PLoS ONE: Differential Analyse af æggestokkene og livmoderkræft Identificerer en Methylator Phenotype

Abstrakt

På trods af forbedrede resultater i de sidste 30 år, mindre end halvdelen af ​​alle kvinder diagnosticeret med epitelial ovariecancer levende fem år uden deres diagnose . Selvom typisk behandles som en enkelt sygdom, epitelial kræft i æggestokkene omfatter flere forskellige histologiske undertyper, såsom papillær serøse og endometrioide karcinomer. For at løse, om de morfologiske forskelle ses i disse karcinomer repræsenterer særlige karakteristika på det molekylære niveau, vi analyserede DNA methylering mønstre i 11 papillære serøse tumorer, 9 endometrioide tumorer i æggestokkene, 4 normale æggeleder prøver og 6 normale endometrie væv, plus 8 normal æggeleder og 4 serøse prøver fra TCGA. Til sammenligning i endometrioide subtype vi tilføjet 6 primær uterine endometrioide tumorer og 5 endometrioide metastaser fra livmoderen til æggestok. Data blev opnået fra 27,578 CpG-dinukleotider der forekommer i eller i nærheden promotorområder af 14.495 gener. Vi identificerede 36 steder med store stigninger eller fald i methylering i sammenligninger af serøse tumorer og normale fallopian rør prøver. Desuden ukontrollerede klyngedannelse teknikker, der anvendes til alle prøver viste tre store profiler omfattende meste normale prøver, serøse tumorer og endometrioide tumorer, herunder æggestokke, livmoder og metastatiske oprindelse. Den clustering analyse identificeret 60 forskelligt denatureret steder mellem serøs gruppe og den normale gruppe. En ubeslægtet sæt af 25 serøse tumorer valideret reproducerbarheden af ​​mønstre for methylering. Derimod 1.000 gener blev differentielt methyleret mellem endometrioide tumorer og normale prøver. Dette fund er i overensstemmelse med en generel regulering forstyrrelser forårsaget af en methylator fænotype. Gennem DNA methylering analyser vi har identificeret gener med kendte roller i ovariecancer ætiologi, mens sti analyser leveres biologisk indsigt til rollen af ​​nye gener. Vores fund af forskelle mellem serøse og endometrioide ovarietumorer indikerer kunne udvikles, at interventionsstrategier til specifikt undertyper af epitelial kræft i æggestokkene

Henvisning:. Kolbe DL, DeLoia JA, Porter-Gill P, Strange M, Petrykowska HM , Guirguis A, et al. (2012) Differential Analyse af æggestokkene og livmoderkræft Identificerer en Methylator Fænotype. PLoS ONE 7 (3): e32941. doi: 10,1371 /journal.pone.0032941

Redaktør: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, USA

Modtaget: September 29, 2011; Accepteret: 2 februar, 2012; Udgivet: Marts 5, 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Finansieringen leveres af The Intramural Research Program for National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health (LE og LB), DoD GOC # 04-124 og Magee Womens Research Institute /Scaife Grant (TCK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene har en forekomst på 21.500 tilfælde om året i USA og 204.000 på verdensplan, med en anslået årlig dødelighed på 125.000 kvinder. Betingelsen rangerer som den 5

th hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald for kvinder i USA; den høje dødelighed er en konsekvens af den asymptomatisk karakter af tidlige fase sygdom og fraværet af en pålidelig screeningtest. De fleste tilfælde (75%) er diagnosticeret på et fremskredent stadium (III eller IV), hvor 5-års overlevelse er mindre end 30% [1].

