PLoS ONE: Lad-7 MicroRNA Family selektivt udskilles i det ekstracellulære miljø via Exosomer i et metastatisk gastrisk kræft cellelinje

Abstrakt

Baggrund

Exosomer spiller en stor rolle i celle-til-celle kommunikation, målrettet celler til at overføre exosomal molekyler, herunder proteiner, mRNA, og microRNA’er (miRNA) ved en endocytosis- lignende pathway. miRNA er små ikke-kodende RNA-molekyler i gennemsnit 22 nucleotider i længde, der regulerer talrige biologiske processer, herunder cancer patogenese og medierer gen nedregulering ved at målrette mRNA’er at inducere RNA-nedbrydning og /eller interferere med translation. Nylige rapporter indebærer, at miRNA stabilt kan detekteres i cirkulerende plasma og serum, da miRNA emballeres ved exosomer, beskyttes mod RNA-nedbrydning. Således profilering exosomal miRNA er behov for at afklare intercellulære signalering og opdage en ny sygdom markør så godt.

Metodologi /vigtigste resultater

Exosomer blev isoleret fra dyrkede kræftceller og deres kvalitet valideret ved analyser af transmissionselektronmikroskopi og western blotting. En af de testede cellelinier, en metastatisk gastrisk cancercellelinie, AZ-P7a, viste den højeste RNA udbytte i de frigivne exosomer og karakteristisk form i morfologi. Desuden blev RNA’er isoleret fra celler og dyrkningsmedier, og profiler af disse tre miRNA fraktioner blev opnået ved anvendelse af microarray analyse. Ved at sammenligne signalintensiteter af microarray data og efter validering anvendelse af RT-PCR-analyse fandt vi, at lade-7 miRNA familie var rigeligt i både intracellulære og ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler, mens lav metastatisk AZ-521, stamcellen linje af AZ-P7a, samt andre kræft cellelinjer viste ingen sådan tilbøjelighed.

konklusioner /betydning

berigelse af lad-7 miRNA familie i de ekstracellulære fraktioner, især i exosomer fra AZ-P7a celler kan afspejle deres onkogene karakteristika, herunder tumorgenese og metastase. Da lad-7 miRNA generelt spiller en tumor-undertrykkende rolle som målrette onkogener såsom

RAS

HMGA2

, vores resultater tyder på, at AZ-P7a celler frigiver lad-7 miRNA via exosomer i ekstracellulære miljø for at bevare deres onkogenese

Henvisning:. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) Lad-7 MicroRNA Family selektivt udskilt i det ekstracellulære miljø via Exosomer i en metastatisk gastrisk cancercellelinie. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10,1371 /journal.pone.0013247

Redaktør: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Tyskland

Modtaget: 14. april, 2010; Accepteret: 10. september 2010; Udgivet: 8 Okt 2010

Copyright: © 2010 Ohshima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af en bevilling i samarbejde med innovativ teknologi og avanceret forskning i evolutional Area (CITY AREA) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

celler udskiller forskellige typer af små membranvesikler. Exosomer er en af ​​vesiklerne med 30-100 nm diameter og fysisk-kemisk forskelligt fra andre secernerede vesikler [1]. Inde exosomer, cellulære genprodukter, herunder proteiner, mRNA, og microRNA’er (miRNA) er pakket og disse molekyler kan overføres til modtagende celler til at levere deres molekylære signalering såsom onkogenese [2] – [4] og immunrespons [1], [ ,,,0],5]. Exosomer frigives af mange typer af celler [6], som omfatter tumorceller, epitelceller og hæmatopoietiske celler, såsom reticulocytter, cytotoksiske T-lymfocytter, Epstein-Barr-virus-transformerede B-celler, mastceller, dendritiske celler og blodplader. Udskilles exosomer er blevet isoleret og karakteriseret

in vitro

fra dyrkede cellelinier [7] sammen med

in vivo

i kropsvæsker [7] herunder blod [8], urin [9], spyt [10], fostervand [11], og maligne pleuraekssudat [12]. Da observeret i mange prolifererende celletyper, er det tænkeligt at forværre tumorceller, hvilket fremgår af deres øgede tilstedeværelse i plasma og pleurale effusioner af patienter med cancer [8], [12]. Denne øgede tilstedeværelse i ikke-invasive kropsvæsker af kræftpatienter har accelereret at profilere molekylære komponenter i exosomer for at opdage klinisk anvendelige tumormarkører og biomarkører [3], [7], [13].

