PLoS ONE: Expression af Aquaporin 5 (AQP5) Fremmer Tumor Invasion i Human Ikke småcellet Cancer

Abstrakt

De aquaporiner (AQP) er vand kanal proteiner spiller en stor rolle i transcellulær og transepitel vand bevægelse. For nylig er rollen som AQPs i human carcinogenese blevet et område af stor interesse. Her, ved immunhistokemi (IHC), har vi fundet et udtryk for AQP5-protein i 35,3% (IHC-score: ≥1, 144/408) af de resektion NSCLC vævsprøver. Sager med AQP5-positive status (IHC-score: ≥2) viste en højere tumor tilbagefald end negative i NSCLC (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005) og værre sygdomsfri overlevelse (p = 0,033; OR = 1,52; 95% CI: 1,04-2,23). Yderligere

in vitro

invasion under anvendelse BEAS-2B og NIH3T3 celler stabilt transficeret med overekspression konstruktioner for fuld længde vildtype-AQP5 (AQP5) og dens to mutanter, N185D som blokerer membran menneskehandel og S156A som blokerer fosforylering på Ser156 viste, at AQP5 induceret celle invasioner mens begge mutanter ikke gjorde. I BEAS-2B-celler, ekspression af AQP5 forårsagede en spindel-lignende og fibroblastisk morfologisk forandring og tab af celle-celle-kontakter og cellepolaritet. Kun celler med AQP5, ikke en af ​​de to mutanter, udviste et tab af epitel cellemarkører og en gevinst på mesenchymale cellemarkører. I en menneskelig SH3-domæner proteinarray, cellulære ekstrakter fra BEAS-2B med AQP5 viste en robust bindingsaktivitet til SH3-domæner af c-Src, Lyn, og Grap2 C-terminal. Endvidere i immunpræcipitationsassay, aktiveret c-Src, phosphoryleret på Tyr416, viste en stærkere bindingsaktivitet til cellulære ekstrakter fra BEAS-2B med AQP5 sammenlignet med N185D eller S156A mutant. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse ikke viser tegn på genomisk forstærkning, hvilket tyder AQP5 udtryk som en sekundær begivenhed. På baggrund af disse kliniske og molekylære observationer, konkluderer vi, at AQP5 gennem sin fosforylering på Ser156 og efterfølgende interaktion med c-Src, spiller en vigtig rolle i NSCLC invasion, og derfor kan give en unik mulighed for at udvikle et nyt terapeutisk mål samt som en prognostisk markør i NSCLC

Henvisning:. Chae YK, Woo J, Kim MJ, Kang SK, Kim MS, Lee J, et al. (2008) Ekspression af Aquaporin 5 (AQP5) Fremmer Tumor Invasion i Human Ikke småcellet lungekræft. PLoS ONE 3 (5): e2162. doi: 10,1371 /journal.pone.0002162

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, USA

Modtaget: 9. januar 2008; Accepteret: 13 Mar 2008; Udgivet: May 14, 2008

Copyright: © 2008 Chae et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af den SPORE tilskud P50 CA96784-01 (til CM), Cancer Research Grant fra Pyung-Ya Foundation (til CM), og KOSEF forskningsbevilling R01-2004-000-10670-0 og Korea Research Foundation tilskud KFR- 2004-041-E00064 (til SJJ)

Konkurrerende interesser:. DS er en betalt konsulent til Cangen Bioteknologi

Introduktion

De aquaporiner (AQP) repræsenterer en familie af. transmembrane vand kanalproteiner bredt fordelt i forskellige væv i hele kroppen og spiller en stor rolle i transcellulær og transepitel vandbevægelse [1], [2]. Hidtil har mindst ti distinkte AQPs været præget på mennesker, og der har været en stigende forståelse af deres roller i menneskelig [2] patofysiologi. Men først for nylig har data dukket op på den rolle, som de menneskelige AQPs (hAQPs) som et af de centrale elementer er direkte involveret i human carcinogenese [3]. Ekspression af hAQP1 ofte relateret til coloncancer, pancreascancer, hjernetumor, renalcellecarcinom, og mikrokar af (MM), parallelt angiogenese [4] – [8]. Ligeledes ekspression af AQP5 blev øget i bugspytkirtelkræft og ovariecancer [7], [9]. Desuden har vi tidligere rapporteret induktion af AQP5 ekspression i sin meddelelse under udvikling den tidlige tyktarmskræft [5].