Af de fire store histopatologiske undertyper, serøs er den mest almindelige, efterfulgt af endometrioide, mucinøs og klare celletyper. Disse undertyper har markante genekspressionsprofiler [2] og er klassificeret i kraft af deres morfologiske lighed med normal æggeleder, endometrium, endocervix og endometrie klare celler, henholdsvis [3]. Ligheden mellem tumor undertyper og fjerne væv er i overensstemmelse med modeller, der foreslår migration af forstadielæsioner fra forskellige oprindelser, såsom æggelederen [4] eller mesothelial dækning af bughulen [5]. Af denne grund kan æggestokkene serøse tumorer (som ligner mullerian epitel) legitimt forhold til normal æggeleder (som er afledt af mullerian epithel). Ikke desto mindre æggestokkene overflade epitel (OSE) lag [6] deler sin oprindelse med epitel af endometriet (kendt som celomic epitel [7]) og er stadig en plausibel alternativ forklaring på “de novo” tumorigenese.

Ligesom serøse tumorer, oprindelsen af ​​endometrioide tumorer er kontroversiel [8], og er blevet foreslået stamceller at stamme fra ikke-æggestokkene kilder, såsom endometriose [9]. Tumorer med endometrioide histopatologisk er diagnosticeret i både livmoderen og æggestokkene. De ofte co-forekomme, som synkrone primære tumorer eller metastaser fra livmoderen for ovarie- [10]. Betragtninger er blevet rapporteret molekylære forskelle for to primære tumorer, metastatiske tumorer er klonisk identiske [11].

genekspressionsstudier af ovarietumorer beregnet til at opdage kræft-specifikke profiler har givet beskeden succes og begrænset reproducerbarhed [12], [13], [14], [15]. Imidlertid har mutationsmønstre profilering undersøgelser givet mere konsistente resultater, der viser, at både serøse og endometrioide tumorer har aggressive, high-grade undertyper [16], [17], [18] med mutationer i

TP53

gen [19 ], [20], [21] på trods af deres åbenlyse histologiske forskelle [16], [17], [18]. Low-grade undertyper er mest almindelige i endometrioide tumorer med mutationer overvejende forekommer i

WNT

og

PIK3CA

veje [2].

I koncert med genekspression og mutationsmønstre profiler, afgrænse epigenome af tumorceller skal afsløre relationer mellem prøver, der afspejler fælles embryologiske oprindelse, lignende histopatologiske resultater, eller delte mutationsbegivenheder. I ovarietumorer, DNA methylering tavshed udtryk for kritiske gener [22], [23], og skaber genetiske haploinsufficiency [24], mens hypometylering på andre sites giver udtryk for normalt tavshed gener. Som bevis på princippet blev stedspecifikke mønstre af DNA methylering nylig bruges til at skelne fire undertyper af epitelial ovariecancer, ved hjælp af i alt 1505 mål CpG loci [25], [26].

Vi hypotese, at DNA methylering mønstre i ovarietumorer ville ligne celler fra deres formodede væv af oprindelse, med et lille antal ændringer, der repræsenterer begivenheder forbundet med malignitet, der entydigt repræsenterer hver tumor undertype. Desuden har vi den hypotese, at uterus og ovarier endometrioide tumorer var relateret af patogene mekanismer, som ville blive observeret i DNA methyleringsmønstre. For at løse disse ideer, vi undersøgte methylering profiler af 27.578 target CpG sites repræsenterer 14.495 gener i det humane genom, ved hjælp af DNA fra serøse og endometrioide ovarietumorer, normal æggeleder og normal endometrium, og primære og metastatiske endometrioide endometrie tumorer. Denne store datasæt blev analyseret ved hjælp af en overvåget analyse efterfulgt af

de novo

klassificering ved hjælp ukontrollerede beregningsmæssige klyngedannelse. For at forbedre styrken af ​​den epigenetiske profilering teknik, inkluderet vi rå methylering data fra serøse tumorer og normal æggeleder genereret gennem The Cancer Genome Atlas (TCGA). Disse prøver blev analyseret ved hjælp af den samme methylering platform, og udføres af uafhængige forskningslaboratorier hjælp uafhængige tumor prøver.