miRNA er en klasse af ikke-kodende små RNA’er, der er involveret i post-translationel regulering af genekspression ved inhibering både stabilitet og translation af mRNA’er [14]. De seneste oplysninger har vist, at miRNA mutationer eller misexpression korrelerer med forskellige menneskelige kræftformer og viser, at nogle miRNA kan fungere som onkogener eller tumor undertrykkere [15], [16]. For at analysere RNA, er det altid at overveje deres stabilitet fra nedbrydning af RNase. Nylige resultater viser, at endogene plasma miRNA i blodprøver er stabilt påvises i en form, som er resistent over for RNase-aktivitet [17], vist ved identifikation af miRNA i legemsvæsker, såsom blod [17] – [24], urin [25], og spyt [10], [26].

Dyrkede cancerceller er blevet anvendt for at søge efter tumormarkører. Især har der identificerer proteiner og peptider udskilles i dyrkningsmedierne udviklet af proteomics tilgang [27], [28]. Som for molekylær signatur i exosomer, har proteomics samt transcriptomics analyser udført for at afsløre tumorigenese og identificere tumor markør kandidater [2] – [4], [7], [29]. Her identificere miRNA relateret til tumorgenese og metastase, vi udførte omfattende miRNA analyse i tre cellulære fraktioner, herunder celler, exosomer og medium fra dyrkede celler. Ranking data i disse intracellulære og ekstracellulære miRNA opnået ved microarray analyse, fandt vi, at lade-7 miRNA familie er rig på alle fraktioner fra AZ-P7a celler, en metastatisk gastrisk cancercellelinie, som producerer homogen og kondenseret morfologi, og høj genvinding sats på exosomal miRNA. Disse resultater var forskellige fra andre cellelinjer, herunder lungekræft cellelinier (SBC-3, NCI-H69, og DMS53), kolorektale cancer cellelinjer (SW480 og SW620), og AZ-521, den parentale cellelinje af AZ-P7a. I betragtning af, lad-7 miRNA familie funktioner primært som tumorsuppressorgener [30] til at målrette onkogener såsom

RAS

og høj mobilitet gruppe A2 (

HMGA2

) [31], foreslår vi, at AZ -P7a celler selektivt udskiller lad-7 miRNA i det ekstracellulære miljø via exosomer til at opretholde deres tumorigene og metastatiske tilbøjeligheder.

Resultater

Isolering af exosomer fra forskellige cancer cellelinjer

exosomer fremstilles af indre celler til ekstracellulære miljø via en exocytose-lignende pathway [1]. Foruden kropsvæsker såsom serum og plasma fra perifert blod [7], [8], exosomer er fundet i mediet af dyrkede celler [7], hvilket letter identifikation af exosomal molekyler, herunder proteiner, mRNA’er, og miRNA til målet for deres kliniske anvendelse. Profiling sådanne exosomal molekyler produceret i dyrkede cancerceller har ført til at opdage en hidtil ukendt kandidat markør og antigen til kræftdiagnostik og immunterapi [7]. I denne undersøgelse med henblik på profilering exosomal miRNA, vi først isoleret exosomer fra dyrkningsmedier af 46 cancercellelinier med forskellige vævstyper, som omfatter 8 til maven, 16 for lunge-, 5 for colon, 9 for pancreas, 3 for prostata og 5 for brystkræft. Efter celler blev dyrket i 48 timer blev exosomer opsamlet med en kombination af successiv centrifugering og molekylvægt cut-off membraner som beskrevet i Materialer og Metoder. Deres renhed af exosomal fraktioner blev bedømt ved analyser af transmissionselektronmikroskopi og western blotting. Transmissionselektronmikroskopi viste rund form vesikulære membranstrukturer omtrent i størrelse på 100 nm i diameter. Blandt tre cellelinier, SBC-3, AZ-521, og AZ-P7a, er det af interesse, at morfologien fra AZ-P7a celler var mere homogen og kondenseret end andre celler (figur 1A). Immunoelektronmikroskopi viste, at de ekstracellulære partikler isoleret fra dyrkningsmediet fra AZ-P7a celler havde immunreaktivitet med et antistof mod CD63, et af de exosomal membranproteiner, på kapsulære membraner (figur 1B). Tilstedeværelsen af ​​kendte exosomal proteiner, herunder CD29 /β1-integrin, Aip1 /Alix og tumor modtagelighed gen 101 (Tsg101) blev bekræftet ved Western blot-analyse, mens et protein lokaliseret til endoplasmatisk reticulum, Bip /Grp78, kunne ikke påvises (Figur 1C). Dette resultat viser, at forureningen af ​​materiale fra andre cellulære rum i exosomal fraktioner var minimal. Udbyttet af exosomal proteiner fra AZ-P7a celler var 10 gange højere end fra AZ-521 celler; ~2.5 Mg proteiner blev opnået fra 1 × 10

