujifilm, Tokyo, Japan) og ChemiDoc ™ MP Imaging System (Bio -Rad Laboratories, Hercules, CA). Båndintensiteter blev kvantificeret under anvendelse ImageJ software og normaliseret til GAPDH.

målsted blokkere Salg

Der er to forudsagte bindingssteder for MIR-96 i FOXO1 3 ‘utranslaterede region (3’UTR) hos placering 264-271 og 2139-2146 (Targetscan Menneske, Frigivelse 6.2, juni 2012). Målsted blokkere blev designet til at binde til de forudsagte bindingssteder og flere baser på begge sider af bindingsstederne (fig S1). BLO_FOXO1_miR96-1: TTACT + TCAC + GGT + TTGAGTG og BLO_FOXO1_miR96-2: CTTGAAC + CAC + GGT + TTCATGA. Den + er foran “Locked Nucleic syrer” (LNA

TM) i DNA-sekvenser (Exiqon A /S, Vedbæk, Danmark). Målstedet blokkere blev co-transficeret med MIR-96 mimic (100 nM) i tre forskellige koncentrationer, 300 nM, 600 nm eller 1 uM. Proteinniveauer af FOXO1 blev kvantificeret under anvendelse af western blot analyse. Væksten blev målt ved hjælp af SRB-analysen efter transfektion med miR-96 efterligner og 600 nm af target websted blokkere.

Statistisk analyse

Resultaterne blev analyseret ved hjælp af Graphpad Prism 5 og statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af uparret , to-halet t-test, medmindre andet er anført, og p 0,05 blev betragtet som signifikant. Cuzick trend test blev anvendt til at analysere udviklingen i miR-96-ekspression i WHO I, II og III i kohorte 1. Til overlevelsesanalyse en Log-rank (Mantel-Cox) test blev anvendt. Spearman rang korrelation blev brugt til at analysere sammenhængen af ​​miR-96 udtryk for de PSA niveauer i patient kohorte 1 og de FOXO1 niveauer i den eksterne datasæt.

Resultater

miR-96 udtryk korrelerer med kliniske parametre

niveauerne af mIR-96 har tidligere vist sig at være signifikant højere i PCa væv end i de ikke-PCA væv i kohorte 1 [11]. Her, de prognostiske egenskaber af MIR-96, målt ved QRT-PCR på RNA ekstraheret fra FFPE prostatavæv, blev undersøgt. De kliniske karakteristika for kohorte 1 er blevet grundigt beskrevet tidligere [31,32], men en kortere version kan ses i tabel S1. Vi fandt miR-96 niveau til at være lavest i BPH (ikke-PCA) og øger med højere WHO grad, medianen miR-96-ekspression i BPH = 0,1150, HVEM I = 0,1368, WHO II = 0,1767, WHO III = 0,2969 (p medianen miR-96-ekspression i WHO I = 1,620, WHO II = 1,610, WHO III = 2,205. Der er kun seks mænd i WHO I gruppen, men hvis WHO I og II kombineres, MIR-96 niveauer i WHO III er signifikant højere (p = 0,0414) (Figur 1B). Kliniske karakteristika kohorte 2 er vist i tabel S2. Øget MIR-96-ekspression korrelerer med øgede PSA niveauer i patientprøver i kohorten 1 (figur 1C). En Kaplan-Meier analyse af patientens samlede overlevelse i kohorte 1 blev gjort på grundlag af miR-96 ekspressionsniveauerne. Laveste udtryk kvartal sammenlignet med høj ekspression i tre fjerdedele af de patientprøver, opdeler betydeligt PCA patienter i høj risiko (median overlevelse på 3 år) og patienter med lav risiko (median overlevelse på 4,5 år) (p = 0,0389, log-rank test ), med en hazard ratio på 2,2 (95% CI 1,040-4,463), se figur 1D. Da kohorte 2 er en nyere kohorte en analyser med overlevelse som endepunkt ikke er muligt endnu.

