Abstrakt
Interleukin-6 (IL-6) er involveret i lunge cancer tumorigenese, tumor progression, metastase, og medikamentresistens. Tidligere undersøgelser viser, at blokering af IL-6-signalering kan inhibere tumorvækst og øge lægemiddelfølsomhed i musemodeller. Kliniske forsøg i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) viser, at IL-6 målrettet terapi lindrer NSCLC-relaterede anæmi og kakeksi, selv om andre kliniske virkninger kræver yderligere undersøgelse. Vi krydsede
IL-6
– /-
mus med
Kras
G12D
mutant mus, der udvikler lungetumorer efter aktivering af mutant
Kras
G12D
, at undersøge, om IL-6 hæmning bidrager til tumor progression og overlevelse tid
in vivo
.
Kras
G12D
;
IL-6
– /- mus udviste øget tumorigenese, men langsommere tumorvækst og længere overlevelse, end
Kras
G12D
mus. Endvidere for at undersøge, om
IL-6
sletning bidrager til undertrykkelse af lungekræft metastase, vi genererede
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
;
IL-6
– /- mus, der udviklede lungekræft med en tendens til reduceret metastaser og længere overlevelse end
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
mus. Tumorer fra
Kras
G12D
;
IL-6
– /- mus viste forøget ekspression af TNF og nedsat ekspression af CCL-19, CCL-20 og phosphoryleret STAT3 (pSTAT3) end
Kras
G12D
mus; men disse ændringer ikke var til stede mellem tumorer fra
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
;
IL-6
– /- og
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
mus. Opregulering af pSTAT3 og phosphoryleret AKT (Pakt) blev observeret i
Kras
G12D
tumorer med
p53
sletning. Taget sammen indikerer disse resultater, at
IL-6
deletion accelererer tumorigenese men forsinkelser tumorprogression og forlænger overlevelsestiden i en
Kras
-driven musemodel for lungekræft. Imidlertid kan disse effekter blive svækket af
p53
sletning
Henvisning:. Tan X, Carretero J, Chen Z, Zhang J, Wang Y, Chen J, et al. (2013) Tab af
p53
dæmper bidrag
IL-6
Sletning på Undertrykt Tumor Progression og Udvidet overlevelse i
Kras
-Driven Murine Lung Cancer. PLoS ONE 8 (11): e80885. doi: 10,1371 /journal.pone.0080885
Redaktør: Victoria Lawson, University of Melbourne, Australien
Modtaget: Maj 29, 2013; Accepteret: 8 oktober 2013; Udgivet 15. november, 2013 |
Copyright: © 2013 Tan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde er støttet af NIH (CA122794, CA140594, CA163896, CA166480, CA154303, og Lung SPORE P50CA090578), United mod lungekræft, American Lung Association, Susan Research Fund Spooner (KKW), kinesiske National Key Program på Basic Research (2012CB945100, 2011CB504202 ) og National Natural Science Foundation of China (31.030.040). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
mere tyder, at betændelse bidrager til tumorigenese, tumor progression, og metastase [1,2]. Onkogen-associeret inflammation fører til produktion af inflammatoriske cytokiner, såsom interleukin-6 (IL-6) [3,4], en pleiotropisk cytokin involveret i inflammation, immunitet, knoglemetabolisme, neural udvikling, reproduktion, og hæmatopoiese [5]. Imidlertid er IL-6 også forbundet med forøget risiko for lungekræft [6-8]. kan detekteres IL-6 i ånde kondensat af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [9], og i serum hos nogle lungekræftpatienter, men er ikke detekterbar i patienter med benign lungesygdom [10]. Forhøjet IL-6 niveauer bidrager til malignt pleura effusion [11,12], postoperative komplikationer [13], og postoperative gentagelse [14] for lungekræft. Flere undersøgelser har korreleret højt cirkulerende IL-6 niveauer med dårlig overlevelse lungekræftpatienter [15-23]. IL-6-medieret inflammation korrelerer med invaliderende cancerrelaterede symptomer som træthed, tromboemboli, kakeksi, og anæmi [3], og IL-6-signalering aktivering korrelerer med lungekræft kemoterapi modstand [16,24]. Disse undersøgelser antyder en vigtig rolle for IL-6 i flere aspekter af lungekræft.