8 AZ-P7a celler.

A. Morfologisk karakterisering af exosomer afledt af AZ-P7a, AZ-521, og SBC-3-celler ved transmissionselektronmikroskopi. B. immunoelektron mikrografier af AZ-P7a exosomer mærket med immunoguld anti-CD63. Exosomer med sorte kolloide guldpartikler på kapsel-membraner blev observeret som positiv CD 63 farvning under transmission elektron mikroskop (pilespidser). C. Molekylær karakterisering af exosomer afledt af AZ-P7a, AZ-521, og SBC-3-celler ved Western blot-analyse. Protein ekstrakter (10 ug) fremstillet af celler (C) eller exosomer (Ex) blev vurderet ved hjælp af antistoffer mod exosomal proteinmarkører (CD29 /β1-integrin, Aip1 /Alix, og Tsg101) og en endoplasmatisk reticulum markør (Bip /Grp78).

Berigelse af exosomal RNA’er afledt fra AZ-P7a celler

Efter isolation, exosomal samlede RNA’er blev isoleret fra 46 dyrkede cellelinier. Interessant RNA udbytter fra AZ-P7a celler langt større end dem fra andre celler (figur 2A). Fordelingen i længden viste tilstedeværelsen af ​​store mængder af små RNA’er i exosomer (midterpanelet, figur 2B). Det skal bemærkes, at der er en signifikant forskel i total exosomer og exosomal miRNA niveauer mellem patienter med lunge-adenocarcinom og kontroller [8]. AZ-P7a cellelinie blev etableret ved gentagen podning af de parentale AZ-521-celler i mus, resulterede i høj peritoneal-metastatisk potentiale [32], [33]. Således kan høje udbytter af både RNA og protein sammen med de morfologiske karakteristika i AZ-P7a celler tilskrives deres høje tumorigene og metastatiske tilbøjeligheder. Da der er påvist miRNA i cellefrie kropsvæsker [17] – [20], udførte vi også direkte isolering af totale RNA’er fra dyrkningsmedium uden procedure til isolering af exosomer. Mængderne af de samlede RNA fra dyrkningsmedier var generelt større end dem fra exosomer (figur 2A). RNA fordeling i længden viste, at miRNA fraktioner blev detekteret i intervallet fra 10 til 40 nukleotid længde i RNA’er fremstillet fra dyrkningsmedium (højre panel) samt exosomer (midterpanelet) fra AZ-P7a celler (figur 2B). Ifølge producentens protokol for Bioanalyzer, toppe med længere end 40 nukleotid længde indeholde andre små RNA’er, herunder tRNA’er på 70~90, 5S ribosomalt RNA ved 100, og 5,8S ribosomalt RNA ved 150, som observeret i det intracellulære fraktion (venstre panel) . Disse resultater antyder, at miRNA kan eksistere i dyrkningsmediet uden for exosomal fraktion selvom RNA’er menes at være beskyttet mod RNaser som værende pakket i exosomer. Især i forhold til klæbende celler, tilvæksten af ​​RNA udbytter var bemærkelsesværdigt større i flydende celler (NCI-H69 og Lu-135) eller celler med mix populationer af flydende og adhærerende celler (Colo205), som kan afspejles af forurening af RNA skur fra lyserede celler, der har været uafbrudt tilbage i kulturmedier.

