PLoS ONE: homeostatiske Vedligeholdelse af allel-specifikke p16 Methylering i cancerceller Ledsaget af Dynamic Focal Methylering og Hydroxymethylation

Abstrakt

Formål

P16

Methylering ofte forekommer i carcinogenese. Selv om det er blevet en hypotese, at de

P16

methylering dynamisk holdes i kræftceller, har direkte dokumentation for denne hypotese ikke været tilgængelige indtil nu.

Metoder

En fusion celle model blev etableret som omprogrammeres den native DNA methylering mønster af cellerne. status methylering af de

P16

alleler blev derefter gentagne gange kvantitativt analyseret i fusion monoklonale, forældrenes cancer cellelinjer (

P16

-Helt methyleret AGS og umethyleret-MGC803), og HCT116 ikke- fusion celle under anvendelse DHPLC og bisulfit sekventering. Histon methylering blev analyseret under anvendelse kromatin immunopræcipitation (chip) -PCR. P16 udtryk status blev bestemt ved anvendelse af immunfarvning og RT-PCR.

Resultater

status methylering for størstedelen af ​​den

P16

alleler blev stabilt opretholdt i det monoklonale fusion celler efter op til 60 passager. Vigtigst var omdrejningspunkt de novo methylering, demethylering, og hydroxymethylation konsekvent observeret inden for omkring 27% af de

p16

alleler i fusion monoclones, men ikke de homozygot methylerede eller umethylerede stamcellerne. Endvidere subkloner af de monoclones konsekvent fastholdt samme

p16

methyleringsmønster. Et lignende fænomen blev også observeret ved anvendelse af

p16

hemi-methylerede HCT116 ikke-fusion cancercellelinie. Interessant nok blev transskription ikke observeret i

P16

alleler, der blev hydroxymethyleret med en antisense-streng-specifikke mønster. Også, blev niveauerne af H3K9 og H3K4 trimethylation i fusion celler sig at være lidt lavere end forældrenes AGS og MGC803 celler.

Konklusion

Den nuværende undersøgelse giver den første direkte beviser bekræfter, at methylering af

P16

CpG øer er ikke kun homeostatically opretholdes, men også ledsaget af en dynamisk proces med forbigående omdrejningspunkt methylering, demethylering, og hydroxymethylation i kræftceller

Henvisning:. Qin S, Li Q, Zhou, J., Liu ZJ, Su N, Wilson, J., et al. (2014) homøostatiske Vedligeholdelse af allel-specifikke

p16

Methylering i cancerceller Ledsaget af Dynamic Focal Methylering og Hydroxymethylation. PLoS ONE 9 (5): e97785. doi: 10,1371 /journal.pone.0097785

Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA

Modtaget: Februar 6, 2014 Accepteret den 22. april 2014 Udgivet: May 14, 2014

Copyright: © 2014 Qin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation of China [Grant 31261140372 og 81171900], National Basic Research Program Kina [Grant 2011CB504201 og 2010CB529303], og Beijing Natural Science Foundation of China [Grant 7.122.033]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dajun Deng er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

DNA methylering anses for at være en af ​​de mest stabile epigenetiske modifikationer i pattedyr. De methylering af celledifferentiering relaterede gener er blevet vist at være yderst dynamisk under kimcelle og præimplantationsperioden udvikling, men bliver relativt statisk under udviklingen af ​​somatiske væv [1] – [3]. I modsætning hertil methylering af værten tilpasningsrelaterede gener forbliver dynamiske i somatiske væv for at muliggøre korrekt respons på miljømæssige faktor eksponering og efterfølgende patogenese [4] – [6]. Hydroxymethylation af DNA er tæt involveret i ændring gen methylering status og har vist sig at ikke kun spille en nøglerolle i DNA-demethylering, men også tjene mange af sine egne funktioner [7], [8].