På det funktionelle plan er AQP1 vist sig at være en af ​​de forsinkede tidlige respons gener og også involveret i celle migration, og angiogenese [10], [11], og udtryk for AQP1, AQP3 og AQP5 blev induceret under lymfocytaktivering [12]. Tidligere har vi fremlagt beviser for nye onkogene egenskaber AQP1 og dens udtryk i resektion vævsprøver fra ikke-småcellet lungekræft. Yderligere bevis af den rolle, AQP5 i human carcinogenese blev også leveret af vores gruppe [13], [14]. Ektopisk udtryk for AQP5 i NIH3T3 celler induceret mange fænotypiske ændringer karakteristisk for transformation både

in vitro

in vivo

ved at fremme signalveje aktiveret gennem Ras, som er fremkaldt af fosforylering af PKA konsensus webstedet af AQP5.

i denne undersøgelse undersøgte vi rolle AQP5 i lungekræft. AQP5 blev valgt på grundlag af en række undersøgelser: For det første viste vores forundersøgelse, som blandt AQP1, 3, og 5, viste AQP5 den mest robuste onkogent potentiale i NIH3T3 cellelinje. For det andet, selv om både AQP1 og AQP5 viste onkogen ejendom med NIH3T3- cellelinje, AQP5 udtryk fremkaldt ERK aktivering [13], mens AQP1 udtryk ikke [15]. Tredje, ekspressionen af ​​AQP5, ikke AQP1, eller AQP3, blev fundet at være forbundet med Ras /ERK /Rb pathway aktivering i colon cancercellelinier og var forbundet med levermetastaser hos patienter med tyktarmskræft [16]. Vi har tidligere demonstreret ekspressionen af ​​AQP1 i humane primære lungecancer væv; 18 ud af 44 prøver af ikke-småcellet lungekræft patienter viste positiv AQP1 proteinekspression. Det er imidlertid blevet vist, at AQP5 viste mere robust onkogent potentiale end AQP1 samt AQP3 i blød agar-assay, fokus dannelse assay og celleproliferation (MTT) assay [13] – [15], hvilket fører os til at vælge AQP5 for dens rolle i lunge carcinogenese ikke kun for klinisk validering studie, men også for studier i de underliggende molekylære mekanismer.

Her præsenterer vi både molekylære og kliniske beviser for, at AQP5 kan spille en rolle i udviklingen af ​​ikke-småcellet lungecancer (NSCLC). Første, baseret på immunhistokemisk analyse af hAQP5 med 408 NSCLC væv, har vi undersøgt, om ekspressionsprofil af AQP5 i human lungecancer korrelerer med sygdomsprogression og overlevelse. Derefter har vi foretaget invasion assay og epithelial-mesenchymal overgang markør undersøgelse i humane bronkiale epitelceller overudtrykker AQP5 versus dens mutanter foruden mock kontrol, efterfulgt af yderligere molekylær interaktionsundersøgelser at belyse AQP5 medieret vej. Desuden blev FISH-analyse udført for at identificere molekylære mekanismer underliggende hAQP5 udtryk.

Metoder

Cell kultur

Alle cellelinier blev opnået fra American Type Tissue Collection (Rockville, MD ). Den murine fibroblastcellelinie NIH3T3 blev dyrket i DMEM i nærværelse af 10% FBS. Den normale lungecellelinjen BEAS-2B blev dyrket i LHC-9-medium i nærvær af 0,5 ng /ml rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF), 500 ng /ml hydrocortison, 0,005 mg /ml insulin, 0,035 mg /ml oksehypofyseekstrakt , 500 nM ethanolamin, 500 nM phosphoethanolamin, 0,01 mg /ml transferrin, 6,5 ng /ml 3,3 ‘, 5-triiodthyronin, 500 ng /ml epinephrin, 0,1 ng /ml retinsyre (Clonetics Corporation, Walkersville, MD). Alle celler blev dyrket i 5% CO