A. Mængden af ​​totale RNA’er udvundet fra exosomer (lavere panel) og dyrkningsmedier (øverste panel). Mængden af ​​totale RNA’er per celle blev vist. B. Distribution i længde RNA. Isolerede totale RNA’er fra exosomer og dyrkningsmediet fra AZ-P7a celler blev påvist under anvendelse Bioanalyzer. Resultatet af cellulære samlede RNA blev vist til sammenligning.

miRNA profilering af microarray analyse

miRNA profiler i de intracellulære og ekstracellulære fraktioner blev bestemt ved microarray analyse for syv kræft cellelinjer, herunder AZ-521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, og SW620. Prøver fra kulturmedier samt exosomer forudsat hybridiseringssignaler (figur 3), hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​miRNA i disse prøver. Hidtil, analysere microarray data for miRNA blandt prøver, er der ikke klare metoder til normalisering af signal intensitet, da det er vanskeligt at finde en passende intern standard materiale [34]. Således har miRNA microarray data generelt været analyseret uden normalisering, under forudsætning af, at den samlede mængde af input RNA er konstante blandt prøver [34], [35]. I denne undersøgelse efter gennemsnit miRNA microarray data mellem to replikater, vi rangeret miRNA efter deres signalintensiteter. Vi fandt, at lade-7 miRNA familien såsom lad-7a, lad-7b, lad-7c, lad-7d, lad-7e, lad-7f, lad-7 g, og lad-7i blev påvist med relativt høje signaler i det meste de intracellulære fraktioner fra de syv cellelinier (tabel 1, figur 3). Men ingen eller små signalintensiteter for de lad-7 miRNA blev påvist i de ekstracellulære fraktioner, undtagen både ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler og dyrkningsmedium fraktion fra NCI-H69-celler (tabel 1, figur 3). Især i begge de ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler, alle otte lad-7 miRNA blev detekteret selv rang af lad-7g var lavere end andre syv lad-7 miRNA. Baseret på de forskellige mønstre af lad-7 miRNA niveauer blandt de tre cellulære fraktioner, vi opdelt syv cellelinjer i tre grupper (figur 3) som følger; (1) AZ-P7a, celler, der lader-7 miRNA blev fundet i alle de tre fraktioner, (2) AZ-521 sammen med SBC-3, DMS53, SW480, og SW620, celler, der lader-7 miRNA blev generelt fundet i kun intracellulære fraktioner, (3) NCI-H69, celler, der lader-7 miRNA blev fundet i de intracellulære fraktioner samt i dyrkningsmediet til en vis grad.

miRNA profiler i celler (C), exosomer ( ex), og dyrkningsmedier (CM) blev opnået ved miRNA microarray analyse. Y-aksen repræsenterer log

2 af hybridiseringssignaler, vist med barer og fyldte kasser. Pilene i venstre side fra flok af signaler repræsenterer signaler svarende til lade-7 miRNA familien, herunder lad-7a (rød), lad-7b (gul), lad-7c (lys grøn), lad-7d (mørkegrøn) lad-7e (himmelblå), lad-7f (blå), lad-7 g (navy blå), og lad-7i (lilla).