Tumor suppressor P16 kodet af INK4 /ARF locus inden humant kromosom 9p21 er en cellecyklus regulator involveret i inhibering af G1 → S faseovergang gennem P16-CDK4 /6-RB pathway [9]. Den locus transkriptionelt stumme i embryonale stamceller, og spiller en hastighedsbegrænsende rolle i omprogrammering af inducerede pluripotente celler [10]. Selvom en 9p21 fragment sletning er den hyppigste genetiske ændring findes i alle kræftformer [11], hypermethylering af CpG øer er stadig den vigtigste mekanisme til p16 inaktivering i flere humane kræftformer [12] – [14]. Faktisk har en række kohorte undersøgelser vist, at p16 methylering forekommer tidligt i carcinogenese og har vist sig at øge risikoen for malign transformation af epitelial dysplasi [15] – [21]. Selvom der ikke er etableret den forårsagende rolle p16 methylering i carcinogenese, tyder stærkt på, at p16 methylering kan bidrage væsentligt til udviklingen af ​​kræft og kunne udvikles til en potentiel biomarkør [4]. Selvom p16 methylering er en af ​​de mest undersøgte epigenetiske ændringer, dets stabilitet i cancerceller og mekanismen hvorigennem den holdes endnu ikke afklaret [22] – [26]. En detaljeret forståelse af vedligeholdelsen maskiner involveret i DNA-methylering er et kritisk trin for udviklingen af ​​methylering biomarkører og epigenetisk interventionsterapi.

Forekomsten af ​​p16-methylering i humane kronisk gastritis væv er stærkt korreleret med Helicobacter pylori infektion, og faldt dramatisk efter H. pylori eradiation, hvilket tyder på, at de fleste methyleret P16 alleler ikke kan være stabil [27], [28]. I modsætning hertil p16-methylering i dyrkede normale celler og cancerceller er sandsynligvis meget stabil, da det effektivt blev udvundet efter DNA-methyleringsinhibitor (5-aza-CdR) blev fjernet [29]. Imidlertid reaktivering af methylering lyddæmpet gener blev observeret i en vis del af de DNA methyltransferase inhibitor-behandlede celler. Det er svært at udelukke, at den observerede bedring af p16 methylering resultater fra et udvalg fordel til celler, der ikke undergår P16 reaktivering /demethylering under hæmmer behandling. Derudover er det for nylig blevet rapporteret, at methylerede CpG sites inden for p16 CpG-øer er hovedsageligt placeret i p16 exon-1 kodende nukleosomal region i humane gastritis læsioner og strække sig ind 5’UTR og promotor nukleosomale regioner under udviklingen af ​​gastriske carcinomer [26]. Disse resultater tyder på, at fuldt methyleret P16 alleler kan være mere stabil end de fokalt denatureret alleler; dog bør denne hypotese testes yderligere under anvendelse af monoklonale celler indeholdende p16 alleler med forskellige mønstre for methylering, herunder fokal methylering.

Cellefusion er blevet anvendt til at undersøge mekanismerne bag gentransskription regulering og DNA-methylering ændring [24], [30]. For at etablere en celle model indeholdende forskellige p16 mønstre for methylering, blev en gastrisk cancercellelinie med helt methyleret p16 (AGS) kombineret med en p16-aktiv gastrisk cancercellelinie (MGC803) gennem cellefusion. Dernæst blev disse fusionsceller klonet og subklonet før distributionen af ​​methylerede og hydroxymethyleret bindingssteder for CpG i p16 CpG-øer blev karakteriseret. status methylering af de fleste P16 alleler i fusion celler forblev den samme som stamcellerne. Lave niveauer af fokal de novo methylering, demethylering, og hydroxymethylation blev også observeret i fusion celler; Imidlertid blev disse ændringer fundet at være instabile begivenheder. Et lignende fænomen blev også observeret ved anvendelse af p16 hemi-methylerede cellelinie HCT116. Disse resultater indikerer, at methylering af CpG-øer P16 homeostatically fastholdes i cancerceller. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, der tyder på, at status methylering af CpG øer homeostatically opretholdes i kræftcellerne ikke undergår differentiering.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig gastrisk cancercellelinie MGC803 blev dyrket i RPMI 1640 medium med 10% FBS. AGS blev dyrket i F12-medium med 10% FBS. MGC803 [31] og AGS (ATCC CRL-1739) cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af Prof. Yang Ke ved Peking University Cancer Hospital og Institute. HCT116 celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Yuanjia Chen, Peking Union Hospital (ATCC CCL-247), og blev dyrket i RPMI 1640-medium med 10% FBS.