IL-6-ekspression kan påvises i lungetumorer [25] og i 53% af lungekræft cellelinier [26], og IL-6 pathways aktiveres i et menneske lungecancer stamcellelinie [27-29]. Funktionelle assays tyder på, at IL-6 påvirker evnen hos cancerceller til at metastasere til fjerne steder [30,31], og at IL-6 fremmer tumorvækst i en parakrin måde
in vivo
[4,26,32] . Derfor er det måske ikke overraskende, at
IL-6
knockdown, genetiske ablation, eller behandling med en neutraliserende IL-6-antistof hæmmer tumorvækst
in vivo
[4,33]. Omvendt aktivering af IL-6-signalering bidrager til resistens over for epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) inhibitorer i en musemodel for NSCLC [34,35], mens blokade forøger lægemiddelfølsomhed i xenograftmodeller [34].
An IL-6 monoklonalt antistof terapi ville forudsiges at inhibere den inflammatoriske mikromiljø i lungekræft. En sådan terapi, ALD518, har undergået præklinisk og klinisk fase I og II forsøg. Det synes at være veltolereret og forbedrer NSCLC-relaterede anæmi og kakeksi [3], selv om den samlede kliniske resultater kræver yderligere undersøgelse.
For at vurdere bidraget af IL-6-signalering hæmning på tumor progression og overlevelse tid
in vivo
, vi krydsede
IL-6
– /-
mus med mutant
Kras
G12D
mus, fordi IL-6 er en downstream effektor af onkogen Ras at fremme tumorigenese [4]. NSCLC er ofte diagnosticeret med metastaser og har en dårlig prognose. Den behandling og forebyggelse af lungekræft metastaser er store udækkede behov [36]. Inaktivere mutationer i
p53
findes i mindst 50% af NSCLC sager [36], og
Kras
G12D
aktivering ledsaget af
p53
sletning kan forårsage lunge tumor metastase [37]. For at undersøge funktionen af IL-6 i metastase, vi også genereret
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
;
IL-6
– /- mus ..
Materialer og metoder
Mus
IL-6
– /-
mus blev købt fra The Jackson Laboratory og vedligeholdes i sterilt boliger [38]. Betinget
Lox-Stop-Lox Kras
G12D
(i det følgende benævnt
Kras
G12D
) mus [39] og
p53
flox /flox
mus [40] blev beskrevet tidligere.
Kras
G12D
og
Kras
G12D
;
IL-6-
– /-
mus blev podet med 5 x 10
6 PFU adenovirale Cre (adeno-Cre) ved intranasal indånding for at aktivere onkogene
Kras
G12D
i lungerne.
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
;
IL-6
– /-
mus blev podet med 5 x 10
5 PFU adeno-Cre. Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Dana-Farber Cancer Institute (tilladelse nummer 04-094). Alle operationer blev udført under Avertin anæstesi for at minimere lidelser. Efter eutanasi, organer, herunder hjerte, lever, milt, nyre, mave, tarm, rygsøjle, hjerne, bryst, hud, og testis eller ovarie, blev gennemgået brutto inspektion for metastaser. Lungetumorer klæbet til lungehinden blev anset parietale pleurale metastaser. Formodede metastaser blev høstet og bekræftet af histologiske træk.
Histologi og immunhistokemi
Efter eutanasi blev lungerne fjernet og fikseret i 10% neutral bufferet formalin natten over, før indlejring i paraffin. Fem-mikrometer sektioner af muse lungevæv blev skåret. Nogle sektioner blev farvet med H BrdU (ab6326, Abcam) ved 1: 200; Ki67 (ab15580, Abcam) ved 1: 200; Endomucin (14-5851, eBioscience) ved 1: 100; spaltet Caspase-3 (9661, Cell Signaling) ved 1: 300. Digest-All 2B Trypsin (Invitrogen) blev anvendt til at hente antigen til MAC2 (CL8942AP, Cedarlane) farvning ved 1: 5000. Hos 400X forstørrelse blev alle MAC2-positive makrofager i tumorer optalt inden for 3 mikroskopfelter med de mest MAC2-positive makrofager efter gennemgang af hele lunge sektion. Tre mus pr genotype blev analyseret.