RT-PCR-analyser af intracellulær og ekstracellulær lad-7 miRNA familie

Vi derefter udført kvantitativ RT-PCR for otte lad-7 miRNA familie til at validere microarray data. Lad-7 miRNA blev let påvises i de intracellulære og ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler (figur 4A) og AZ-521-celler (figur 4B). Niveauerne af lad-7 miRNA pr input RNA var generelt højere i de ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler end fra AZ-521 celler. Til normalisering af niveauerne af target miRNA opnået ved RT-PCR, er U6 snRNA været almindeligt anvendt som en intern kontrol. Vi observerede forekomst af U6 snRNA i alle tre fraktioner fra AZ-P7a celler og AZ-521 celler (figur 4C) og derefter sammenlignet niveauerne af lad-7 miRNA mellem de tilsvarende fraktioner fra disse to cellelinier. Efter normalisering, niveauerne af lad-7 miRNA herunder lad-7a, lad-7b, lad-7c, lad-7d, lad-7e, og lad-7i i både fraktionerne af exosomer og dyrkningsmedier fra AZ-521-celler var sænket i forhold til dem fra AZ-P7a celler. Tværtimod var der ingen stor forskel i niveauerne af intracellulære lad-7 miRNA. Vi næste sammenlignet niveauet af exosomal Lad-7a fra AZ-P7a celler med dem fra andre kræftceller, herunder SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 og SW620, og fandt, at Lad-7a niveau kun fra SW620 celler var forholdsvis tæt (0,7 gange) til niveauet fra AZ-P7a celler (Figur 4E). Det skal bemærkes, at det intracellulære niveau af lad-7a fra SW620-celler var ca. 3,5 gange mere rigelige end fra AZ-P7a celler. Baseret på disse resultater antog vi lokalisering af lad-7a i fraktionerne af celler og exosomer (figur 5), og en yderligere analyse. Normaliseret ved U6 niveauer, vi beregnede relative niveauer af lad-7a pakket i exosomer pr niveauerne af cellulære lad-7a (Figur 4F). Som et resultat, mængden af ​​exosomal Lad-7a var meget større i AZ-P7a celler end andre seks celler, hvilket antyder, at AZ-P7a celler selektivt og aktivt udskiltes lad-7 miRNA familie i det ekstracellulære miljø gennem exosomer.

A, B. Niveauer af modent lad-7 miRNA familien, herunder lad-7a, lad-7b, lad-7c, lad-7d, lad-7e, lad-7f, lad-7 g, og lad-7i i celler (skraverede søjler), exosomer (udfyldte søjler) og dyrkningsmedium (åbne søjler) fra AZ-P7a celler (A) og AZ-521-celler (B). Hvert miRNA niveau blev analyseret under anvendelse kvantitativ RT-PCR. Tærskelcyklen (Ct) værdi præsenteres som middelværdi ± SD (n = 4). C. Niveauer af U6 snRNA i celler (skraverede søjler), exosomer (fyldte søjler), og dyrkningsmedium (åbne søjler) fra AZ-P7a og AZ-521 celler påvises ved kvantitativ RT-PCR-analyse. Tærskelcyklen (Ct) værdi præsenteres som middelværdi ± SD (n = 4). D. Relative mængder af lad-7 miRNA familie i celler (skraverede søjler), exosomer (fyldte søjler), og dyrkningsmedium (åbne søjler) fra AZ-521 celler versus AZ-P7a celler. Den stiplede linje og pil repræsenterer niveauerne af lad-7 miRNA familie i AZ-P7a celler, vist som 100%. Niveauerne af U6 snRNA i hver prøve blev anvendt som intern standard for normalisering mængder af lad-7 miRNA. Undtagen lad-7f og lad-7g, blev niveauerne af lad-7 miRNA reduceret i de ekstracellulære fraktioner. E. Relative mængder af lad-7a i celler (skraverede søjler) og exosomer (fyldte søjler) fra 7 kræftceller herunder AZ-P7a, AZ-521, NCI-H69, SBC-3, DMS53, SW480 og SW620 celler. Den stiplede linje repræsenterer niveauerne i AZ-P7a celler, der er vist som 1. Niveauerne af U6 snRNA i hver prøve blev brugt til normaliserede mængder af lad-7a. Værdien af ​​fold-change præsenteres som middelværdi ± SD (n = 3) fra prøver uafhængigt fremstillet ud fra cellekultur. F. Relative mængder af exosomal lad-7a i 7 cancercellelinier. Den stiplede linie repræsenterer niveauet i AZ-P7a celler, vist som 100%.