Generation af de stabile fusion cellekloner

pBabe-puro (hygromycinresistens) og pIRES2-EGFP (neomycin /G418-resistens) vektorer blev transficeret til AGS og MGC803 celler, henholdsvis anvendelse af LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, 11.668-027) ifølge producentens anvisninger. Puromycin (puromycin

r + -AGS) og G418 (neomycin

r + -MGC803) selektion blev udført på AGS og MGC803 cellelinjer, efterfulgt af dyrkning i F12 medium med 10% FBS og puromycin (0,25 ug /ml) og RPMI 1640 medium med 10% FBS og neomycin (700 ug /ml), hhv. Sammensmeltningen blev udført ved anvendelse PEG8000 som tidligere [32] beskrevne. Efter fusion blev cellerne dyrket i selektionsmedium indeholdende både neomycin (700 ug /ml) og puromycin (0,25 ug /ml). Efter udvælgelse, individuelle kolonier blev mono-klonet, og efter tre runder af efterfølgende kloning, blev der opnået fem monoclones. To af de fem monoclones blev valgt til yderligere mono-kloning.

Mikrosatelliter

D9S974

D9S1749

analyse

Primeren sæt til

D9S974 Hotel (forstand, 5′-gagcc tggtc tggat cataa-3 ‘; antisense, 5′-aagct tacag aacca gacag-3’) og

D9S1749

(forstand, 5′-aggag agggt acgct tgcaa-3 ‘antisense, 5′-tacag ggtgc gggtg cagat aa-3’) blev anvendt til at opformere

p16 Salg alleler (Figur S1A). Genotyper af de micorsatellites blev analyseret ved 80 ° C ved DHPLC anvendelse af en UV-detektor (260 nm) som tidligere beskrevet [33].

Karyotype-analyse

En 25-cm kolbe ved 60% celle konfluens blev behandlet med 0,2 ug /ml colchicin i 4 timer. Celler blev isoleret efter trypsinisering og behandling med 75 mmol /l KCl-opløsning i 25 min. Cellerne blev fikseret (3:01 methanol: eddikesyre)., Og farvet med Giemsa farve

DNA-fremstilling, bisulfit og TAB behandling

Genomisk DNA blev ekstraheret fra vævsprøver med phenol /chloroform . Prøverne blev behandlet med 5 mol /l natriumbisulfit i 16 timer ved 50 ° C [34]. For 5hmC analyse blev genomisk DNA behandlet ved anvendelse af TAB Kit ifølge producentens specifikationer (WiseGene, Cat # K001) [35].

hydroxymethyleret DNA-specifik immunpræcipitering (hMeDIP)

Genomisk DNA blev sonikeret i 200 bp til 600 bp fragmenter under anvendelse Bioruptor sonikator (Diagenode). 100 ng sonikerede DNA blev gemt som input kontrol. Hver prøve bestod af 1 ug sonikerede DNA fortyndet i IP buffer og inkuberet med 4 pi anti-hydroxymethylcytosine (5hmC) antistof (Active Motif) ved 4 ° C natten over. De antistof-DNA-komplekser blev indfanget under anvendelse af protein A /G beads derefter oprenset. PCR blev kørt på alle prøver ved hjælp 35 cyklusser med primerne 5′-agtcct ccttc cttgc CAAC-3 ‘og 5′-tccga gcact tagcg aatgt g-3’. Umethylerede cytosin, 5-methylcytosin, og 5hmC DNA-fragmenter blev anvendt som PCR for at verificere 5hmC berigelse.

kromatin-immunopræcipitation (chip) assays

Niveauer af histon modifikationer H3K9me3 og H3K4me3 blev bestemt ved hjælp af chip assays som beskrevet [36].