Proliferation analyse
20 uger efter infektion blev musene injiceret intraperitonealt med 10 pi 10 mM BrdU i PBS pr gram kropsvægt og aflivet efter 2 timer. Hele lunger blev høstet og forarbejdet som beskrevet ovenfor. Hos 400X forstørrelse blev alle BrdU-positive tumor cellekerner optalt inden for 3 mikroskopfelter med de mest BrdU-positive kerner efter gennemgang af hele lunge sektion. Fire mus pr genotype blev analyseret. Samme metode blev anvendt til at beregne Ki67-mærkede tumorceller på sektioner fra mus 28 uger efter infektion med adeno-Cre.
Western blotting
Lung tumorer blev høstet fra
Kras
G12D
og
Kras
G12D
;
IL-6-
– /-
mus 32 uger efter infektion og fra
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
;
IL-6
– /-
mus 15 uger efter infektion til Western blot-analyse. Tumorer blev lyseret med en homogenisator i RIPA-buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM natriumchlorid, 1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA) indeholdende komplette mini proteaseinhibitorer (Roche) og phosphataseinhibitorer (5870 , cellesignalering). Nuklear og Cytoplasmatisk Extraction Kit (CW199B, Cowin Biotech Co., Ltd Kina) blev anvendt til at udtrække cytoplasmatisk (C) og nuklear (N) fraktioner fra tumorer. Lysater (20 ug pr bane) blev adskilt på 10% polyacrylamidgeler, overført til PVDF-filtre, og inkuberet natten over ved 4 ° C med antistoffer til p-actin (SC-1615 Santa Cruz), pERK (4376, Cell Signaling), total-ERK (9102, Cell Signaling), Pakt (4060, Cell Signaling), total-AKT (4685, Cell Signaling), pSTAT3 (9145, Cell Signaling), STAT3 (sc-7179, Santa Cruz), p65 (sC- 372, Santa Cruz), PARP (9532, Cell Signaling), GAPDH (TA-8, Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Kina), eller β-catenin (ab32572, Abcam). Western blots blev udsat for X-ray film eller scannet med en ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare).
Kvantitativ real-time PCR
mRNA blev ekstraheret fra tumorer i
Kras
G12D
og
Kras
G12D
;
IL-6-
– /-
mus 32 uger efter infektion og
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
;
IL-6
– /-
mus omkring 16 uger efter infektion til analyse. 2 ug total RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse SuperRT cDNA syntese kit (Beijing Cowin Biosciences Co, Ltd Kina). Real-time PCR blev udført under anvendelse af BioRad iQ5 Realtime PCR-system og StepOnePlus Realtime PCR-system (ABI) med Realtime PCR Master Mix indeholdende SYBR Green (QPK-201, TOYOBO, Japan) og unikke primere (tabel S1). Tre til fire prøver for hver gruppe var detected.Gene ekspressionsresultater blev normaliseret for p-actin mRNA.
Statistisk analyse
Den studerendes
t
-test blev anvendt til at evaluere læsion antal og antallet af BrdU eller Ki67- positive celler. Fishers eksakte test evalueret metastatisk sats. Kaplan-Meier-analyse evalueret overlevelsestid. Ekspressionssystemer forskelle blandt fire grupper blev analyseret ved ANOVA.
P
. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Resultater
IL-6
sletning accelererer onkogen
Kras
G12D
induceret lunge tumorigenese
Som tidligere beskrevet,
Kras
G12D
mus udviklede lungetumorer efter en lang latenstid [39].
IL-6
– /- mus udviklet normalt [38], og viste ikke lungetumorer gennem 54 ugers alderen (data ikke vist). Efter adeno-Cre indånding, PCR-analyse bekræftede rekombination af den betingede
Kras
G12D
allel (figur S1).
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus havde en median overlevelse på 37 uger efter adeno-Cre podning, betydeligt længere end
Kras
G12D
mus (
P
0,0001) (tabel 1). Mus blev aflivet efter 2, 4, 20, 28 og 32 uger efter infektion, og lungelæsioner i H IL-6
– /-
mus havde tidlige lungelæsioner. På 4 uger efter infektion,
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus havde mere tidlige lungelæsioner end
Kras
G12D
mus (figur 1A-C). Disse læsioner var atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH) og epitelial hyperplasi (EH) i bronkioler, som rapporteret tidligere [39].
