PLoS ONE: Knockdown af glutamat Cystein Ligase katalytiske subunit af siRNA Årsager Gold Nanopartikler cytotoksicitet i lungekræft Cells

Abstrakt

Guld nanopartikler (BNI) har vist lovende medicinske anvendelser i kræftbehandlingen involveret i reguleringen af intracellulær redox balance. Vi har tidligere rapporteret, at BNI kan udløse apoptose og nekrose i humane lungecancer-celler (A549), når L-buthionine-sulfoximin (BSO) blev anvendt til at formindske ekspressionen af ​​intracellulær glutathion (GSH). Heri, vi undersøgte cytotoksicitet BNI mod lungekræft celler under glutamat cystein ligase katalytiske subunit (GCLC) blev bragt til tavshed af siRNA. Vores resultater viste, at BNI forårsage apoptose og nekrose i celler transficeret med GCLC siRNA ved at hæve intracellulære reaktive oxygenarter (ROS). Disse resultater viste, at reguleringen af ​​glutathion syntese af GCLC siRNA i A549 celler kan initiere guld nanopartikler-induceret cytotoksicitet

Henvisning:. Liu M, Zhao Y, Zhang X (2015) Knockdown af glutamat Cystein Ligase katalytiske subunit af siRNA Årsager Gold Nanopartikler cytotoksicitet i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 10 (3): e0118870. doi: 10,1371 /journal.pone.0118870

Academic Redaktør: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, PORTUGAL

Modtaget: 25 oktober, 2014 Accepteret: 11 Januar 2015; Udgivet: 19 Mar 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81102468 til Y. Zhao). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

for nylig interessen for guld nanopartikler (BNI) for kræft diagnose og behandling, såsom drug delivery luftfartsselskaber [1], celle targeting vektorer [2], imaging [3], strålingssensibilisering [4-7], og non-invasive ablation behandlinger [8, 9] er vokset markant. BNI tilbyder fordele i disse applikationer på grund af deres fremragende biokompatibilitet [10], stærkt lys absorption og spredning effekt [11], høj photothermal konverteringsfrekvens og fotostabilitet [12-14], facile bioconjugation og biomodification [15]. Desuden er brugen af ​​BNI som anticancermidler er blevet grundigt undersøgt. Forskellige forsøg på at indarbejde BNI i kræftbehandling er blevet foretaget.

Reduceret glutathion (GSH), den mest udbredte intracellulære thiol, er vigtige for opretholdelsen af ​​intra-cellulær redox balance og er involveret i afgiftning af eksogene og endogene stoffer såsom fremmedstoffer, ioniserende stråling, organiske peroxider og tungmetaller [16,17]. Det er blevet påvist, at en aggressiv tumor kan være følsomme over for lægemidler ved hjælp af en terapi baseret på modulationen af ​​GSH-indholdet i cancerceller [18]. Det er velkendt, at glutathion syntetiseres fra dets indgående aminosyrer i to sekventielle, katalyseret af glutamylcysteinsyntetase (GCL) og GSH-syntase. GCL består af en katalytisk underenhed (GCLC) og en modulerende underenhed (GCLM), der katalyserer det første og hastighedsbegrænsende trin og spiller en central rolle i glutathion homeostase [19]. De intracellulære GSH niveauer kan være udtømt gennem den specifikke hæmning af GCL. L-buthionine-sulfoximin (BSO), en inhibitor af GCL, er kendt for at udtømme intracellulær pulje af glutathion og derved forårsage oxidativ stress [20]. Ændringer i de specifikke aktiviteter af enzymer involveret i GSH metabolisme i kræftcellerne har været impliceret i oxidativ stress og udtømningen i GSH kan øge modtageligheden af ​​kræftceller til andre skadelige hændelser [21-23]. Vi har tidligere rapporteret, at BNI display cytotoksicitet til lungecancerceller når L-buthionine-sulfoximin (BSO) blev anvendt til at formindske ekspressionen af ​​intracellulær glutathion [24]. Så kan guld nanopartikler anvendes som potentielle lægemidler ved at regulere niveauerne af glutathion i cancerceller. Mens BSO er en slags exogene forbindelser. Indflydelsen af ​​BSO på celler funktion er uforudsigelig. I det foreliggende arbejde, vi evaluerede effekten af ​​GCLC siRNA på BNI-induceret cytotoksiciteten i lungekræft celler.