PCR amplifikationer

392 bp amplikon af antisense-strengen af ​​

p16

exon-1 blev forstærket med CpG-fri primersæt (sense, 5′-ttttt agagg atttg aggga Tagg-3 ‘; antisense, 5′-ctacc taatt CCAAT tcccc tacaa acttc-3’) som beskrevet [37]. Den 588 bp amplikon af antisense-streng af det

p16

exon-1 og promotoren blev amplificeret under anvendelse af sMSP primersæt (sense, 5′-ctacct aattc caatt cccct aca-3 ‘; antisenses, 5’ CCAAT tcccc tacaa acttc g-3 ‘, 5′-CCAAT tcccc tacaa acttc atcct ccaaa ATCG-3′ og 5’-CCAAT tcccc tacaa acttc atcct ccaaa atcac CCG-3 ‘) [26]. Den 369 bp af sense-strengen af ​​

p16

exon-1 blev amplificeret med CpG-free primersæt (sense, 5′-gttgt agatt tttta tttat ttgga t-3 ‘; antisense, 5’ tcccc ttacc taaaa aaata cc-3 ‘) ved annealingstemperatur 56 ° C. De 284 bp og 346 bp amplikoner af antisense-strenge i

p16

exon-2 og intron-2 blev henholdsvis forstærket med CpG-fri primer sæt (forstand, 5′-tggta ggtta tgatg atgggt ag- 3 ‘, antisense, 5′-aacat aatta ctacc tctaa taccc c-3′) og (forstand, 5’-tttgt gggtt tgtag aagta ggtat g-3 ‘; antisense, 5′-cctaa tccaa caact AATCC actac c-3’) ved annealingstemperatur 57 ° C.

Methylering kvantificering af CpG øer ved hjælp DHPLC

392 bp, 369 bp, 284 bp, 346 bp PCR-produkter forstærkes af universelle primere blev separeret ved hjælp af WAVE DNA fragment analysesystem med en fluorescens (FL) -detector (Transgenomic, Inc., OM, USA) ved 57,6, 55,0, 58,0, og 57 ° C, henholdsvis [37], [38]. WAVE-HS1 FL-farvestof puffer (Transgenomic, Inc.) blev anvendt til at øge FL-intensiteten af ​​PCR-produkter (universal post column mærkning). Genomisk DNA fra HCT116 blev anvendt som standard kontrol.

Klon sekventering

PCR blev udført på bisulfit konverterede DNA. Amplikonerne blev klonet ind i pCR-stumpe vektor (Invitrogen), omdannet til

E. coli

, og sekventeret ved hjælp af en ABI 3730 Analyzer.

p16

RT-PCR

P16

mRNA blev detekteret som beskrevet [12] .

P16 immunfluorescensfarvning

immunfluorescensfarvning blev udført som tidligere beskrevet [39]. Kort sagt, blev fusion cellerne fikseret i 4% formaldehyd /PBS i 10 minutter før en 5-min vask i PBS. Faste prøver blev blokeret i 30 minutter med 0,5% Triton X-100 /PBS ved stuetemperatur. Celler blev inkuberet med anti-P16 antistof (Abcam, ab54210) i 1 time ved 37 ° C, efter vasket med 0,5% Triton X-100 /PBS, derefter inkuberet med gede-anti-kanin IgG-antistof mærket med rhodamin i 1 time ved 37 ° C. DAPI (1:2000) blev anvendt til at farve cellekernen. Billeder blev taget på et Leica konfokal mikroskop.

Resultater

Etablering og karakterisering af en celle fusion model med forskelligt methylerede

P16

alleler

Det har været rapporterede, at heterokaryoner kan inducere variation DNA-methylering via cellefusion af to cellelinjer [30]. Vi antager, at en celle fusion model med forskellige methylering af P16 CpG øer kunne duplikere de novo methylering eller demethylering processer. Således blev puromycin

r + -AGS celler, der indeholder fuldt methyleret P16 alleler og neomycin

r + -MGC803 celler, der indeholder methyleret-P16 alleler konstrueret henholdsvis. Disse to cellelinjer blev derefter fusioneret og dyrket i selektionsmedium indeholdende både puromycin og neomycin. Efter tre runder af kloning blev de fusionsproteiner monoclones karakteriseret under anvendelse af to mikrosatellitter (D9S974 og D9S1749) i nærheden af ​​p16 locus (figur S1A). To D9S1749 mikrosatellit chromatogramprofiler mønstre (C7 /C9 /E10 og D3 /E3) og én D9S974 mønster blev observeret i 5 testede monoclones der afveg fra mønstrene for deres parentale celler. Kromosom tilstand var også forskellig mellem den repræsentative klon E10 (nær-tetraploid) og dets forældre celler (nær-diploid) (Figur S1B).