Resultater

Eksperimentel analyse og design

Vi analyserede status DNA methylering af genomiske prøver ved anvendelse Illumina Infinium platformen. DNA blev behandlet med bisulfit til at konvertere ikke-methylerede cytosiner til uracil, efterlader methylerede cytosiner uændret. Hybridiseringsreaktionen på HumanMethylation27 Illumina BeadChip forudsat signal specifikke for de methylerede og umethylerede stater, ved hjælp af Illumina enkelt base udvidelse assay-protokol [27]. Den differentielle hybridisering af prober til methylerede og ikke-methylerede målsteder blev tabuleret som den del af den samlede signal, der svarede til den methylerede tilstand. Den oprindelige stikprøve sæt repræsenterede forskellige væv og tumor typer, herunder normal æggeleder, normal endometrium, ovarie papillær serøs karcinom, æggestokkene endometrioide karcinom, og primær og metastatisk endometrisk endometrioide karcinom fra 42 patienter (tabel 1). Tekniske replikater angivet stærkt reproducerbare resultater for assayet (figur S1). Desuden indgår vi data fra samme Illumina methylering platform for yderligere 12 prøver fra det offentlige register over The Cancer Genome Atlas-projektet (TCGA). Dette sæt består 8 kontrolprøver (normal æggeleder) og 4 tumor prøver (æggestokkene serøs), bidrog i en enkelt batch af prøver undersøges under konsekvente eksperimentelle betingelser fra én dataleverandør.

Bulk methylering

for at vurdere grove ændringer i graden af ​​methylering, vi undersøgte aggregerede methylering niveauer af alle prøver. Analyseværdierne rapporteres som andelen af ​​fluorescens hidrørende fra proben for den methylerede tilstand, fra 0 (alle DNA-methyleret) til 1 (alle DNA methyleret). Sammenligning alle prøver, viste det store flertal konsistente methylering profiler. På tværs af genomet, mest analyserede steder havde methylering niveauer mellem 0 og 0,2, et lille antal steder havde niveauer mellem 0,2 og 0,8, og en lidt større antal havde niveauer på 0,8 til 1 (figur 1).

Hyppighed af methylering overhovedet loci for et givet niveau af methylering (0 til 1). Hver biologisk prøve er repræsenteret som en enkelt linje; alle ikke-metastatiske prøver blev afbildet. Henholdsvis paneler fra venstre mod højre indeholder alle loci (N = 27.561), X-kromosom kun (N = 1038), eller kromosom 10 kun (N = 1044).

I modsætning hertil overvejer kun X-kromosom, single-copy silencing ved tilfældig X-inaktivering forventedes at frembringe en methylering på 0,5. Det observerede mønster viste en bred top centreret ved 0,5 for de fleste prøver, selv om tumorprøverne havde mere omfattende heterogenitet. Fem serøse tumor prøver viste en tydelig profil, med mange loci være umethyleret (dvs. methylering niveau 0,2), hvilket indikerer enten en manglende vedligeholdelse X-inaktivering eller kopiere nummer ændringer med relativ overskud af den aktive X [28]. For at vurdere, om dette observerede variation var simpelthen på grund af det lille antal loci på X-kromosomet, vi også betragtes methylering niveauer på kromosom 10, som havde et lignende antal sonder. Mønstret for kromosom 10 lignede mønsteret over alle autosomal loci, med høje niveauer af lighed fra prøve til prøve.

Overvåget analyse

Vi først undersøges, om tumor undertyper (defineret ved histopatologi) svarede til specifikke methylering profiler. Med inddragelsen af ​​TCGA prøverne, 12 normale æggeleder prøver og 16 æggestokkene serøse tumorer gav tilstrækkelig statistisk styrke til en direkte sammenligning. Sonder med dårlig kvalitetskontrol, høj variabilitet i kontrollerne, eller placeret på X eller Y-kromosomer blev ikke anset for (se metoder). Ved hjælp af en Wilcoxon opsummerede-rank test til at identificere websteder, der konsekvent er forbundet med forudgående klassificering, 36 var signifikant på p 0,05 efter flere test korrektion (14 ved p 0,01; Tabel 2). Tre gener blev identificeret som medlemmer af den kanoniske vej for ovariecancer i en Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (tabel 2; [29] [30] [31] [32]). Overvåget analyse af de æggestokkene endometrioide tumorer mod æggelederen eller endometrie kontroller blev ikke udført på grund af et lille antal prøver.