Baseret på resultaterne opnået ved mikroarray og RT-PCR-analyser blev disse modeller trukket. I sammenligning mellem AZ-P7a celler (til venstre) og AZ-521cells (i midten), normaliseret for mængden af ​​U6 snRNA (åbne trekanter), mængden af ​​exosomal Lad-7a miRNA (udfyldte trekanter) i AZ-521 celler var ca. 3 % af det i AZ-P7a celler, mens den intracellulære mængde i AZ-521-celler var snarere 1,4 gange større end i AZ-P7a celler (Figur 4E). Disse modeller anvendes på seks af otte lad-7 miRNA familien testet, herunder lad-7a, lad-7b, lad-7c, lad-7d, lad-7e, og lad-7i. I SW620-celler (højre), mængden af ​​lad-7a var 3,5 gange større end i AZ-P7a celler, mens mængden af ​​exosomal Lad-7a var 0,7 gange mindre end i AZ-P7a celler (Figur 4E).

diskussion

i den foreliggende undersøgelse viste vi, at lade-7 miRNA familien blev udskilt i det ekstracellulære miljø gennem exosomal transport, som var specifikke for en metastatisk gastrisk cancercellelinie, AZ-P7a . Lad-7 miRNA familie i human består af 10 sekvenser fra 13 forstadier [30]. Generelt Lad-7 miRNA fungere som en tumor suppressor ved målretning onkogener som

RAS

HMGA2

og lad-7 miRNA er nedreguleres i mange kræftformer fra faste organer [31]. AZ-P7a celler besidder en metastatisk evne med peritoneal udbredelse i nøgne mus [32], [33]. Således foreslår vi, at exosomal frigivelse af lad-7 miRNA i det ekstracellulære miljø resulterer i fald i anti-tumorigen virkning i cellerne, som fører til at opretholde deres onkogenese og invasivitet. På den anden side, lad-7 miRNA mindre hyppigt spille et onkogent funktion, på grund af stigning af ekspression ved hypomethylering på lad-7 locus [36] eller målretning caspase-3 mRNA [37]. I dette tilfælde kan exosomal frigivelse af lad-7 miRNA forårsage transformation i målceller ved at overføre deres onkogene egenskaber.

Hos patienter med lungekræft, øge det samlede niveau af exosomer og deres miRNA sammenlignet med kontroller [8 ]. Det er blevet påvist, at tumorceller exosomer forsøgt immun flugtmekanismen i cancere ved spontan T-celle apoptose [38] – [40]. I denne undersøgelse har vi vist homogen morfologi og berigelse af RNA i exosomer fra metastatisk AZ-P7a celler. Dette kan komme til udtryk ved deres tumorigenicitet.

miRNA er meget stabile i blodplasma og serum siden beskyttet mod RNaser [17]. Således, det gør miRNA niveauer testet for klinisk diagnose som tumormarkører og biomarkører. Hvordan sker det? Chin et al. har foreslået to hypoteser for kilden til miRNA på cirkulerende blodprøver; det kan skyldes et resultat af tumorcelledød og lyserer eller frigivelse af tumorceller i den ekstracellulære mikromiljø af blodkar [19]. Tværtimod til adhærente celler, observerede vi, at mængden af ​​totale RNA’er i dyrkningsmedier var relativt højere end i exosomer for celler med flydende ejendom, såsom NCI-H69, Lu-135, og Colo205. Denne stigning resulterede sandsynligvis i forurening af RNA fra døde celler i kulturmedier.

For opdagelsen af ​​nye blod tumormarkører og biomarkører, omik tilgange herunder proteomics og transcriptomics gennemføres enten ved direkte analyse af blodprøver eller ansøgning af profilering i vævsprøver. Der er modstridende rapporter hvis hvorvidt profiler miRNA og mRNA i blodbanen er parallelle med tumoren profil. Underskrivelsen af ​​exosomal miRNA afspejler, at de med oprindelse tumorceller hos patienter med lunge adenocarcinom [8] og brystkræft [41]. På den anden side, Skog et al. har vist, at microarray analyse for mRNA afledt af glioblastom-celler og de tilsvarende exosomer afsløret mRNA’er udelukkende påvist i mikrovesikler, spekulerer, at mRNA’er er lokaliseret til en specifik region af cytoplasma [3]. Desuden Tanaka et al. har demonstreret, at niveauet af MIR-92a faldt i blodplasmaet af akutte leukæmi patienter mens dens stærke ekspression blev fundet i vævsprøverne [24]. Vores resultater på selektiv berigelse af lad-7 miRNA familie i AZ-P7a celler afledt exosomer fit med sidstnævnte tilfælde. Medmindre målmolekyler er miRNA afledt af cirkulerende tumorceller, antyder omhyggelig undersøgelse er nødvendig for, at miRNA profiler i vævsprøver til påvisning i serum- eller plasmaprøver.