Stabil vedligeholdelse af helt methylerede og unmethylated-

P16

alleler i cancerceller

status methylering af p16 CpG-øer (392 bp) blev kvantitativt analyseret i disse fusionsproteiner kloner under anvendelse af en DHPLC assay som tidligere rapporteret [37]. Som det fremgår af p16 hemi-methylerede HCT116 celler, forholdet mellem methylated- til umethyleret-P16 molekyler var omkring 01:01 i disse fusionsproteiner kloner (figur 1A-venstre). Andelen af ​​methyleret-P16 alleler blev stabilt opretholdt i en repræsentativ klon fra passagerne 45, 50, 55, og 60 (figur 1A-højre). Endvidere RT-PCR detekteret p16-mRNA i alle 5 testede kloner (figur 1B). Nucleoplasmic P16 protein blev også observeret inden for hver celle i to repræsentative monoclones (C9 og E3) (Figur 1C). Baseret på denne information, er det klart, at transskription /methylering af p16 alleler i de fusionsceller sandsynligvis opretholdes i et lignende mønster til deres parentale celler.

(A) methylering af

P16

CpG øer i fusion monoclones blev analyseret ved hjælp DHPLC (til venstre). Andelen af ​​methylated-

p16

i monoclone-E10 blev stabilt opretholdt ved passager 45, 50, 55, og 60 (til højre). (B) RT-PCR viser varierende mRNA udtryk for

p16

i fusion monoclones og deres forældres MGC803 og AGS cellelinjer. (C) Konfokal immunocytokemi farvning viser varierende P16 udtryk i forskellige cellelinjer.

fokalt methylerede

P16

alleler er ikke stabile i kræftceller

Interessant, mens fleste P16 molekyler forblev i fuldstændig methylerede eller ikke-methylerede stater, de repræsentative fusion kloner indeholdt ca. 27% (13/48) fokalt methylated- (eller demethylated-) P16 molekyler i exon-1-region (figur 2B). Men de homozygot methylerede eller umethylerede parentale celler ikke udviser de samme methylering ændringer. For at bekræfte, at den testede klon var faktisk monoklonale, blev denne klon subklones yderligere. Yderligere analyse afslørede, at p16 mønstre for methylering i to subkloner konsekvent forblev ligner deres parentale kloner (figur 2C og fig S2).

(A) bisulfit klon sekventering af det 392 bp fragment af

p16

CpG ø i AGS og MGC803 celler; Hver grøn bar repræsenterer en CpG websted. Nukleosomal placering i exon-1 er også markeret med (26). (B og C) bisulfit sekventering i fusionen monoclone-E3 og subkloner. Focal methylering ændringer (gul-skygget); methylerede CpG sites (red dot); umethylerede CpG sites (åben dot); fokalt methylated- eller demethylated-

P16

molekyler (sorte pile). (D) homeostatiske methylering model for en enkelt CpG ø i tetraploide celler.

En enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) (rs36228836) blev identificeret i p16-promotorregionen. Det blev bestemt, genotypen af ​​denne SNP afveg mellem de to parentale cellelinier (T /A for MGC803 og T /T for AGS), hvilket således gør det muligt at identificere de MGC803-specifikke p16 A-alleler i fusionsceller (figur S3). For at afklare, om disse fokalt methylerede fragmenter var resultatet af de novo methylering eller demethylering blev methylering inden for en 588 bp fragment, der dækker denne SNP analyseret ved hjælp af en seeding methylering-specifik PCR assay (sMSP). Det blev opdaget, at CpG methylering af p16 alleler ved de methylering “seeding” sites i intron-1 effektivt blev beriget [26]. Resultater af bisulfit-sekventering bekræftede, at focal de novo methylering blev observeret i MGC803-specifikke A-alleler af monoclone-D3 (fig S3).