Unsupervised klyngedannelse

For at løse, om andre prøve divisioner med fælles molekylær fænotyper eksisteret og for at få et bredere billede af forholdet mellem de prøvetyper, vi flyttede til ukontrollerede klyngedannelse. Udnytte det komplette sæt af 31 primære tumor prøver og 18 normale væv (med undtagelse af de 5 metastatiske prøver anvendes til sekundær analyse), begrænsede vi denne analyse til sonder, der var i top 500, når sorteret efter varians, som rapporteret af Houseman et al. [33] for at reducere dimensionaliteten af ​​dataene. Resultater af multiple klyngedannelse algoritmer konvergeret på den samme fortolkning af distinkte fænotypiske grupper (Figur S2). K-betyder klyngedannelse og partitionering ved hjælp af en β-blanding model designet til data fra denne platform [33] både kraftigt støttet eksistensen af ​​3 primære grupper omtrent svarer til styre-type prøver, serøse tumor-type prøver, og endometrioide prøver. Yderligere analyse med hierarkisk klyngedannelse (på tværs af flere distance målinger og sammenkædning metoder) støttede stærkt kontrol–type og endometrie typen klynger, og angav de serøse tumor-type prøver var en udgruppe fra kontrolprøverne, men var inkonsekvent, om disse prøver dannet en distinkt undergruppe (figur S2).

konsensus grupperinger, som vist i figur 2, er markeret med en farvet for at angive den normale type, serøs-type eller endometrioide-typen. Især kontrolgruppen indeholdt normal æggeleder og normal endometrium, hvilket indikerer en ensartet fænotype over begge væv i sættet af fremhævede prober. De TCGA prøver grupperet med deres identificerede prøvetyper, bekræfter reproducerbarhed og robusthed resultaterne som disse tumorer blev opnået og klassificeret på forskellige institutioner. Udelukkelse af TCGA prøver fra analysen havde relativt lille indvirkning på resultaterne, hvor en markant opdeling forblev mellem endometrioide og serøse eller kontrolprøver dog kun svag støtte forblev i en underafdeling af de serøs-type tumorer fra kontrolprøverne

Heatmap af methylering niveauer.; blå = 0,0, sort = 0,5, gul = 1,0. På venstre, et repræsentativt udsnit af hierarkisk klyngedannelse, og farveblokke giver konsensus grupper. Seks kolonner til højre giver eksempler egenskaber: nummer, tumor (T) eller normal (N); placering i ovarie (O), æggeleder (F), eller endometrium (E); histologi af serøs (S) eller endometrioide (O); bedømmelse (1-3; hvor symboler anvendes, er ‘-‘ for raske og “NA” for oplysninger ikke er tilgængelige.) og på yderst til højre, prikker for offentlige TCGA data. Fem prøver på bunden er æggestokkene metastaser fra endometriske endometrioide tumorer, udelukket fra den indledende analyse og klyngedannelse.

klynge af endometrioide prøver, herunder tumorer fra både æggestokkene og livmoderen sites, viser en bemærkelsesværdig ændret profil, med methylering på mange websteder, der normalt umethylerede CpG øer, og et tab af methylering på steder, der normalt methylerede. Omfanget og reproducerbarhed af disse ændringer er minder stærkt om de methylator fænotyper konstateret i andre kræftformer [34] [35]. En methylator fænotype er tidligere blevet foreslået for endometrisk endometrioide carcinom, baseret på methylering af promotorer af et par målgener [36], men har ikke til vores viden blevet beskrevet i et genom-niveau undersøgelse eller i ovariecancer.