Så vidt vi ved, er der ingen undersøgelse om evaluering af roller GCLC siRNA i BNI-induceret celledød. Det primære formål med denne undersøgelse er at karakterisere cytotoksiciteten af ​​BNI i lungekræft celler, når GCLC blev slået ned af siRNA.

Materialer og metoder

Cell kultur

A549 celler (Shanghai Cell Bank, Type Culture Collection udvalg, Chinese Academy of Sciences, kat nummer: TCHu150) blev opretholdt i RPMI-1640-medium indeholdende 4,5 g /l glucose, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10% varme inaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin. Celler blev dyrket i 5% CO

2 ved 37 ° C under en fugtig atmosfære.

Transfektion af siRNA i A549-cellelinje

Gene silencing af GCLC blev udført under anvendelse af et siRNA knockdown ordning . En ikke-specifik kontrol siRNA duplex [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘], GCLC siRNA-1 duplex [5′-GCUAAUGAGUCUGACCAUU (DTDT) -3′], GCLC siRNA-2 duplex [5’-CUAUGUGGUGU UUGUGGUA (DTDT) – 3 ‘] og GCLC siRNA-3 duplex [5′-GUAGUAUUCUGAACUACCU (DTDT) -3’] blev købt fra Sigma-Aldrich. Kort fortalt blev A549-celler udpladet i plader med 6 brønde ved en tæthed på 1,5 x 10

5 per brønd. Den næste dag, celler (~ 60-70% konfluens) i hver brønd blev transficeret med den negative kontrol, GCLC siRNA (75pmol i fri for FBS RPMI1640) under anvendelse Thermo Scientific DharmaFECT transfektionsreagenser (Thermo Scientific) ifølge producentens instruktioner. En dag senere blev mediet ændret til normalt vækstmedium, og cellerne blev dyrket i yderligere 48 timer. De transficerede celler blev opsamlet og anvendt til PCR, western blot analyse, og GSH-niveauer måling [25-27].

RNA forberedelse og semikvantitativ RT-PCR

Semikvantitativ RT-PCR med β- actin som en intern kontrol blev udført for at undersøge ændringen i mRNA-ekspression af GCLC i A549-celler transficeret med siRNA’er. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger [28]. Det isolerede RNA (2 pg) fra siRNA’er behandlede celler blev revers transkriberet til enkeltstrenget cDNA i en reaktionsblanding indeholdende: 10 mmol /L dNTP, 1 ug oligo (dT) primer, 20IU RNasin og 200IU M-MLV revers transkriptase. PCR-amplifikation blev udført med 0.4μg cDNA i et reaktionsvolumen indeholdende 3pmol af hver specifik oligonucleotidprimer, 10 mmol /L dNTP, og 1.5IU Taq-DNA-polymerase. For alle reaktionerne, blev udført foreløbige eksperimenter for at bestemme antallet af PCR-cyklusser, hvor mætning forekom, og de nævnte eksperimenter blev udført med et antal cyklusser, der går forud mætning. Sekvenserne af primerne til GCLC og β-actin-ekspression analyser var: GCLC, fremadrettet primer: 5′-TCCAGGTGACATTCCAAGCC-3 ‘; reverse primer: 5’-GAAATCACTCCCCAGCGACA-3 ‘. Den termiske cykliseringsapparat enhed blev programmeret til 36 cyklusser ved 95 ° C i 30 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder. β-actin, forward primer: 5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘; reverse primer: 5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 ‘. PCR-produkter blev elektroforesebehandlet på en 2% agarosegel (Sigma-Aldrich) og visualiseret efter ethidiumbromidfarvning løbet UV-lys [29].

Western blotting

I GCLC detektion, celler dyrket i seks Tja plader blev inkuberet med negativ kontrol duplex og GCLC siRNA duplex i 24 timer, derefter dyrket med normalt vækstmedium i yderligere 48 timer. Efterfølgende blev cellerne vasket med PBS, trypsiniseret og opsamlet ved centrifugering. En mængde på 30 ug protein af hver prøve blev blandet med loadingpuffer, inkuberet ved 100 ° C i 5 minutter og separeret på en 10% SDS-PAGE. Derefter blev prøverne overført til en PVDF (polyvinylidenfluorid) membran og blokeret med 5% (w /v) skummetmælk opløst i TBS + 0,05% (v /v) Tween-20 (TBST) i en time ved stuetemperatur og probet med GCLC (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), eller β-actin (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology) ved 4 ° C natten over. Efter, blev membranerne inkuberet med et sekundært antistof (1: 4000 anti-kanin, Cell Signaling Technology) i en time, vasket 3 gange med TBST og båndene blev visualiseret under anvendelse af ECL-reagens (Thermo Scientific) [30]

.