For at undersøge, om den transiente fokalt eksistere methyleret-P16 alleler i ikke-fusionsceller, blev også analyseret methyleringsmønsteret af p16 hemi-methylerede HCT116 cellelinie. Ligeledes 16% (8/49) af p16-molekyler viste fokal methylering i HCT116-celler (figur 3). Desuden ved anvendelse af en del /ins læsning rammeskiftsmutation fundet i exon-1-kodende region som en genetisk markør, blev det bestemt, at både fokal de novo methylering i mutant G-indsættelse alleler (hovedsagelig ikke-methyleret) og demethylering i vildtype alleler (hovedsagelig methylerede) også forekomme sporadisk i HCT116 celler (4/26 og 4/23, henholdsvis). Dette indikerer, at omdrejningspunktet methylering og demethylering af P16 alleler gøre faktisk eksisterer i ikke-fusion kræftceller. Tilsammen disse resultater tyder på, at mens omdrejningspunkt methylering og demethylering er relativt almindelige begivenheder, er de fleste af de helt methylated- og umethyleret-P16 alleler stabilt opretholdt i kræftceller.

(A) Bisulfite klon sekventering af 392 bp fragment af

P16

CpG ø i HCT116 celler. Vild-type (

sletning

) /mutant (G-

indsættelse

)

P16

alleler; fokalt demethylated-

P16

molekyler (sorte pile); fokalt

de novo

denatureret molekyler (røde pile). (B) homeostatiske methylering model for en enkelt CpG ø i diploide celler.

For at undersøge, om det fokale methylering /demethylering forekommer i genet krop, vi analyserede methylering af CpG-øer inden p16 exon-2 og intron-2. DHPLC analyse afslørede, at disse to CpG-øer var fuldt methyleret i AGS, MGC803, og HCT116-celler (Figur S4A B), og med bisulfit sekventering af intronen-2 CpG ø bekræftede DHPLC resultater (figur S4C), hvilket tyder genet organ er homogent og stabilt methyleres i disse celler og ikke er ledsaget omdrejningspunkt methylering /demethylering.

Samtidig 5-hydroxymethylation forekommer i

P16

alleler af fusion celler

DNA methylering og hydroxymethylation kan ikke umiddelbart skelnes ved hjælp af regulære bisulfit-baserede methylering analyser. Rolle hydroxymethylation i omdrejningspunktet p16 methylering eller demethylering blev undersøgt ved hjælp hMeDIP-PCR assay (figur 4A, venstre diagram). Resultaterne af dette assay viste, at mængden af ​​hydroxymethyleret-p16 DNA i de to fusionsproteiner kloner var signifikant højere end deres stamceller (figur 4A, højre figur).

(A) immunopræcipitation og PCR-analyse af syntetiske og cellulære 5hmC-holdige

p16

sekvenser. De AGS og fusion monoclone-D3 og E3 celler viser signifikante niveauer af 5hmC. (B) TAB-seq analyse afslører helt hydroxymethylated-

P16

alleler i fusion subkloner, men ikke forældrenes celler. (C) TAB-seq analyse af HCT116 celler viser størstedelen af ​​vildtype

P16

alleler er helt hydroxymethyleret.

Tet-assistent bisulfit sekventering (TAB-seq) er i stand til specifikt afsløre 5-hydroxy-methylcytosin (5hmC) i DNA ved en enkelt base resolution [35]. Anvendelse af dette assay til at analysere 5hmC indhold i p16 CpG-øer i detaljer, blev det konstateret, at AGS-celler udviser sporadiske hydroxymethyleret CpG’er ved en meget lav frekvens (21/700), mens de MGC803 celler ikke viste nogen hydroxymethylation. Som forventet blev der påvist både komplette og fokal hydroxymethylation af P16 alleler i disse fusion celler (figur 4B). Resultaterne af to assays konsekvent viser, at hydroxymethylation kan spille en rolle i den homeostatiske vedligeholdelse af p16-methylering i de fusionsceller.