A. miR-96 ekspression i patientprøver i kohorte 1 er lavest i BPH (ikke-PCA) prøver og stiger markant med højere WHO grad i PCA prøver (Cuzick trend test p 0,0001). Når BPH prøverne er udelukket, at stigningen i de PCA prøverne alene er stadig signifikant (Cuzick trend test, p = 0,0498). B. I kohorte 2, miR-96 udtryk er væsentligt højere i PCA patienternes prøver med sortering WHO III sammenlignet med patientprøver med sortering WHO I og WHO II kombineret (t-test p = 0,0414). C. Øget PSA niveauer korrelerer med øgede miR-96 ekspressionsniveauerne i patientprøver i kohorte 1 (p = 0,0002, Spearman r = 0,4528). D. Kaplan-Meier-kurve viser overlevelse i forhold til MIR-96-ekspression i kohorte 1. Patienten gruppe med høj MIR-96 niveauer (optrukket linje) har median overlevelse på 3 år og gruppen med lave MIR-96 niveauer (stiplet linje) har median overlevelse på 4,5 år. Hazard ratio er 2.2. X-aksen viser tiden i år, og Y-akserne viser procentvise overlevelse (Log rank (Mantel-Cox) test p = 0,0389).

miR-96-ekspression i væv og cellelinier

mIR-96-ekspression blev målt i vævsprøver af forskellig oprindelse og i seks PCA cellelinier (22Rv1, LNCaP, VCAP, DU145, PNT2 og PC3). I vævsprøverne blev høj MIR-96-ekspression påvist i epididymis, blod, binyrerne og prostata. Niveauerne i PCA-cellelinjer var højere end i den normale prostata, med det højeste udtryk i PC3 og lavest i DU145 celler (figur 2).

MIR-96 ekspressionsniveauer i humane vævsprøver (sorte bjælker ) og PCA cellelinier (stribede søjler) blev målt ved QRT-PCR og normaliseret til det geometriske gennemsnit af RNU48, RNU66, RNU24 og RNU44. Højeste udtryk blev set i cellelinjer og prostata (pil) havde høj ekspression i forhold til andre væv.

miR-96 øger celle nummer og cellevækst i PCA celler gennem cellulær proliferation

Vi fortsatte med at undersøge den biologiske rolle miR-96 i PCA celler

in vitro

. Ektopisk ekspression af MIR-96 i forskellige prostatacancer-cellelinier forøget cellevækst som målt ved en SRB-assay; i DU145-celler (p = 0,0006), 22Rv1 celler (p = 0,0061) og PC3-celler (p = 0,0211) (figur 3A, B og C henholdsvis). Det skal imidlertid bemærkes, at inhibering MIR-96 med miRCURY LNA inhibitorer i DU145, PC3 eller 22Rv1 resulterede ikke i ændringer i cellevækst som målt ved SRB (data ikke vist). Virkningen af ​​MIR-96 på cellevækst svarede til en virkning på celle antal DU145 celler, som målt ved celletælling. Den ektopiske ekspression af MIR-96 øger den celleantal fire (p = 0,0316) og fem (p = 0,0396) dage efter transfektion (figur 3D). Dette blev vist at skyldes en stigning i proliferation, som en ektopisk ekspression af MIR-96 signifikant forøgede BrdU inkorporering i DU145 sammenlignet med den negative kontrol (p = 0,0091) (figur 3E). Vi har ikke registrerer et markant skift i celler i G1, G2 eller S-fasen mellem cellerne transficeret med miR-96 og den negative kontrol.

Ektopisk udtryk for miR-96 stiger cellevækst i PCA celler. A. DU145-celler (p = 0,0006). B. 22Rv1 celler (p = 0,0061). C. PC3-celler (p = 0,0211). Væksten blev målt ved anvendelse af et SRB-assay. D. Ektopisk udtryk for miR-96 stiger celle nummer i DU145 celler fire (p = 0,0316) og fem (p = 0,0396) dage efter transfektion. E. Proliferation signifikant forøget i DU145 celler efter overekspression af MIR-96 (p = 0,0091), målt ved anvendelse af BrdU-inkorporering og 7-AAD på et flowcytometer. Middelværdien er repræsenteret ved en lodret linje og fejlsøjler viser standardafvigelse middelværdi. Resultater blev analyseret under anvendelse af uparret, to-halet t-test.