Total intracellulær glutathion (GSH) niveauer

Cellular GSH-indhold blev analyseret ved hjælp af glutathione Kvantificering Kit (Beyotime Institute Biotechnology). 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoesyre) (DTNB) og GSH reagerer til frembringelse 2-nitro-5-thiobenzoesyre og glutathiondisulfid (GSSG). Fordi 2-nitro-5-thiobenzoesyre er en gul farvet produkt, kan GSH-koncentration i prøver måles ved 412 nm absorbans med en flerbrøndsplade læser. Kort fortalt blev celler transficeret med negativ kontrol eller tre GCLC siRNA duplex i 24 timer, dernæst dyrket i normalt vækstmedium i yderligere 48 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne høstet og derefter pelleteret ved centrifugering ved 1000 rpm i 5 minutter, resuspenderet i lysepuffer indeholdende 0,2% Triton X-100. Cellelysater blev centrifugeret ved 13.000 g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne blev anvendt til bestemmelse af total glutathion koncentrationer. GSH udtømning i GCLC siRNA behandlede celler blev angivet [31].

cytotoksicitet måling

Cytotoksicitet blev bestemt via celletælling. Vi observerede, at inhiberingen af ​​GCLC siRNA-1duplex er den mest betydningsfulde blandt tre GCLC siRNA duplex. Så blev A549-celler inkuberet med negativ kontrol eller GCLC-specifikke siRNA-1, og derefter udsat for forskellige doser af BNI til yderligere 72 timer. Endelig blev cellerne vasket med PBS, trypsiniseret med trypsin /EDTA-opløsning, og resuspenderet til et slutvolumen på en 2 ml-celle medium til yderligere måling af cellelevedygtighed. De celle numre i hver prøve blev talt under et mikroskop ved hjælp af et tællekammer Set (Qiujing Inc) [32].

Intracellulær reaktive ilt arter måling

Produktionen af ​​ROS blev målt ved hjælp af to, 7-dichlorodihydro fluorescerende diacetat (DCFH-DA, Beyotime Institute Biotechnology). DCFH-DA passivt trænger ind i celler, cellulære esteraser handle på molekylet til dannelse af det ikke-fluorescerende del DCFH, som er ionisk karakter og derfor fanget inde i cellerne. En reaktion med ROS fører til en oxidation af DCFH den yderst fluorescerende forbindelse dichloroflourescein (DCF). Kort fortalt blev celler dyrket i 6-brønds plader transficeret med den negative kontrol, GCLC siRNA-1 under anvendelse af Thermo Scientific Dharma fect transfektionsreagenser. En dag senere blev cellerne behandlet med BNI (20 um), BNI (20 uM) og eksogent GSH (1 mM) eller BNI (20 uM) og ROS scavenger N-acetyl-L-cystein (NAC, 1 mM) for yderligere 72 timer. Derefter blev cellerne vasket med PBS i tre gange og efterfølgende behandlet med 10 pM DCFH-DA. Efter inkuberet i 30 minutter blev cellerne trypsiniseret, opsamlet ved centrifugering og resuspenderet i PBS. Fluorescensintensiteten af ​​celler (50 000) fra hver brønd blev målt med en fluorescens-spektrofotometer (Thermo Scientific), med excitations- og emissions- bølgelængder på 488 og 525 nm [33].

flowcytometrisk analyse af apoptose og nekrose

Cell optælling resultatet viste, at BNI havde hæmmende funktion på transfekterede celle overlevelse. Vi undersøgte, om årsagen til denne inhibering er enten tidlig apoptose eller sen apoptose /nekrose. Disse effekter blev bestemt med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket AnnexinV og PI-farvning (Invitrogen) ved flowcytometrisk analyse. De transficerede celler blev behandlet med BNI, BNI og GSH, BNI og NAC. Efter 72 timer blev cellerne opsamlet og vasket to gange med PBS, inkuberet med AnnexinV-FITC og PI i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Apoptotisk og nekrotiske celler blev vurderet med flowcytometri. Mindst 1 × 10