Analyse af HCT116 celler uventet viste hyppige og fuldstændig hydroxymethylation inden for antisense-strenge af p16 vildtype (del) alleler (11/14), men ikke i G-indsættelse mutant alleler (Figur 4C). Mens methylering blev påvist i 369 bp fragment af sense-strengen af ​​p16 exon-1 i HCT116 celler som forventet (figur 5A-C), især, den komplette hydroxymethylation blev ikke observeret i den forstand-strengene i både TAB-DHPLC analyse og TAB-sekventering (figur 5C og D), hvilket tyder på antisense-strengen specifikke hydroxymethylation.

(A) Placering af 369 bp amplikon af den forstand-streng

p16

exon-1. (B) Påvisning af de 369 bp PCR-produkter under anvendelse DHPLC (størrelsessortering mode) ved 48 ° C. (C) Påvisning af hydroxymethyleret molekyler forstærkede fra

p16

sense-streng efter TAB modifikation hjælp DHPLC (FL detektor) Ved den delvise denaturering temperatur 55 ° C. Under denne tilstand, hydroxymethylated- og unhydroxymethylated-

P16

molekyler er delvist og helt denatureret henholdsvis. De regelmæssige bisulfit-behandlede templates anvendes som reference- kontroller. (D) Resultater af TAB-sekventering af de 369 bp PCR-produkter amplificeret fra HCT116 celler.

For at bestemme, om de helt hydroxymethyleret vildtype P16 alleler er transkriptionelt aktiv, allel-oprindelse P16 udskrifter var præget af klon sekventering. Resultaterne af sekventering viste, at ingen af ​​de 48 p16 mRNA-molekyler blev transkriberet fra vildtype p16 alleler, der var asymmetrisk methylerede og hydroxymethyleret (M:H) (figur 6). Disse oplysninger viser, at hydroxymethylation i antisense-strengen af ​​p16 alleler ikke kan føre til transkriptionel aktivering af genet.

(A) RT-PCR-klonen sekventering af kontrol 293T cellelinie (del) viser vildtype

p16

mRNA. Den HCT116 (G-ins) cellelinie afslørede kun mutant

P16

mRNA kloner. (B) Klon sekventering resultater viser både vildtype og mutant p16 mRNA.

Samtidig af histon H3K4 og H3K9 trimethylation på

P16

alleler i fusion celler

chip -PCR blev anvendt til kvantitativt at bestemme niveauerne af aktiv H3K4me3 og undertrykkende H3K9me3 i fusionen celler (figur 7). Den H3K4me3 niveau i de heterogent methylerede P16 alleler af fusion subkloner viste sig at være betydeligt lavere end det var set i de helt methylerede alleler af de MGC803 celler. Desuden er omfanget af H3K4me3 i exon-1 chromatin blev bestemt til at være højere end blev fundet i promotoren kromatin. Mens H3K4me3 ikke blev påvist i AGS celler, det H3K9me3 niveau var signifikant højere i denne cellelinie end andre cellelinjer. H3K9me3 niveau viste en omvendt korrelation med H3K4me3 niveau blandt disse cellelinjer.

(A) Den aktive H3K4me3 niveau inden for

P16

CpG øer i fusion subkloner og MGC803 celler var signifikant højere end AGS celler, især i exon-1 region (monoclones vs. AGS, P 0,01). (B) Den undertrykkende H3K9me3 niveau i fusion subkloner og AGS celler var signifikant højere end MGC803 celler, især i promotor-regionen (monoclones vs. MGC803, P 0,01).

Diskussion

mønster DNA methylering er kendt for at ændre dynamisk under differentieringen af ​​embryonale stamceller og udvikling af væv i hvirveldyr. Det er dog stadig et mysterium, hvordan de methylering af genomet holdes i celler ikke længere undergår differentiering. I nærværende undersøgelse blev det konstateret, at methylering af helt methylated- og unmethylated-

P16

alleler forblev stabil under celledeling. Desuden lave niveauer af fokal demethylering, hydroxymethylation, og

de novo

methylering forekom relativt hyppigt i to slags

p16

hemi-methylerede kræft celle modeller, men ikke i homogent methylerede eller umethylerede celler. Disse resultater indebærer, at homogene methylering kan udøve repression pres på

p16

gen, der kan i det mindste delvis påvirker tidligere umethylerede CpG-øer. I modsætning hertil transkription pres fra fuldstændig demethylering af genet er i stand til at inducere og opretholde demethylering af

p16 Salg CpG-øer. Hydroxymethylation af

P16

CpG alleler blev også opdaget at spille en rolle i den homeostatiske vedligeholdelse af genom methylering. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, der viser, at status for methylering af et tumorsuppressorgen homeostatically vedligeholdes i kræftceller.