Disse data bekræfter hypotesen om, at endometrioide typen tumorer, enten på æggestokkene eller livmoderen sites, dele ligheder på det molekylære niveau. For yderligere at imødegå dette fund, vi analyserede fem æggestokkene metastaser afledt af primære endometrie tumorer ved hjælp af en indlejret log-sandsynlighed-kvotientkriteriet. Denne test rettet konsekvens af klyngedannelse med de primære endometrioide prøver versus de kombinerede serøse tumorer og kontroller, og sekundært aktiveret klassificering inden for de serøse eller kontrolgrupperne når det er nødvendigt. Fire af de fem prøver blev stærkt identificeret som endometrioide-typen, mens det femte var mere ligner kontrolprøverne (prøve 54; figur 2). Den femte prøve fremgår ikke klart ændret fra methylering af normalt endometrievæv, hvilket indikerer, at størstedelen tumor fænotype ikke er universel. Denne outlier kan repræsentere en usædvanlig underafdeling af endometrioide tumorer, som følge af forskellige underliggende patologi, men det udgør ikke en low-grade tumor (figur 2).

Vurdering af primære tumorer i alle histopathologies også identificerede sjældne outliers. Eksempler inkluderet endometrie endometrioide prøver 47 og 49, der klynger med normale væv og bidraget til 15% af prøverne, der viste uharmonisk placering i forhold til deres tildelte histopatologi (grad 1 og grad ikke er til rådighed, henholdsvis; Figur 2). Fire æggestokkene serøse tumorer også grupperet med normale væv, som viser meget begrænsede ændringer i methylering i forhold til kontroller (kvaliteter 2 og 3). I betragtning af den fænotypiske lighed af disse prøver til normale kontroller, den biologiske fundament for denne tumor delmængde kræver yderligere undersøgelser. Ydermere er en ovarie endometrioide prøve grupperet med de serøse tumorer (prøve 36, grad 2), hvilket tyder på enten en sjælden endometrioide subtype med en mere aggressiv, serøs-lignende profil, eller stavefejl af en dårligt differentieret prøve.

Differential analyse af klynger

i betragtning af de tre primære grupper, som den uden opsyn klyngedannelse analyse, vi har ønsket at identificere methylering loci mest prædiktive for medlemskab af en bestemt klasse. Vi gentog Wilcoxon opsummerede-rank test, der anvendes i den overvågede analyse, efter fjernelse fra betragtning 500 anvendte prober i klyngedannelse. Sammenligning af serøs-typen klynge med kontrol-typen klynge, 35 sonder forblev signifikant på p 0,01 efter strenge Bonferroni korrektion for flere tests og 60 forblev på p 0,05 (tabel 3). Resultaterne viste en blanding af hyper- og hypometylering forhold til kontrollerne (Figur S3). En IPA analyse identificeret kendte biomarkører for kræft i æggestokkene blandt denne liste (figur S4 og S5). To gener med indspillede relevans for DNA methylering blev identificeret, herunder

DNMT3A

, en DNA-methyltransferase gen og

RB1 ​​

.

APC Hotel (fra beta-catenin vej),

RBAK1

(en

RB1 ​​

interaktion partner),

MAPK15

MAP2K2

kinaser, og histon deacetylase

HDAC1

var også på listen (tabel 3). Selvom de overvågede og uovervågede analyser udnyttes forskellige komparator sæt, gen-lister indeholdt 10 overlappende poster (tabel 3).

I betragtning af endometrioide-klyngen versus kontrol klynge, vi konstateret, at antallet og graden af forskelligt methylerede steder steget med mere end en størrelsesorden. For eksempel 954 prober var signifikante ved p 0,01. Alene antallet af hypermethyleret sites tyder en underliggende defekt i DNA-methylering veje, og begrænser nytten af ​​at overveje ændret methylering af enkelte gener.