4 celler blev analyseret per prøve, og kvadrant indstillinger var baseret på kontrolprøver. Levende celler er negative for både propidiumiodid (PI) og Annexin V, tidligt apoptotiske celler er PI negative, men AnnexinV positiv, mens sene apoptotiske /nekrotiske celler er positive for både PI og AnnexinV. Alle flowcytometri blev udført ved hjælp af kommercielt tilgængeligt Cell Quest software (BD Bioscience).

Mitokondriel membranpotentiale og intracellulær kløvet caspase-3 assay

JC-1 (5, 50, 6, 60-tetrachlor-1, 10, 3, 30-tetraethylbenzamidazolocarbocyanin iodid, blev Beyotime Institute Biotechnology) anvendes til at vurdere ændringen i mitochondriemembranpotential som tidligere [24] beskrevne. A549-celler i den logaritmiske vækstfase blev udpladet i 6 brønd cellekulturplader og inkuberet i 24 timer, og derefter transficeret med negativ kontrol eller GCLC-specifikke siRNA-1. De transficerede celler blev behandlet med eller uden BNI (20 um) i 72 timer, derefter blev cellerne høstet og inkuberet med JC-1 i 30 minutter i mørke ved 37 ° C. Efter farvning blev cellerne vasket to gange med PBS og analyseret med flowcytometri [34].

I intracellulær spaltet caspase-3 blev de transficerede celler, der er behandlet med eller uden BNI opsamlet og fikseret med 4% paraformaldehyd. Efter behandling med 0,1% Triton X-100 og blokeret med 1% BSA blev cellerne inkuberet med spaltet caspase-3 (Asp175) antistof (Alexa Fluor 488-konjugat, Cell Signaling Technology) i 30 minutter. Derefter blev de farvede celler analyseret ved flowcytometri [24].

Statistisk analyse

Statistiske forskelle blev evalueret ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA) og t-test med Prism software (GraphPad software, Inc.). P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant, og dataene blev mærket med (*) for p 0,05, (**) for p 0,01, og (***) for p 0,001, henholdsvis. Hver gruppe blev testet i tre eksemplarer, og alle forsøg blev udført mindst tre gange.

Resultater

Effekten af ​​siRNA’er mod de katalytiske GCL subunits

For at undersøge knockdown effekt af tre 19-nukleotidsekvenser for katalytiske GCL underenheder blev A549-celler transficeret med negativ kontrol eller GCLC siRNA i 24 timer, efterfulgt af dyrket i yderligere 48 timer i normalt vækstmedium. Semikvantitativ RT-PCR-analyse blev udført for at undersøge GCLC mRNA-ekspression. MRNA-niveauer af GCLC blev væsentligt reduceret i A549-celler transficeret med GCLC siRNA. I modsætning hertil negativ kontrol-siRNA var mindre potent (Fig. 1A). I alle celler transficeret med GCLC siRNA, mRNA-niveauer af GCLC var homogene uden en betydelig afvigelse. I mellemtiden har vi anslået effektiviteten af ​​GCLC siRNA ved at analysere deres evne til at interferere med de udtrykte proteiner ved Western blot. Som vist i fig. 1B, GCLC siRNA inhiberede signifikant ekspressionen af ​​GCLC protein i A549-celler. De tre forskellige siRNA til katalytiske GCL underenheder differentielt forstyrret ekspressionen af ​​GCLC forhold til negativ kontrol siRNA og GCLC siRNA-1 var blandt de mest effektive.