Genotype
Antal behandlet
Median overlevelse (uger) *
Survival område ( uger)
IL-6
– /-
13 54
Kras
G12D
1434.627.9 ~ 39,0
Kras
G12D; IL-6
– /-
38 37,0
a29.3 ~ 46,7
p53
flox /flox
8 52
p53
flox /flox; IL-6
– /-
9 52
Kras
G12D; p53
flox /flox
4316.311.1 ~ 19,7
Kras
G12D; p53
flox /flox; IL-6
– /-.
44 17,4
b12.7 ~ 23.4Table 1. Sammenligning af lungekræft kohorter
en
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus havde signifikant længere overlevelse end
Kras
G12D
mus (
P
0,0001).
b
Kras
G12D
; p53
flox /flox
; IL-6
– /-
mus havde signifikant længere overlevelse end
Kras
G12D
; p53
flox /flox
mus (
P
0,01). * Median ventetid vist er efter adeno-Cre behandling ved 6-10 ugers alderen, anslået af Kaplan-Meier analyse. CSV Hent CSV
(A og B) Repræsentative billeder af H 0,01. (D og E) Repræsentative billeder af H 1,5 mm) i
K
og
KI
mus (
n
= 6) 28 uger efter infektion med adeno-Cre . De viste data er middelværdien + S.E.M. *
P
0,05. (G og H) Repræsentative billeder af H 1,5 mm) i
K
og
KI
mus (
n
= 6) 28 uger efter infektion med adeno-Cre . De viste data er middelværdien + S.E.M. **
P
0,01. (J og K) Repræsentative billeder af Endomucin-farvede lunge vævssnit fra (J)
K
og (K)
KI
mus 28 uger efter infektion med adeno-Cre. Scale bar indikerer 500 um i (A, B, D, E, G og H), eller 100 um i (J og K). Forkortelser:
K
=
Kras
G12D
.
KI
=
Kras
G12D
;
IL-6
– /-.
IL-6
sletning forsinker onkogen
Kras
G12D
-induceret lunge tumor progression
på 20 uger efter infektion, lunge tumorer i
Kras
G12D
; IL-6
– /- iBooked.dk mus beskedent mindre og mindre tæt end i
Kras
G12D
mus (Figur 1D og E). På 28 uger efter infektion, sammenlignet med
Kras
G12D
mus, blev der observeret flere læsioner i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus med hovedparten af læsioner i tidlige stadier af tumor udvikling (figur 1F). Dog tumorer 3-10 mm i diameter blev observeret i lungerne af
Kras
G12D
mus, mens størstedelen af
Kras
G12D
; IL-6
– /-
lungetumorer var mindre end 1,5 mm (Figur 1G-I). Yderligere, selv om IL-6-signalering fremmer hudens tumorvækst og angiogenese i en parakrin måde [4], vi ikke opdage nogen forskel mellem
Kras
G12D
og
Kras
G12D
; IL-6
– /-.
Mus efter immunhistokemisk farvning med Endomucin, en mikrokar tæthed markør til måling af angiogenese-indeks (figur 1J og K)
IL -6
sletning dæmper lunge tumor spredning
For at afgøre, om tumor spredning påvirkes af
IL-6
sletning
in vivo
målte vi BrdU-mærkning celler i lungetumorer. Betydeligt færre mærkede kerner blev observeret i lunge sektioner fra
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus 20 uger efter infektion med adeno-Cre sammenlignet med dem, der stammer fra kontrol
Kras
G12D
mus (Figur 2A-C). Lignende resultater blev observeret fra Ki67 farvning i lunge sektioner fra
Kras
G12D
og
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus 28 uger efter infektion med adeno-Cre (figur S2). Angivelse af pERK, der fungerer nedstrøms Kras og er forbundet med cancer celleproliferation, blev reduceret i tumorer fra
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus 20 uger efter infektion med adeno-Cre sammenlignet med
Kras
G12D
mus (figur 2D og E). Caspase-3 farvning viste ingen forskelle i tumor celle apoptose mellem
Kras
G12D
og
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus (figur 2F og G).