MIR-96 overekspression nedsætter FOXO1 mRNA og protein niveauer

Som det er blevet vist i andre typer cancer som miR -96 kan regulere FOXO1 niveauer og FOXO1 er blevet beskrevet at inhibere proliferation dette ville forklare den proliferative fænotype af mIR-96. Vi har derfor sat sig for at undersøge effekten af ​​miR-96 om FOXO1 i PCA celler. Først undersøgte vi de endogene FOXO1 niveauer i prostata cellelinier. Den højeste udtryk for FOXO1 blev fundet i 22Rv1 og PC3 og lavest i DU145 celler (Fig. 4A). Vi valgte 22Rv1, LNCaP og DU145 som modelsystemer. Overudtrykker MIR-96 reducerede signifikant FOXO1 proteinniveauer i 22Rv1 celler (p = 0,0065), LNCaP-celler (p = 0,0030) og DU145 celler (p = 0,0082) (fig. 4B). De FOXO1 niveauer er også faldet på MIR-96 overekspression i VCap celler (p = 0,0096), selv om de endogene niveauer af FOXO1 er lave i denne celletype (fig. 4B). Da den faldende effekt af miR-96 på FOXO1 var mest udtalt i 22Rv1 celler, besluttede vi at undersøge FOXO1 transskription niveau i denne cellelinie. Vi fandt, at MIR-96 overekspression signifikant sænket FOXO1 mRNA-niveauer i 22Rv1 celler (p = 0,0341) (fig. 4C). Dette var dog ikke så udtalt som effekten på protein niveauer, hvilket indikerer, at miR-96 handler både ved at forringe FOXO1 udskrift og blokere protein translationelle. FOXO1 indeholder to

i silico

forudsagt bindingssteder for miR-96 (fig. 5A). For at undersøge om MIR-96 binder direkte til begge disse sider, den virkning at blokere hver af de to forudsagte bindingssteder blev analyseret under anvendelse målstedet af blokkere er specielt udformet til hver bindingssted (fig. S1) og co-transficeret med MIR-96 efterligner i 22Rv1 celler. Anvendelse af anti-FOXO1 antistof og sammenligning af båndintensiteter til GAPDH, blev ingen signifikant stigning i FOXO1 proteinniveauet observeret, når den forudsagte bindingssted 96.1 blev blokeret, (figur 5B). Imidlertid proteinniveauet væsentligt større, når det andet bindingssted, blev 96,2 blokeret, anvendelse af 6-fold koncentration af blokerings sammenlignet med MIR-96 efterligner (figur 5C). Dette indikerer, at virkningen af ​​MIR-96 var afhængig af adgang til det andet sted for at kunne sænke FOXO1 niveauer. Det skal bemærkes også, at når begge mål sites blokkere blev kombineret effekten var tabt. Reguleringen af ​​FOXO1 blev yderligere bekræftet i en ekstern datasæt på 110 PCA patienter og 28 ikke-maligne godartede prostata vævsprøver [34], var miR-96 udtryk omvendt korrelerer til ekspression af FOXO1 i prostatakræft vævsprøver de (p = 0,0193 , Spearman, r = -2228) og i ikke-maligne vævsprøver (p = 0,0029, Spearman, r = -0,5424) separat, såvel som når alle prøver er kombineret (p = 0,0013, Spearman, r = -0,2717) (figur 6).

A. Endogene FOXO1 mRNA-niveauer i PCA-cellelinjer. mRNA-niveauer blev målt ved QRT-PCR og normaliseredes til middel af GAPDH og PGK1. B. FOXO1 proteinniveauer er signifikant reduceret i 22Rv1 celler (p = 0,0065), LNCaP-celler (p = 0,0030), DU145 celler (p = 0,0082) og VCAP celler (p = 0,0096) ved MIR-96 overekspression. Prøverne viser biologiske tre eksemplarer og FOXO1 protein niveauer blev normaliseret til GAPDH protein niveauer. C. FOXO1 mRNA-niveauer er faldet betydeligt i 22Rv1 celler efter overekspression af miR-96 (p = 0,0341). Målt ved QRT-PCR og normaliseredes til middel af GAPDH og PGK1. Fejl søjler viser standardafvigelse af middelværdien.

A. Der er to forudsagte MIR-96 bindingssteder i FOXO1 3’UTR-sekvensen. Frøene region af det modne MIR-96 og de forudsagte bindingssteder i 3’UTR-sekvensen er understreget og fed. Placeringer af bindingssteder ifølge Targetscan, (Release 6.2, juni 2012). B. 22Rv1 celler blev co-transficeret i tre eksemplarer med MIR-96 mimic og et målområde blocker for bindingssted 96,1 i tre koncentrationer. FOXO1 proteinniveauet ikke stige, når bindingssted 96.1 blev blokeret. C. Blokering bindingssted 96,2 med 6x koncentrationen af ​​målstedet blokker sammenlignet med miR-96 mimic resulterede i en signifikant stigning i FOXO1 proteinniveau (p = 0,0118). FOXO1 protein niveauer blev normaliseret til GAPDH. Fejl søjler viser standardafvigelse af middelværdien.