2 balanceret luft ved 37 ° C.

plasmidkonstruktioner og produktion af stabile cellelinier

humant cDNA fra HEK 293 blev amplificeret ved polymerase-kæde (PCR) under anvendelse af primere til vildtype AQP5 (AQP5) og derefter indsat i EcoRI og Xhol-stedet i pcDNA 3.1 (+). Kloner blev bekræftet ved restriktionsanalyse og ved DNA-sekventering af begge strenge. Serin 156 eller asparagin 185 blev erstattet med alanin eller asparaginsyre, henholdsvis ved PCR-baserede mutagenese for at fremstille S156A eller N185D AQP5 mutant baseret på AQP5 pcDNA3.1 konstrukt som tidligere beskrevet [13]. AQP5 WT og to mutanter blev indsat i EcoRI og BamHI-stederne i p3XFLAG-CMV-14 (SIGMA) og verificeret ved DNA-sekventering af begge strenge af mutanterne. Ekspressionskonstruktioner blev transficeret ind NIH3T3 og BEAS2B celler med FuGENE 6 ifølge producentens anbefalinger. Alle transfektanter blev selekteret med 800 ug /ml G418 i 3 uger og udvalgte kloner blev screenet med Western blot ved anvendelse af AQP5 antistof og /eller RT-PCR. Når konfluerende, blev celler subdyrket ved trypsinisering (0,05% trypsin, 0,53 mM EDTA i Hanks ‘balancerede saltopløsning). De billeder, der viser morfologier af forskellige stabile celler, der udtrykker forskellige konstruktioner blev truffet gennem fasekontrast mikroskopi (ECLIPSE TE300, Nikon Co, Tokyo, Japan).

Invasion assay

Matrigel invasion assay var udført med NIH3T3 og BEAS2B celler. BioCoat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA), der genopretter den basale membran blev købt til at vurdere celleinvasion. 24-brønds vævskulturplade skær overtrukket med Matrigel blev re-hydreret i 2 timer i 37 ° C medier. Medier (0,6 ml) indeholdende 5% kalvefosterserum blev tilsat til hver plade samt en kemoattraktant, og 0,2 ml (2 × 10

4 celler) cellesuspension blev tilsat til hver indsats. Efter inkubation i 24 timer blev ikke-invaderende celler fjernet fra den øvre side af membranen ved at skrubbe. At minimere virkningen af ​​celleproliferation på invasionen assay har vi bekræftet, at i de første 24 timer, BEAS-2B celler undergår minimal celledeling og udviser ikke nogen mærkbar forskel i celleproliferation mellem celler, der udtrykker AQP5 og celler, der udtrykker mock vektor (fig. S1). Invasion af celler til undersiden af ​​Matrigel-coatede membran blev påvist ved farvning af cellerne med Mayers hematoxylin-opløsning og visualisere cellerne under mikroskop. Efter farvning blev cellerne talt under et mikroskop i fire tilfældigt udvalgte felter (forstørrelse x 100) og resultaterne blev udtrykt i form af et søjlediagram. Assays blev udført med tre fordybninger for hver tilstand.

immunblotting og immunfældning

Lysater fra dyrkede celler og væv blev fremstillet i iskold NP-40 lysisbuffer (10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 137 mM NaCl, 10% glycerol og 0,1% Nonidet P-40) indeholdende en inhibitor cocktail af 10 mM β-glycerolphosphat, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 10 mM NaF, 10 mM Na-orthovanadat, 4,5 U /ml aprotinin ( Sigma) og 1 ug /ml leupeptin (Sigma). Råprotein lysater (30 ug) blev separeret ved 12% SDS-PAGE (BioRad), overført til nitrocellulosemembraner (BioRad), og blokeret i 1 time med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand med 0,05% Tween 20. Den følgende kommercielle antistoffer blev anvendt til Western blot-analyse: anti-AQP5 (1:200, Alpha Diagnostic), anti-α-catenin antistof (1:1000, Cell Signaling) anti-γ-catenin antistof (1:1000, Cell Signaling) , anti-fibronectin-antistof (1:1000, Cell Signaling), anti-vimentin antistof (1:1000, Cell Signaling), anti-E-cadherin antistof (1:1000, Cell Signaling), anti-c-Src antistof (1 :1000, Cell Signaling), anti-phospho Src antistof (1:1000, Cell Signaling), anti-Lyn antistof (1:1000, Cell Signaling), anti-grap2 antistof (1:1000, Cell Signaling), og anti β actin antistof (1:5000; Sigma). Phospho-Src antistof blev første gang brugt; blots blev derefter strippet og re-blottet med anti-src og beta-actin-antistoffer. Passende anti-kanin- og anti-muse peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (1:3000; Amersham) blev anvendt. Immunoreaktive bånd blev påvist ved forøget kemiluminescens (Pierce).