Stabiliteten af ​​methylerede P16 alleler er endnu ikke blevet forklaret. I gastritis læsioner, de methylering af de fleste P16 alleler er ustabile og H. pylori-afhængig [27], [28]; men i cancercellelinier de har vist sig at forblive bemærkelsesværdig stabil [29]. Vores seneste omfattende sekventering undersøgelser viste, at den methylerede bindingssteder for CpG i gastritis befinder sig inden for exon-1 region af p16-genet, men strækker sig ind i promotorregionen efter udviklingen af ​​gastrisk karcinom. Dette indebærer, at helt methyleret-P16 alleler er betydeligt mere stabile end deres fokalt methylerede modstykker [26]. Det er også blevet rapporteret, at heterokaryoner kan inducere DNA methylering variationer via celle fusion af to cellelinjer, og endvidere at nogle tavshed-P16 molekyler i muse cancerceller kan reaktiveres efter at være blevet fusioneret med p16-aktive muse embryonale stamceller [30], [39]. I den foreliggende undersøgelse blev fusion celler indeholdende et bredt udvalg af p16 mønstre for methylering etableret fra homozygot methylerede og ikke-methylerede parentale cellelinier med henblik på at undersøge stabiliteten af ​​fokalt og helt methyleret-P16 alleler i den samme celle. Som forventet p16 alleler af fusionsaktiviteterne celler viste en fuldstændig og variabel række methylering. P16 alleler i fusion kloner og deres subkloner forblev stabilt hemi-methylerede under celle passager, som viser, at disse helt methylerede og umethylerede P16 alleler er relativt stabile. På den anden side, hemi-methylerede fusion kloner og HCT116 celler udviste lave niveauer af fokalt methylerede /demethyleres-P16-alleler, som giver direkte bevis for, at hemi-methylerede P16 alleler er mindre stabile end de homogent methylerede P16 alleler. Denne dynamiske, men stadig homeostatiske, methylering mønster af P16 CpG øer kan tilbyde en fælles mekanisme forklarer DNA methylering vedligeholdelse i differentiering statiske celler. Desuden to CpG øer i p16 exon-2 og intron-2 er homogent denatureret i HCT116, AGS, og MGC803 celler, og derfor er det sandsynligt, at homeostatiske vedligeholdelse af p16 methylering kunne observeres kun i sin promotor /exon-1 region i disse celler. Fordi der er mange hemi-methylerede regioner til stede i genomet, såsom X-kromosomer af kvindelige celler og prægede gener, yderligere undersøgelse af, om fokal, forbigående methylering og demethylering er generelle fænomener i homeostatiske vedligeholdelse af methylering af DNA er helt sikkert berettiget.

5hmC spiller en afgørende rolle i aktiv DNA demethylering som et mellemprodukt i seriel methyicytosin oxidation. Imidlertid er en vis andel af 5hmC ikke oxideres yderligere, men i stedet holdes i genomet af voksent væv såsom hjernen og tyktarmen. Selvom de yderligere funktioner 5hmC i genomet forbliver ukendte, er det sandsynligt at et vigtigt formål. Det er blevet rapporteret, at hydroxymethylation ved begge promotor- og intrageniske steder korrelerede positivt med genekspression [40]. Generelt er CpG-øer ikke methyleret i regionerne omkring transcription start sites i aktivt transkriberede gener, men er methylerede i genet krop. For nylig er det blevet rapporteret, at hydroxymethylation i genomet af hjernen er TET2-afhængig og mere hydroxymethylation detekteres i sense-strenge end de antisense-strenge af aktivt transkriberede gen organer [41], [42]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at antisense-strengene af HCT116 celler indeholdt en vis del af “methylerede” vildtype p16 alleler, der var faktisk helt hydroxymethyleret;