FOXO1 mRNA niveauer omvendt forhold til miR-96 ekspressionsniveauerne i en ekstern datasæt [34]. Datasættet indeholder 110 PCA vævsprøver og 28 ikke-maligne godartet prostata vævsprøver (GEO tiltrædelse nummer GSE21036) (p = 0,0013; Spearman r = -0,2717)

Effekten af ​​miR-96 på. cellevæksten medieres af FOXO1

Vi næste satte sig for at undersøge, om FOXO1 er det vigtigste mål at formidle den vækstfremmende miR-96 fænotype i prostata celler. Interessant, ved at blokere den anden MIR-96 bindingssted (96,2) i FOXO1 3’UTR-sekvens med målstedet blocker, MIR-96 er ikke længere i stand til at forøge væksten af ​​DU145 celler som målt ved en SRB-assay (figur 7). Dette styrker den hypotese, at virkningen af ​​MIR-96 om cellevækst udelukkende fremmes gennem FOXO1. Blokering af første miR-96 bindingssted ikke sænke væksten markant hvilket yderligere bekræfter den konstatering, at miR-96 bruger den anden miR-96 bindingssted at hæmme FOXO1.

MIR-96 øger væksten i DU145 celler betydeligt (p = 0,0005). Blokering andet MIR-96 bindingssted (96,2) i FOXO1 3’UTR-sekvens med et målområde blocker helt eliminerer virkningen af ​​MIR-96 om cellevækst (p = 0,002). Blokering første MIR-96 bindingssted (96,1) ikke inhiberer virkningen af ​​MIR-96 om cellevækst. Cellevækst blev målt ved anvendelse af et SRB-assay. Den gennemsnitlige repræsenteres af en lodret linje og fejl søjler viser standardafvigelse af middelværdien.

Diskussion

er blevet opdaget Høje niveauer af miR-96 i prostatacancer [5,7, 11] og flere studier indikerer vigtigheden af ​​mIR-96 i prostatakræft progression. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at øget MIR-96 ekspressions associerede med progression af PCa som Mir-96 ekspression øges med øget WHO grad i kohorten 1. Dette ses ikke i kohorte 2, som er en mere homogen kohorte af radikaler udgør af 63% WHOII. Endvidere er den samlede overlevelse er betydeligt kortere i de patienter, der har de højeste MIR-96 niveauer. Dette er også blevet vist for MIR-96-ekspression i lungekræft patienttumorceller og serumprøver. MIR-96 ekspressionsniveauet korrelerer med dårlig postoperative overlevelse [35].

In vitro

, finder vi, at overekspression af miR-96 i PCA cellelinjer resulterer i øget vækst og spredning, hvilket yderligere bekræfter inddragelse af miR-96 i PCa progression. Få mål for miR-96 er blevet identificeret som forklarer effekten af ​​miR-96 på PCA celler. I endometrie [16], bryst [17] og hepatocellulær cancer [18], har MIR-96 vist sig at målrette tumor suppressor FOXO1. FOXO1 er blevet rapporteret at være nedsat i PCa [24,25], og hæmning af miR-96 kan bidrage til dette. Her identificerer vi FOXO1 som et mål for MIR-96 i fire forskellige PCA cellelinier med både høje endogene FOXO1 niveauer (22Rv1) samt lave endogene niveauer (VCap), hvilket indikerer, at MIR-96 er en potent hæmmer af FOXO1 proteinproduktion. Vores data indikerer, at reguleringen sker på både transkriptionelle og translationelle niveau, som mRNA og til endnu højere grad proteinniveauet blev berørt. At den vigtigste regulering sker på translationel niveau kunne være én forklaring på, at ekspressionsniveauerne af miR-96 og FOXO1 mRNA i prostata cellelinjer positivt korreleret med de laveste niveauer i DU145 og med højeste udtryk for begge fundet i PC3 celler. Hypotetisk tendensen svarer til mængden af ​​MIR-96 nødvendig i hver celletype for at opretholde lave FOXO1 proteinniveauer. MIR-96 har vist sig at nedsætte mRNA-niveauet af FOXO1 betydeligt i hepatocellulære carcinomceller og mindske proteinniveauer lidt [18]. Her, vi viser i et PCA cellelinje 22Rv1, at MIR-96 kun binder til det andet af de to forudsagte bindingssted (96,2) i 3’UTR af FOXO1. I modsætning hertil blev MIR-96 regulering i brystcancerceller vist at være afhængige af adgang til begge bindingssteder [17].