SH3 domæne bindende

TranSignal SH3 domæne vifte III spottet med peptider, der repræsenterer 34 forskellige menneskelige SH3 domæner herunder Grb2 og Src, blev købt fra Panomics og testet for deres binding til AQP5 segmenter og AQP5 WT opretholdelse naturlige topologi ifølge producentens anvisninger. De SH3 domæne-holdige proteiner på arrayet blev spottet in duplo. Kort beskrevet membranfiltre inkuberet med 30 pg /ml protein natten over. Efter vask binding protein blev visualiseret ved inkubation med HRP-konjugeret His antistof eller FLAG-antistof. Denne analyse blev udført mindst to gange med hvert protein.

Protein identifikation og samspil

For pull-down-analyser, GST fusionsproteiner (SH3 domæne-holdige proteiner) og GST blev købt fra Panomics. Celler blev lyseret i NP-40 lysispuffer, og lysater blev derefter inkuberet med enten GST eller GST-fusionsprotein ved 4 ° C i 2 timer, efterfulgt af tilsætning af 20 pi glutathion-Sepharose 4B-perler. Efter 30 minutters blanding blev perlerne vasket fire gange. Proteiner blev elueret i Laemmli-prøvepuffer og analyseredes ved SDS-PAGE efterfulgt af immunblot med viste antistoffer.

kræftvæv microarray

Tissue microarrays (TMAS) blev konstrueret ved anvendelse formalin-fikseret, paraffin- indlejrede væv af 419 NSCLC opnået fra Institut for Patologi for Asan Medical center under godkendelsen af ​​det indre Review Board (IRB nummer: 2006-0019). De lunge prøver blev opnået fra 1996 til 1999. Den oprindelige H E farvede objektglas blev gennemgået af undersøgelsens patologer og repræsentative områder af hver tumor blev array til de triplikerede blokke for at minimere tabet væv og overvinde den heterogenitet af tumorerne

.

Immunhistokemi

immunofarvningen procedurer blev udført ved anvendelse af Benchmark automatiske immunfarvning anordning (Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) med affinitetsoprenset ged antistof rejst mod den 19-aminosyresekvens (aa 251- 269) af det COOH-terminalen af ​​human AQP5 (Alpha Diagnostic, San Antonio, Texas) ved en fortynding på 1:50. Tissue Array sektioner (4 um tykke) blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i graduerede alkoholer og behandlet med 3% hydrogenperoxid i methanol ved stuetemperatur til blokering af endogen peroxidaseaktivitet. Den AQP5 antistof blev visualiseret under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-teknikken (DAKO LSAB kit, DAKO Cytomation, Carpinteria, CA) og efterfulgt af kromogen påvisning med diaminobenzidin (DAB). Negative kontroller blev udført ved at udelade det primære antistof inkubation trin.