(A og B) Repræsentative billeder af BrdU-farvede lunge vævssnit fra (A)
K
og (B)
KI
mus 20 uger efter infektion med adeno -Cre. (C) Kvantificering af BrdU-positive tumorceller i lungevæv sektioner af
K
og
KI
mus (
n
= 4) 20 uger efter infektion med adeno- Cre. *
P
0,05. (D og E) Repræsentative billeder af Perk farvede lunge vævssnit fra (D)
K
og (E)
KI
mus 20 uger efter infektion med adeno-Cre. (F og G) Repræsentative billeder af spaltede caspase-3-farvede lunge vævssnit fra (F)
K
og (G)
KI
mus 28 uger efter infektion med adeno-Cre. Pile angiver Caspase-3-positive tumorceller. Scale bar indikerer 50 um i (A, B, F og G), eller 100 um i (D og E). Forkortelser:
K
=
Kras
G12D
.
KI
=
Kras
G12D
;
IL-6
– /-.
IL-6
sletning forlænger overlevelsen af
Kras
G12D
;
p53
flox /flox
mus
Som tidligere rapporteret, der blev ikke konstateret metastaser eller lokale invasioner i
Kras
G12D
mus [39], og lignende resultater blev observeret i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus.
Kras
G12D
aktivering ledsaget af
p53
sletning kan forårsage lunge tumor metastase [37], således
Kras
G12D
; p53
flox /flox
; IL-6
– /-.
Mus blev genereret for at undersøge indflydelsen af
IL-6
sletning på lungekræft metastaser
p53
allelisk rekombination bekræftedes ved PCR (fig S3).
IL-6
sletning øget median overlevelse på
Kras
G12D
; p53
flox /flox
mus (
P
0,01) (tabel 1) trods betydelig lunge tumor byrde i både
Kras
G12D
; p53
flox /flox
Kras
G12D
; p53
flox /flox
; IL-6
– /-
mus 12 uger efter infektion (figur 3A og B). BrdU-farvning angivet begge grupper af lungetumorer var yderst proliferativ (figur 3C og D), og pERK ekspression var høj i begge grupper (figur 3E og F); ingen statistiske forskelle blev observeret.
Repræsentative billeder af lungerne (A og B), BrdU farvning (C og D), pERK farvning (E og F) og tumor metastaser (G og H) fra
KP
(A, C, E og G) og
KPI
(B, D, F og H) mus 12 uger efter infektion med adeno-Cre. Stiplede linjer (G og H) viser metastatisk tumor kanter. Stjerner angiver centrum af metastatiske tumorer. Scale bar indikerer 500 um (A, B, G og H), 50 um (C og D) eller 100 um (E og F). Forkortelser:
KP
=
Kras
G12D
; p53
flox /flox
.
KPI
=
Kras
G12D; p53
flox /flox
;
IL-6
– /-
.
Til sammenligning 17
Kras
G12D
; p53
flox /flox
; IL-6
– /-
mus og 19
Kras
G12D
; p53
flox /flox
mus blev analyseret for metastaser omkring 16 uger efter infektion med adeno-Cre (tabel 2). Histologisk blev metastaser findes i fem af 17
Kras
G12D
; p53
flox /flox
; IL-6
– /-
mus (29,4%) og 10 af 19
Kras
G12D
; p53
flox /flox
mus (52,6%), selv om denne forskel var ikke signifikant (
P
= 0,19). Metastatiske læsioner i parietal lungehinden, blev der observeret thymus (figur S4A og B), og lymfeknuder i både
Kras
G12D
; p53
flox /flox
Kras
G12D
; p53
flox /flox
; IL-6
– /-
mus (figur 3G og H). Heart metastaser (figur S4C) blev observeret i to af 19
Kras
G12D
; p53
flox /flox
mus (tabel 2). Salg steder af metastaser
Kras
G12D; p53
flox /flox
Kras
G12D; p53
flox /flox; IL-6
– /-
lymfeknuder node10 af 19 (52,6%) 5 af 17 (29,4%) Thymus1 af 19 (5,3%) 1 af 17 (5,9%) Heart 2 af 19 (10,5 %) 0 af 17Table 2. Webstedet og hyppigheden af metastaser fra primære lungetumorer.