Validering af differentieret methylering

For at undersøge, om vores sæt af 60 differentielt methylerede steder i serøse tumorer var reproducerbar, vi vurderede methylering af 25 yderligere prøver, der var uafhængig af den oprindelige analyse sæt. Alle blev indtastet som æggestokkene serøs karcinom og analyseret uafhængigt (uafhængig i konstatering og tidspunktet for analyse) fra originalerne. For hvert sted og for hver validering prøve, vi vurderet, om det methylering mere lignede den normale prøve klynge eller serøs tumor prøve klynge. Af de 25 tumorprøver, 4 lignede methyleringsmønsteret af normale prøver, syv blev ændret ved 21 eller flere af de 60 loci, og 14 prøver viste den ændrede mønster på 40 eller flere af de 60 loci (figur 3).

Methylering ved 60 loci blev anvendt til at evaluere et uafhængigt sæt serøse tumorer. Hver række repræsenterer en individuel prøve; hver kolonne svarer til en af ​​de tidligere identificerede differentielt methylerede sites. En tom boks indikerer methylering mere ligner kontrol klynge (ikke nødvendigvis methyleret); en fyldt sort boks indikerer methylering mere ligner den klynge af æggestokkene serøse tumorer. Prøver bestilt af antallet af steder, der har methylering ligner serøse tumor gruppen.

Evaluering af offentliggjorte methylering begivenheder

Vores analyse af differentieret methylering med fokus på ændringer, der definerede karakteristika i hver gruppe og blev delt mellem alle eller næsten alle prøver. Mange vigtige ændringer i methylering tilstand, der tidligere er rapporteret i litteraturen, har lavere forekomst og er ikke direkte identificeret af vores tilgang. Da vi vurderede vores prøver efter mønstre af kendt methylering, vores data var i overensstemmelse med publicerede resultater. Eksempelvis

BRCA1

blev hypermethyleret i 2 af 16 (12,5%) af ovariale serøse prøver. Tumor suppressor

RASSF1A

viste tegn på fuldstændig methylering i 11 tumorer, og enkeltstrenget kopi methylering i 4 mere (31% af serøs, og 60% af endometrioide). Disse ændringer, og andre, vil sandsynligvis være vigtige transformative begivenheder, men er begrænset til mindre delmængder af prøverne

Gene ontologi pathway analyser

At binde disse resultater til litteraturen om kræft i æggestokkene, vi udførte et gen ontologi (GO) analyse og en IPA analyse af de differentielt methylerede gener fra klyngen-baserede sammenligning af serøse tumorer versus kontroller. Generne, som svarer til den methylerede loci i vores liste viste en statistisk signifikant berigelse for GO termer involverer regulering af cellecyklus (tabel 4). De to øverste netværk identificeret af IPA inkluderet “Cell Cycle og Cell Morfologi” og “inflammatorisk respons” med netværk snesevis af 24 og 23, henholdsvis. Netværket score er baseret på en hypergeometriske fordeling og beregnes med den højre-tailed Fishers eksakte test, hvilket indebærer, at der er et 1 i 10

23 eller 10

24 sandsynlighed for enten netværk skete fra en tilfældig liste af gener (tabel 4, figur S4, S5). Især differentielt methylerede gener havde en stor tilstedeværelse i disse netværk, interagere med vigtige gener i æggestokkene tumor udvikling, herunder

AKT

,

PI3K

,

VEGF

, og østrogen receptor.

diskussion

Dette arbejde repræsenterer en af ​​de største undersøgelser af methylering ved hjælp af flere normale og tumor undertyper af gynækologiske kræftformer. Vi oprindeligt undersøgt status methylering af 27,578 steder i 49 prøver, herunder normal æggeleder og endometrium, serøs ovariecancer, endometrioide ovariecancer, primær endometrioide endometriecancer, og æggestokkene metastase af endometriecancer. Uanset tumor eller normal status, viste alle prøver lignende profiler i den samlede fordeling af methylerede sites. Selvom vi ikke fandt globale forskydninger mod hyper- eller hypometylering tværs af de analyserede prøver, en delmængde af prøver viste drastisk ændret methylering for X-kromosomet, i overensstemmelse med tab af det inaktive X-kromosom, forstærkning af den resterende aktive X, eller begge [28 ]. Eksempler på aneuploidi, herunder autosomer, er almindelige i high-grade serøs ovariecancer og er ikke direkte konstateres ved denne analyse, men påvirker proportionale methylering niveauer ved hver locus. Derfor har vi fjernet alle sonder på X-kromosomet fra vores datasæt.