Scoring af immunhistokemi

Immunfarvning på TMA’er blev gradueret semikvantitativt overvejer både farvning intensitet og procentdelen af ​​positive tumorceller ved to studie patologer (SJJ og MJK) blindet for de clinicopathologic variabler. Den farvningsintensitet blev scoret på en skala fra fire kvaliteter: 0, ingen farvning af cancerceller; 1, svag farvning; 2 moderat farvning; 3, stærk farvning. Procentdelen af ​​farvede tumorceller blev gradueret på en skala fra 2 kvaliteter: 0, 10% og 1, 10%. AQP5 ekspression i kræftvæv blev defineret som positiv, når produktet af intensiteten score ved procentvise score er 1 eller mere. Både histologiske type og kvalitet blev bekræftet på hæmatoxylin og eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

AQP5 overekspression er forbundet med dårligere prognose i NSCLC

En væsentlig ekspression af AQP5-protein blev observeret i 16,9% (69/408) af NSCLC TMA prøver (immunfarvning score på 2+; defineret som positiv) (tabel 1, fig 1A). Som vist i figur 1A, kun cancerceller, ikke tumorinfiltrerende lymfocytter viste AQP5 ekspression. Herunder sager med svag udtryk (immnunostaining score på 1+), det var så højt som 35,3% (144/408, tabel 1). Interessant nok blev AQP5 overekspression observeret, overvejende lunge adenocarcinomer (p 0,001, tabel 2). Imidlertid blev ingen andre statistisk signifikant korrelation fundet i NSCLCs mellem AQP5 ekspression og demografiske og patologiske faktorer, såsom alder, køn, histologisk differentiering, og tumor fase (tabel 2). På grund af den utilstrækkelige stikprøvestørrelse på metastatiske tilfælde (n = 4), ikke yderligere statistisk sammenhæng undersøgelse om metastaser blev udført.

mikrofotografier af AQP5 immunfarvning i array af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) væv. Eksempler på svag (1), moderat (2), og stærke (3) immunoreaktivitet i NSCLCs (a til c, henholdsvis) Original forstørrelse × 200. (B) Kaplan Meier Curve i NSCLC patienter. AQP5-positive tilfælde viste en mindre gunstig sygdomsfri overlevelse (log rank p = 0,011) end AQP5-negative sager.

Til vores overraskelse, sager med AQP5-positive status vises en højere tumor tilbagefald end negative i NSCLC (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005). Selvom AQP5 overekspression ikke var statistisk signifikant relateret med total overlevelse, bemærkelsesværdigt, dem med NSCLC viste en værre sygdomsfri overlevelse sats (log rank test, p = 0,011) (fig. 1B). Selv efter justering for histologisk kvalitet og tumor fase blev AQP5 overekspression i NSCLC stadig signifikant associeret med tidligere sygdomsprogression (p = 0,033, OR = 1,52; 95% CI: 1,04-2,23). Derfor AQP5 status synes at være en uafhængig molekylær markør forbundet med dårligere kliniske resultater.

Menneskelig AQP5 fremmer celle invasion

Fra vores kliniske resultater, vi har en hypotese, at AQP5 kan fremkalde celle invasion, en nødvendigt skridt for tumormetastase. For at undersøge, om AQP5 overekspression fremmer celleinvasion i humane bronchiale epitelceller og, samtidig, at fastslå, hvilke komponenter af AQP5-protein spiller en rolle i processen, vi først udført Matrigel invasion assay i BEAS-2B-cellelinier stabilt udtrykker AQP5 og dens to mutanter, N185D som blokerer membran menneskehandel og S156A som blokerer phosphorylering på S 156 site af AQP5 molekyle [13], [14], [17]. Interessant celler med AQP5 demonstrerede den højeste grad af celleinvasion blandt fire grupper (fig. 2A, 2C). Selvom højere end mock, graden af ​​celleinvasion i celler med N185D og S156A mutanter var tydeligt mindre end den for celler med AQP5 (fig. 2A, 2C). Disse resultater antyder, at både membranøs ekspression af AQP5 og dets phosphorylering på S 156, PKA konsensus site, er vigtige for AQP5 induceret celleinvasion i BEAS-2B-celler. For at udelukke, at dette fænomen er ikke enestående for humane bronchieepithelceller, vi udførte den samme assay ved hjælp af musen fibroblast NIH3T3 cellelinier, der blev transficeret med samme ekspressionskonstrukter [13], og har observeret lignende fund (fig. 2B, 2D) .