Da exosomer fremstilles i hæmatopoietiske celler samt epitelceller cirkulerende blod indeholder exosomer afledt fra begge typer celler. Generelt at undersøge exosomal profiler af proteiner, mRNA’er og miRNA i serum og plasma, er exosomer afledt af tumorer med epiteliale karakteristika adskilt fra dem fra hæmatopoietiske celler [8], [13]. Dette udføres ved anvendelse af affinitetsoprensning med antistoffer mod molekyler, såsom EpCAM som udtrykker på overfladen af ​​epitelceller. Vores resultater, at der var tilsvarende niveauer af lad-7 miRNA familie mellem exosomer og dyrkningsmedier fra AZ-P7a celler tyder på, at disse miRNA niveauer kan måles uden at isolere exosomer fra kliniske prøver såsom serum og plasma.

I konklusion, denne undersøgelse viste, at lade-7 miRNA familie er rig på exosomer fra en metastatisk gastrisk cancercellelinie, AZ-P7a celler. Da lad-7 miRNA er involveret i proliferation proces [31], deres exosomal sekretion, kan spille en vigtig rolle i tumorgenese og metastase.

Materialer og metoder

Cell kultur

humane mavekræft cellelinjer (AZ-521, MKN45, KATOIII, og NUGC-3), human lunge cancer cellelinier (SBC-3, Lu-65, Lu-135, og KNS-62), og menneskelige bugspytkirtelkræftceller ( Suit-2) blev købt fra japansk Indsamling af Research Bioressourcer. Menneskelige mave kræftceller (SNU-1), human lunge cancer cellelinjer (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, og HCC827), humane lungehindekræft celler (MSTO-H211), humane kolorektale cancer cellelinjer (SW480, SW620, Colo205, LoVo, og HCT116, menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinier (BxPC-3, aSPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, og Capan-2), human prostatacancer-cellelinier (PC-3, SU145, og LNCaP) og human brystcancer-cellelinier (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, og MDA-MB-231) blev købt fra American Type Culture Collection. MKN28 (human mave kræftceller) og PSN-1 (human bugspytkirtelkræftceller) blev købt fra Immuno-Biological Laboratories og europæisk Indsamling af Cell Culture henholdsvis . Humane mavekræft cellelinjer, AZ-P7a [32], [33] og MKN45P [42] var gave fra Drs. Yutaka Yonemura og Yoshio Endo. I AZ-521 og AZ-P7a celler, blev der ikke RT-PCR-produkter observeret i 14 retrovira herunder HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, og ADV type 1 (data ikke vist), undtagen infektion med disse retrovira i både cellelinier . Celler blev opretholdt i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) tilsat 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin.

Produktion og isolering af exosomer

klæbende celler blev podet til 150 mm-retter på passende antal celler fra 3 × 10

6 til 1 x 10

7 celler pr fad, mens flydende celler blev podet i 75 cm

2-kolbe på 2~2.5 × 10

7 celler pr kolbe. Celler blev dyrket i komplet RPMI-1640 medium på 25 ml og 50 ml til retter og kolber, henholdsvis i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO

2, vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS), og inkuberet 48 timer i phenolrødt-frit RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, som tidligere var depleteret kontaminerende mikrovesikler ved overnight centrifugering ved 100.000 x g. Exosomer blev isoleret fra de totale celler, der spænder fra 6 × 10

7 Hvis til 3 × 10

8 celler som tidligere beskrevet [29]. Kort fortalt blev dyrkningsmediet opsamlet og centrifugeret ved 800 x g i 5 min og yderligere 2.000 x g i 10 minutter til fjernelse løftet celler. Supernatanten blev underkastet filtrering på en 0,1 um porestørrelse polyethersulfon membranfilter (Corning) for at fjerne cellerester og store vesikler, efterfulgt af koncentration af en 100.000 MW afskæringsmembran membran (Centriplus-70, Millipore). Volumenet af supernatanten blev reduceret fra ca. 250-500 ml til ca. 30 ml. Supernatanten blev derpå ultracentrifugeret ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C under anvendelse 70Ti rotor (Beckman Coulter). De resulterende pellets blev resuspenderet i 6 ml PBS og ultracentrifugeret ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C under anvendelse 100Ti rotor (Beckman Coulter).