Vores data bekræfter, at forskellige histologiske undertyper har forskellige mønstre af methylering. Desuden, ovarie- serøse tumorer er mere ligner den normale ovarie- og endometriale væv end til æggestokkene eller endometriske endometrioide tumorer, som er meget lig hinanden og vise drastiske og konsekvente ændringer i deres methylering. Dette resultat er i overensstemmelse med en methylator fænotype og efter aftale med en model af æggestokkene endometrioide tumorer skyldes endometriose, hvor cellerne i sidste ende stammer fra en livmoder afstamning. Endometrioide tumorer fra æggestokkene og livmoderen andel flere almindelige somatiske mutationer [6], og disse data understøtter en lignende patogen mekanisme. De markante forskelle i methylering profiler mellem histologiske undertyper understreger vigtigheden af ​​at karakterisere tumorer på det molekylære niveau for at udvikle skræddersyede behandlingsstrategier.

Til identifikation af differentielt methyleret loci, brugte vi kendt etiketter og blindet (data- rettet) undergrupper. Kendte mærker identificeret et par dusin gener, nogle med karakteriserede roller i kræft i æggestokkene. i betragtning af den strenge bar for statistisk signifikans i at teste et meget stort antal af websteder, fandt vi, at et par outliers i en gruppe kunne tilsløre vigtige mønstre. Ved clustering data i en fordomsfri tilgang, fandt vi lignende methyleringsmønstre blandt normale prøver og nogle tumor outliers, hvilket indikerer, at de nuværende histologiske subtypning strategier kan gå glip af vigtige molekylære forskelle mellem tumorer. Dette punkt blev yderligere understøttet i metastatiske endometrioide tumorer, som også indeholdt en outlier, der lignede en normal prøve i sine methylering mønstre. Vores klyngedannelse tilgang klart identificeret et sæt af 500 gener, der kunne adskille de fleste af serøse prøver fra endometrioide prøver og normale kontroller. Selvom klyngedannelse var karakteristisk for de tre vigtigste klasser af prøver, dets anvendelse udelukket en statistisk vurdering af betydningen af ​​gener i sættet. Ikke desto mindre er den øgede magt clustering 49 prøver identificeret yderligere 60 loci, der var uafhængige af klyngedannelse sæt og segregerede prøver i normale eller serøse undertyper med statistisk signifikans. Flere af disse gener svarer til netværk impliceret i udviklingen af ​​ovariecancer (fig S4 og S5). Vi undersøgte overlapningen mellem gen lister af statistisk signifikante gener er identificeret i de overvågede og uovervågede tilgange og fundet 10 gener. Især kinase

PDPK1

er i PI3K signalvej involveret i serøs ovariecancer [37].

PDPK1

og

PLEKHF1

dele en pleckstrin homologi domæne, der kan binde inositol polyphosphater.

PARP3

er involveret i DNA-reparation og genom stabilitet. I betragtning af den reproducerbare signal fra disse gener uanset metode, konkluderer vi, at ikke-karakteriserede gener i denne liste er stærkt impliceret i æggestokkene tumor udvikling og kræve yderligere karakterisering.

En begrænsning af vores analyse er, at vi ikke screene tumoren DNA for genmutationer eller få kendskab genekspressionsniveauer; alligevel, fandt vi, at

RB1 ​​

RBAK

er differentielt methylerede mellem papillære serøse og normale æggeleder prøver.