Matrigel invasion assay blev udført med hver af BEAS-2B-celler (A, C) og NIH3T3-celler (B, D), der udtrykker AQP5 eller hver af to mutanter. AQP5 induceret cellemigration og invasion i BEAS-2B, immortaliserede humane bronkiale epitelceller samt NIH3T3-celler. I modsætning hertil begge N185D mutant (forringet membran handel) og S156A mutant (forringet fosforylering ved Ser 156 af PKA) Fremkald ikke celle migration og invasion i enten BEAS-2B celler eller NIH3T3 celler i forhold til Mock.

AQP5 udtryk fører til fibroblastlignende morfologisk ændring i bronchiale epitelceller

Vi så, besluttet at vurdere eventuelle morfologiske ændringer ledsaget af AQP5 overekspression. De morfologier af BEAS-2B humane bronchieepithelceller bærer enten mock vektor FLAG eller FLAG /AQP5 blev undersøgt ved fasekontrastmikroskopi. Som forventet viste mock transficerede BEAS-2B-celler stærkt organiseret celle-til-celle adhæsion og vedligeholdes cellepolaritet, hvilket er den typiske morfologi af normale epitelceller (fig. 3). Imidlertid er ekspressionen af ​​AQP5 forårsagede en markant spindel-lignende og fibroblastisk ændring i cellemorfologi og tab af celle-til-celle-kontakt og cellepolaritet (fig. 3). Disse morfologiske ændringer kan betyde, at AQP5 spiller en rolle i epitel-mesenkymale overgang (EMT).

morfologier af BEAS-2B humane bronchieepithelceller udtrykker mock vektor FLAG eller FLAG /AQP5 blev afsløret ved fasekontrast mikroskopi. BEAS-2B celler opretholdt meget organiseret celle-til-celle adhæsion og cellepolaritet som en typisk epithelmorfologi. Ekspressionen af ​​AQP5 forårsagede en spindel-lignende og fibroblastisk morfologi og tab af celle-celle-kontakter og cellepolaritet. Scale barer, 50 um.

AQP5 udtryk er forbundet med molekylære markører for epitelial-mesenkymale overgang

For at bekræfte, om AQP5 virkelig fremkalder EMT i humane bronchieepithelceller, vi udførte Western blot-analyse til at kontrollere proteinmarkører for EMT. Notatet blandt BEAS-2B celler som stabilt udtrykker AQP5 (klon # 1 og # 2), N185D, S156A mutanter og mock vektor, kun celler, der udtrykker AQP5 udstillet et tab af epitelial cellemarkører, såsom E-cadherin, α catenin og γ catenin, og en gevinst på mesenchymale cellemarkører, herunder fibronectin og vimentin (fig. 4). Både ændringer i morfologien og den molekylære profil AQP5 overudtrykker celler tydelige beviser, at AQP5 stimulerer bronchiale epitelceller til at undergå EMT.

Ekspression af epiteliale proteiner, herunder E-cadherin, α-catenin og γ-catenin, og mesenchymal proteiner, herunder fibronectin og vimentin blev undersøgt ved immunoblotting i de fire separate BEAS-2B-celler, som hver især bærer overekspression konstrukt for AQP5 (klon # 1 og # 2), N185D, S156A og Mock. Kun celler med AQP5 udstillet et tab af epitel markører og en gevinst på mesenkymale cellemarkører. 1, AQP5 klon # 1; 2, AQP5 klon # 2; 3, N185D; 4, S156A; 5, Mock baseret på BEAS-2B-cellelinier.