CSV Hent CSV
IL-6
sletning ændrer, men
p53
sletning dæmper, nogle inflammatoriske cytokiner
For at undersøge, om
IL-6
sletning inflammation, vi målte makrofag tæthed ved hjælp MAC2 farvning [41]. Ingen væsentlige ændringer i makrofag antal blev observeret blandt tumorer fra
Kras
G12D
, Kras
G12D
; IL-6
– /-
, Kras
G12D
; p53
flox /FLOX
, og
Kras
G12D
; p53
flox /flox
; IL-6
– /-
mus (Figur 4A-E). Vi målte også ingen ændring i CD3 ekspression, en T-celle markør, i nogen af de fire tumor grupper (fig S5B).
(AD) Repræsentative billeder af MAC2-farvede lunge vævssnit fra (A)
K
og (B)
KI
mus 28 uger efter infektion og fra (C)
KP
og (D)
KPI
mus 12 uger post infektion med adeno-Cre. (E) Kvantificering af MAC2-positive makrofager i lunge tumorer fra
K
,
KI, KP
, og
KPI
mus (
n
= 3 ). Ingen statistisk forskel blev observeret. (F og G), Gene ekspression af IL-1β, TNFa, CCL-7, CCL-19, CCL-20, CXCL-5, CCL-8 og CCL-24 i tumorer fra
K
,
KI, KP
, og
KPI
mus blev bestemt ved real-time PCR. Tre til fire tumorer for hver gruppe blev detekteret og tredobbelte PCR’er blev udført. Genekspression blev normaliseret for p-actin mRNA. *
P
0,05 vs.
K
tumorer. Forkortelser:
K
=
Kras
G12D
.
KI
=
Kras
G12D
;
IL-6
– /-
.
KP
=
Kras
G12D
; p53
flox /flox
.
KPI
=
Kras
G12D; p53
flox /flox
;.
IL-6
– /-
Flere cytokiner spiller en vigtig rolle i den inflammatoriske behandle. Listen omfatter IL-1, TNFa og IL-6. Kemokiner repræsenterer den største familie af cytokiner og klassificeres i polypeptid-grupper af placeringen af cysteinrester nær aminoterminalen (fx C-C, C-X-C, eller CX3C) [42]. Onkogent Ras inducerer sekretionen af ELR1 + CXC kemokin familie at fremme tumorigenese [43]. Nogle chemokiner og vækstfaktorer er involveret i tumorudvikling [42], så vi screenet inflammatoriske cytokin ændringer i tumorer med real-time PCR. Tre prøver hver tumor gruppe blev anvendt til at udføre real-time PCR uden gentagelse. Der var ingen signifikante forskelle fundet for IL-1α, CXCL-1, CXCL-5, CXCL-9, CXCL-12, CXCL-16, TGF-p2, BMP-2, BMP4, CCL-2, CCL-7, CCL-8 , CCL-9, CCL-22, CCL-28 og CX3CL-1-ekspression blandt fire grupper af tumorer (Figur S5). De screening Resultaterne viste nogle skiftende tendenser i nogle inflammatoriske cytokiner (Figur S5). Vi bekræftede ændringerne hjælp tredobbelte real-time PCR-reaktioner med 3 til 4 prøver i hver gruppe. Forhøjet udtryk for TNF og reduceret ekspression af CCL-19 og CCL-20 blev påvist i tumorer fra
Kras
G12D
; IL-6
– /- iBooked.dk mus sammenlignet med
Kras
G12D
mus. Men disse ændringer var fraværende, mellem tumorer fra
Kras
G12D
; p53
flox /flox
Kras
G12D
; p53
flox /flox
; IL-6
– /-
mus. Mens ingen statistiske forskelle i IL-1β, CCL-7, CCL-8, CCL-24 og CXCL-5 genekspression blev bekræftet blandt fire tumor grupper (Figur 4F og G).
Vi undersøgte også den nukleare lokalisering af NF-KB-underenhed p65, hvilket er vigtigt i cancerrelateret inflammation og malign progression [44,45]. Der blev imidlertid ingen signifikant lokalisering ændring observeret blandt tumorer fra de fire genotyper (figur S6). Og ingen dramatisk ændring blev observeret i β-catenin ekspression i nucleus (Fig S6), som er relateret til lungekræft udvikling [46]. Angivelse af pSTAT3, som er den vigtigste nedstrøms mål af IL-6, blev reduceret i nogle
Kras
G12D
; IL-6
– /-
tumorer (figur 5), men steg i
p53
slettede tumorer. Disse data viste, at
IL-6
sletning ændret tumor udtryk for nogle inflammatoriske cytokiner, selv om disse ændringer blev svækket af
p53
sletning.
tumorlysater blev udvundet fra
K
og
KI
mus 32 uger efter infektion og fra
KP
KPI
mus 15 uger efter infektion til Western blot-analyse. Western blot resultater af pSTAT3 og total-STAT3 blev scannet af en ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare). Andre resultater blev eksponeret for røntgenfilm. Forkortelser:
K
=
Kras
G12D
.