Transmissionselektronmikroskopi

De pelleterede exosomer blev blandet med lige mængder af frisk fremstillet 2% glutaraldehyd i PBS, inkuberet natten over ved 4 ° C, efterfikseret med 1% osmiumtetroxid i PBS ved 4 ° C i 2 timer, og dehydreres i en gradueret serie af ethanol. Efter dehydrering blev prøverne overført til propylenoxid og indlejret i epoxyharpiks Quetol 812 (Nisshin EM). Ultratynde snit blev skåret med Ultracut UCT (LEICA), farvet med uranylacetat og bly citrat og observeret med JEM-1230 (JEOL). Immunoelektron mikroskopisk analyse blev udført ifølge fremgangsmåden beskrevet af Xiao et al. [43] med mindre modifikationer. Kort fortalt blev exosomer blandet og inkuberet med muse-anti-humant CD63-monoklonalt antistof (katalog nr. Sc-51.662, Santa Cruz) i 1 time ved stuetemperatur. Prøven blev dryppet på membranoverfladen af ​​en kobbernet (collodium /carbon overtrukket 400 mesh, Nisshin EM) og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS, immunoguld konjugeret ged anti-mus IgG (katalog nr. EM.GMHL15, BBInternational) fortyndet til 1:20 blev dryppet på membranen. Den kobbernet flød i dråberne med dens membranoverflade konfronteret ned ved stuetemperatur i 30 min. Efter vask med PBS blev uranylacetat dråber kastes på kobbernet overflade og farvet ved stuetemperatur i 30 s. Exosomer med sorte kolloide guldpartikler på kapsel-membraner blev markeret som positiv under transmission elektronmikroskop.

Western blot-analyse

Celler og exosomal fraktioner blev vasket, resuspenderet i en lysepuffer [7,5 M urinstof (Sigma-Aldrich), 2,5 M thiourinstof (Sigma-Aldrich), 12,5% glycerol (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-octyl-beta-D-glucosid (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- carboxyethyl) phosphin, hydrochlorid (Sigma-Aldrich), 1,25 mM proteasehæmmer (katalog nr. P2714, Sigma-Aldrich)], og inkuberet i 1 time ved 4 ° C under anvendelse af Rotator RT-50 (TAITEC). Efter centrifugering ved 14.000 x g i 60 minutter ved 4 ° C blev supernatanten opsamlet og proteinkoncentration blev bestemt ved Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad). En portion af proteiner (10 ug) blev denatureret ved kogning i Laemmli-prøvebuffer, kørt på 10% SDS-polyacrylamidgeler og overført til Immobilon-P-PVDF-membraner (0,45 um porestørrelse, Millipore). Blottene blev blokeret i 1 time med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,01% Tween 20). Efter blokering blev membranerne inkuberet med hvert primært antistof eller antiserum herunder kanin-anti-Tsg101 serum (katalog nr. T5951, Sigma-Aldrich), gede-anti-Aip1 /Alix serum (katalog nr. Sc-49.268, Santa Cruz), muse-monoklonalt anti-CD29 /β1-integrin (katalog nr. sc-610.468, BD Biosciences) og monoklonalt muse-anti-Bip /Grp78 (katalog nr. 610.979, BD Biosciences) ved en fortynding på 1:200 i 1 time ved stuetemperatur. Blottene blev derefter inkuberet med det tilsvarende anti-IgG sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (Jackson Laboratories) ved en fortynding på 1:2,000 i 1 time ved stuetemperatur. Specifikke proteiner blev visualiseret ved hjælp af ECL-systemet (GE Healthcare) og FUJIFILM Selvlysende Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Molekylvægten protein blev udledt under anvendelse af Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad Laboratories).

RNA Isolation

I RNA-isolering fra dyrkningsmediet blev celler podet som beskrevet ovenfor.