AQP5 interagerer med c-Src, en potent EMT trigger

Derefter undersøgte vi den mulige molekylære mekanisme bag EMT fremme ejendom af AQP5. Human AQP5 bærer en diproline peptidsekvens (RTSPVGSP) i sløjfen D [18], [19], som bærer en sekvenslighed med SH3 bindende konsensus site. Således er det muligt, at dette segment af AQP5 kan binde med SH3 domæne af et adaptormolekyle [18]. Derfor udførte vi et humant SH3 domæner Proteinarray at undersøge potentialet af flere SH3 domæne indeholdende proteiner til at binde til human AQP5. Især den rensede AQP5 fra stabile BEAS-2B celler viste bindingsaktivitet til SH3 domæne af c-Src, Lyn, og Grap2 C-terminale (figur 5A). Den AQP5 segment indeholdende en phosphoryleret Loop D (88 aa gennem 182 aa) var også i stand til at binde SH3 domæne af c-Src, Lyn, og Grap2 C-terminal (fig. 5A). Den AQP5 segment indeholdende en ikke-phosphoryleret Loop D, var imidlertid ikke i stand til at binde til eventuelle SH3 domæner fra tre proteiner (fig. 5A). Phosphoryleringsstatussen af ​​hvert protein blev yderligere bekræftet.

(A) En human SH3 domæner Proteinarray blev anvendt til at undersøge de potentielle bindingsaktiviteter af flere SH3 domæne-holdige proteiner til AQP5. Ikke kun AQP5, men også AQP5 segment indeholdende en phosphoryleret Loop D (88 aa gennem 182 aa) sig at binde til SH3 domæne af c-Src, Lyn, og Grap2 proteinet. Den AQP5 segment indeholdende en ikke-phosphoryleret Loop D, var imidlertid ikke i stand til at binde til SH3-domænet af nogen af ​​disse proteiner. (B) GST pull-down assay blev udført med tre forskellige GST-fusionsproteiner: en c-Src SH3 domæne, et Lyn SH3 domæne og et C-terminalt Grap2 SH3 domæne-protein. Celler, der stabilt udtrykker AQP5 i humane bronkiale epitelceller, BEAS-2B, afslørede en stærk interaktion med c-Src SH3 domæne-protein, Lyn SH3 domæne protein og C-terminale Grap2 SH3 domæne-protein. (C) AQP5 er co-immunpræcipiteret med c-Src i BEAS-2B-celler stabilt transficeret med AQP5 ekspressionskonstruktionen. Desuden er det kun en aktiveret form af C-Src, phosphoryleret på Tyr 416, er co-immunpræcipiteret med AQP5. 1, Mock; 2, N185D; 3, S156A; 4, AQP5; M, molekylvægt markør.

Derudover har vi udført en GST pull-down assay til at verificere en direkte interaktion mellem AQP5 og Src familie molekyler. I dette assay anvendte vi tre forskellige GST-fusionsproteiner: en c-Src SH3 domæne, et Lyn SH3 domæne og et C-terminalt Grap2 SH3 domæne-protein, som blev identificeret til at interagere med AQP5 i SH3 domæne proteinarrays. I overensstemmelse med resultatet fra SH3 domæne proteinarrays, AQP5 stabilt udtrykt i BEAS-2B humane bronkiale epitelceller udviste en stærk interaktion med c-Src, Lyn og C-terminale Grap2 SH3 domæne proteiner (fig. 5B).

Endelig at bekræfte vores konklusion

in vivo

, udførte vi en immunpræcipitationsassay i human bronchial epitelcellelinje, BEAS-2B. Denne gang har vi fokuseret på c-Src, et molekyle kendt for sin EMT fremme aktivitet [20]. Som forventet AQP5 co-immunpræcipiteret med c-Src i celler, der stabilt udtrykker AQP5 (fig. 5C). Interessant nok c-Src co-immunprecipitated med AQP5 viste sig at være en aktiveret form af C-Src, som er phosphoryleret i Tyr416 (fig. 5C). Vi bemærker også, at celler, der udtrykker AQP5 mere har aktiveret c-Src end celler, som bærer N185D eller S156A mutant (fig. 5C), hvilket tyder på, at interaktionen med AQP5 kan være et vigtigt skridt i aktivering c-Src.

AQP5 overekspression kan ikke være forbundet med genomisk forstærkning

for at belyse de molekylære mekanismer bag AQP5 overekspression, har vi undersøgt forekomsten af ​​genomisk forstærkning gennem FISH-analyse. Ud af 69 fortolkelige tilfælde af NSCLC TMAs, ikke en eneste klart mønster af genomisk amplifikation blev detekteret (fig. S2), hvilket antyder, at ektopisk ekspression af AQP5 kunne være en sekundær molekylær begivenhed.