KI
=
Kras
G12D
;
IL-6
– /-
.
KP
=
Kras
G12D
; p53
flox /flox
.
KPI
=
Kras
G12D; p53
flox /flox
;
IL-6
– /-
Diskussion
Forrige. undersøgelser har vist, at kræftfremkaldende tumordannelse hos
IL-6
– /-
mus forsinkes med 1-2 uger [4,47]; Men vi fandt ingen forskel i
Kras
G12D
-induceret tumor debut uanset
IL-6
mangel. En mulig forklaring er, at
Kras
G12D
aktivering kan fremkalde lunge tumorigenese mere håndfast end andre kræftfremkaldende stoffer.
Nogle inflammatoriske cytokiner er forbundet med tumorudvikling [42]. TNFa kan fungere som tumor promotor ved at regulere en kaskade af cytokiner, kemokiner, adhæsioner matrixmetalloproteinaser (MMP’er) og pro-angiogene aktiviteter [2,48]. I denne undersøgelse,
IL-6
deletion i
Kras
G12D
tumorer opreguleret TNF udtryk. Forhøjet udtryk for TNF kan kompensere for tabet af IL-6 og dermed øge tumorigenese. Dog er tumor progression forsinkes i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
mus, i overensstemmelse med tidligere resultater [4,47]. Disse data viser, at
IL-6
er vigtig for tumorudvikling
in vivo
og antyder, at IL-6-inhibering kan have bifasiske fase-specifikke virkninger i lungekræft, øge tumorigenese tidligt under samtidig undertrykkelse tumor progression senere. Følgelig kan dette udgøre en risiko for patienter med lungecancer behandlet med IL-6-målrettet terapi.
CCL-20 (eller makrofag pro-inflammatorisk chemokin-3α, MIP-3α), en C-C-motivet chemokin, overudtrykkes i pancreas carcinomceller og stimulerer væksten af tumorceller [49]. CCL-19 (eller makrofag inflammatorisk protein-3 beta, MIP-3β), spiller en vigtig rolle i migrationen af modne dendritiske celler og T-celler [50]. Både dendritiske celler og T-celler er tveæggede sværd i tumormikromiljøet, at der indledes potente anti-tumor immunrespons, kan disse celler også stimulere cancervækst og spredning celle [51,52]. Vedvarende aktiveret eller tyrosin-phosphoryleret STAT3 (pSTAT3) er fundet i 50% af lunge adenokarcinomer [53,54]. pSTAT3 kan forbedre tumor spredning og tab af pSTAT3 arrestationer vækst i præmaligne læsioner, næsten ophævelse af udviklingen af avancerede tumorer [55]. I denne undersøgelse,
IL-6
deletion i
Kras
G12D
tumorer medført nedregulering af pSTAT3, CCL-19 og CCL-20. pERK udtryk blev reduceret i
Kras
G12D
; IL-6
– /-
tumorer 20 uger efter infektion (figur 2), men steg i de fleste
Kras
G12D
; IL-6
– /-
tumorer 32 uger efter infektion (figur 5). Disse data tyder på, at tidlig fase, tumorvækst kan blive forsinket af en lav udtryk for pERK, pSTAT3 og CCL-20. Under senere stadier, kan tumorvækst induceres ved opregulering af pERK og TNF, selv om disse mekanismer har brug for yderligere undersøgelse.
Vores data viser, at
p53
sletning mere dramatisk påvirket
Kras
G12D
induceret lungekræft end
IL-6
sletning. p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s001
(TIF)
Figure S2. **
P
0,01. p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s003
(TIFF)
Figure p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s004
(TIF)
Figure . p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s005
(TIF)
Figure p53
flox/flox
;
IL-6
-/-
.
doi:10.1371/journal.pone.0080885.s006
(TIFF)
Table S1.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.