RB1 ​​

blev for nylig rapporteret af TCGA at være involveret i serøs tumor ætiologi gennem mutation eller sletning i 67% af tumorer [38]. Inddragelsen af ​​

RB1 ​​

vej er i overensstemmelse med samtidig RB1 og TP53 mutation i mus, som simulerer karakteristika for aggressive serøse æggestokkene kræftformer, herunder dannelse af ascites og metastaser [39]. Selvom vi ikke fandt betydeligt overlap med listen over methylerede gener i serøse tumorer offentliggjort af TCGA, kan dette uoverensstemmelse skyldes metodologiske spørgsmål. For eksempel har vi ikke begrænser gen listen til kandidater, der bliver hypermethyleret og fundet mange, der mister methylering. Desuden krævede vi, at scoring være konsekvent blandt alle tumorer. TCGA grænser scoring til de øverste 10% af tumorer. Derudover har vi ikke begrænse resultaterne til gener, der bliver lyddæmpet, som methylering har vist sig at forårsage både positive og negative lovgivningsmæssige resultater [40].

Vores analyse af methylering profiler i æggestokkene og endometrie tumorer viser værdien i at karakterisere tumorer på det molekylære niveau. Den methylator fænotype indikerer en afvigelse i den molekylære funktion af enzymer, der regulerer DNA methylering niveauer og foreslår, at et molekyle handler opstrøms af kandidatgener er ansvarlig for den kaskade af begivenheder, der fører til tumor udvikling. Studier i hepatocellulært carcinom har identificeret mutationer i beta-catenin-gen i forbindelse med et methylator fænotype. Mutationer i beta-catenin er også almindelige i endometrie tumorer [1], og foreslå opfølgende eksperimenter til at vurdere et direkte forhold til DNA methylering i endometrioide tumorer. Desuden bør terapeutiske strategier til forebyggelse af omfattende methylering (såsom 5-aza-2′-deoxycytidin) blive evalueret i forbindelse med tumorer med en methylator fænotype.

Konsistensen af ​​methylering profiler, trods uafhængig prøve forberedelse og indsamling af data til TCGA prøver, blev brugt til at validere og udvide vores resultater. Disse data viser, at prøve batch virkninger er minimal og ikke forstyrrer data konsistens. Vores data giver et fundament for fremtidige genomiske og genetiske analyser af endometriske og serøse tumorer til diagnostiske og behandlingsmæssige applikationer. Især vores resultater viser, at methylering niveauer i serøse tumorer er mindre konsekvent end endometrioide tumorer, men forøge og formindske i en target-afhængig måde. I modsætning endometrioide tumorer viser omfattende ændringer, der er sandsynligvis knyttet til en fælles opstrøms mekanisme gået galt.

Materialer og metoder

prøvetagning

æggestokkene, endometrie og fallopian rør væv var modtaget fra Tissue Procurement Program for Magee-Womens Hospital (Pittsburgh, PA). Vævene blev lynfrosset efter kirurgi og opbevaret ved -80 ° C. Genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af Puregene Blood Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. DNA kvalitet blev vurderet ved hjælp af en SmartSpec Plus spektrofotometer (BioRad, Hercules, CA).

Endometriale normale prøver

Vævsprøver blev leveret af Cooperative humant væv Network, som er finansieret af National Cancer Institut. Prøver er fra postmenopausale individer med atrofisk endometrium og blev opnået fra rutinemæssig hysterektomi eller bækken resektion for ikke-livmoderkræft. DNA blev isoleret efter protokollen af ​​Trizol reagens (Invitrogen).

Anvendelse af menneskelige emne materiale blev godkendt af University of Pittsburgh og Office of personmotiver Forskning på NIH.

TCGA data

TCGA data blev hentet på tidspunktet for denne analyse fra data portal (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). Data fra samme parti indeholdt umatchede serøse tumorer og normale fallopian rør prøver. Normals: TCGA-01-0639-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0631-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0642-11A-02D-0383-05, TCGA-01-0628- 11A-01D-0383-05, TCGA-01-0637-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0633-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0630-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0636-11A-01D-0383-05.