Diskussion

Vi har tidligere påvist, at overekspression af AQP5 i musefibroblaster, NIH3T3-celler, inducerer celleproliferation sekundært til aktiveringen af ​​Ras, der er medieret af phosphorylering af AQP5 i sin PKA konsensus websted (s 156), og denne undersøgelse klart billede af en associering mellem AQP5 og Ras signaltransduktionsvej [13], [14]. Derudover har vi for nylig rapporteret en undersøgelse, som beskriver en induceret ekspression af AQP5-protein i colorektale carcinogenese og molekylære veje hvordan AQP5 proteinekspression kan påvirke tyktarmskræft udvikling ved dets interaktion med Ras /ERK /Rb-signalvejen [16].

i modsætning til disse tidligere rapporter, her, vi har forfulgt rolle AQP5 på progression af NSCLC. Dette er delvis baseret på vores forudgående rapport, som ikke kun viste onkogene tilhører AQP1 i NIH3T3 celler, men også beskrevet udtrykket profil AQP1 i NSCLC [15]. Denne rapport, selvom forudsat vis indsigt om rolle AQPs i NSCLC, viste ikke hverken dets kliniske konsekvenser eller beslægtede molekylære veje. I vores forundersøgelse for AQP5 i NSCLC, bemærkede vi en række AQP5 udtryk i flere NSCLC cellelinjer, herunder H1975, H1838, H1650, H1437, og H838. Desuden ligner vores observationer med NIH3T3 muse fibroblastceller [13], [14], har vi for nylig identificeret, at AQP5 overekspression i BEAS-2B-celler inducerer aktivering af ERK-vejen, der fører til stimulering af celleproliferation (Kang et al., manuskript under udarbejdelse); humane bronkiale epitelceller stabilt transficeret med AQP5 demonstrerede signifikant højere proliferationshastighed end celler stabilt transficeret med mock (fig. S1). Baseret på disse foreløbige resultater og tidligere observationer, vi havde med AQP1 i NSCLC og AQP5 i kolorektal cancer studie har vi undersøgt udtrykket profil AQP5 i et stort panel af kliniske prøver.

Mens udtryk for AQP5 i dens budskab niveau er rapporteret i visse dele af normal menneskelig bronchiale og alveolære væv [21], indtil videre, AQP5 udtryk profiler i NSCLC vævsprøver i sin proteinniveau, er ikke blevet rapporteret. For at finde kliniske implikationer af AQP5 overekspression i NSCLC, har vi samlet resektion humane NSCLC væv med et gennemsnit på fem års follow-up, som vi udførte immunkemi at undersøge protein udtryk niveau AQP5. Mens vi fundet AQP5 udtryk i kræftceller, ser vi ikke nogen beviser for AQP5 immunoreaktivitet blandt tumor-infiltrerende lymfocytter, hvilket er i strid med vores tidligere resultater, der viser en induceret udtryk for AQP5 meddelelser under lymfocytter aktivering [12]. Selv om denne uoverensstemmelse kan være et resultat af flere årsager, er det muligt, at AQP5 ekspression under lymfocytaktivering kan være en midlertidig begivenhed og at når lymfocytter aktiveres, kan de nedregulerer AQP5 ekspression.

Vi har identificeret tre interessant udtryk profiler af AQP5-protein i NSCLC med klinisk korrelation. Først er et udtryk for AQP5 protein bemærket i 35,3% (144/408, tabel 1.) af de resektion NSCLC vævsprøver. For det andet, NSCLC tilfælde med AQP5-positive status vises en højere tumor tilbagefald end negative (54,7% vs. 35,1%, p = 0,005). For det tredje blev AQP5 overekspression i NSCLC signifikant associeret med tidligere sygdomsprogression (p = 0,033; OR = 1,52; 95% CI 1,04-2,23) og værre sygdomsfri overlevelse. Vi mener, at dette er den første klinisk evidens indikerer en stærk sammenhæng mellem AQP5 udtryk og resultatet af kræftpatienter, der blev opereret, og videre tyder på, at hAQP5 er en potentiel uafhængig prognostisk markør.