(A) GCLC mRNA niveauer i A549-celler efter 24 timer transficeret med negativ kontrol siRNA, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 og GCLC siRNA-3. GCLC siRNA faldt betydeligt de GCLC mRNA-niveauer i A549 celler. (B) Repræsentative Western blot gel dokumenter til GCLC og sammenfattet data, der viser, at effektiviteten af ​​gendæmpning af GCLC af siRNA. Cytosoliske proteiner blev isoleret fra transficerede celler. GCLC proteinniveauer i celleekstrakter blev målt ved Western blot-analyse og blev normaliseret for p-actin ekspressionsniveauer. *** P. 0,001 sammenlignet med negativ kontrol

Effekt af GCLC siRNA på intracellulære GSH niveauer i A549 celler

GCLC er afgørende for glutathion biosyntese, som opretholder glutathion koncentrationer i intakte celler. Vi har vist, at siRNA rettet mod katalytiske GCL underenheder sænke mRNA niveauerne af GCLC og inhibere ekspression af GCLC protein i A549-celler. For at underbygge yderligere specificitet og effekt af GCLC siRNA, effekten af ​​GCLC siRNA på intracellulære GSH-niveauer blev målt [32]. Som forventet, sammenlignet med negativ kontrolgruppe, GCLC siRNA naturligvis reducerede GSH-indholdet og GCLC siRNA-1 er den mest betydningsfulde (fig. 2), som er korrespondance med de resultater, vi har observeret ovenfor. I betragtning af disse resultater blev GCLC siRNA-1 anvendes i det næste forsøg. Knock-down forsøg viste, at GCLC siRNA påvirke ekspressionen af ​​GCLC og førte til en betydelig reduktion af GSH produktion.

Cytosol blev isoleret fra celler transficeret med negativ kontrol siRNA, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 og GCLC siRNA-3. De intracellulære GSH-niveauer blev bestemt ved 412 nm absorbans med en flerbrøndsplade læser. Dataene repræsenterer gennemsnittet procentdel af den negative kontrol (n = 3) ± SD for 4 uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** P. 0,01, sammenlignet med negative kontrol

Den GCLC siRNA regulerer celledød induceret af BNI

Totalt GSH-indhold blev reduceret på en signifikant måde i A549-celler transficeret med GCLC siRNA. Når BSO blev anvendt til at formindske ekspressionen af ​​glutathion i A549-celler, viste BNI indlysende cytotoksicitet til celler [32]. Men virkningen af ​​GCLC siRNA på cytotoksiciteten af ​​BNI er stadig ukendt. Dernæst undersøgte vi, om BNI ændret A549 celler overlevelse på siRNA-medieret forstyrrelse af GCLC aktivitet. Baseret på resultaterne af knock-down eksperimenter blev A549-celler transficeret med negativ kontrol-siRNA eller GCLC siRNA-1, og derefter udsat for forskellige koncentrationer af BNI. Som kontrolforsøg, havde GCLC siRNA fremprovokere bemærkelsesværdig cytotoksicitet på A549-celler (S1 Fig.). Mens observerede vi, at BNI dosisafhængigt inhiberede væksten af ​​A549-celler forbehandlet med GCLC siRNA-1. Sammenlignet med negativ kontrolgruppe, behandling af A549-celler med 50 uM BNI resulterede i signifikant nedsat populationen af ​​levedygtige celler efter nedbryder intracellulær GSH (fig. 3).

A549-celler blev transficeret med negativ kontrol eller GCLC siRNA- 1 i 24 timer, efterfulgt af dyrket i yderligere 3 dage i fravær af BNI, efterfølgende høstet og talt. Hver søjle repræsenterer middelværdien (± SD n = 4) af tredobbelte bestemmelser. * P. 0,05 versus negative kontrol

BNI-induceret cytotoksicitet er forbundet med elevation af intracellulær ROS i GCLC siRNA behandlede celler

Da ROS er blevet foreslået som en kritisk faktor i bestemmelse af celledød mode. Vi yderligere undersøgt, om ROS deltage i reguleringen af ​​BNI-induceret celledød, når cellerne blev transficeret med GCLC siRNA. Som vist i fig. 4, efter at lukke munden på GCLC udtryk med siRNA-1, BNI resulterede i en ca. 7 gange forøgelse af ROS-niveauer sammenlignet med i negativ kontrolgruppe. Men når cellerne blev behandlet med GCLC siRNA alene, indflydelsen af ​​ROS-produktion blev ikke observeret i fraværet af BNI (S2 Fig.). Eksogent GSH og NAC betydeligt undertrykt BNI-induceret ROS produktion, som kunne beskytte GCLC siRNA behandlede celler fra cytotoksicitet BNI. Disse resultater betyder, at cytotoksicitet af BNI er i det mindste delvist forbundet med stigningen i ROS niveauer i GCLC siRNA-1 forbehandlede celler (Fig. 4).

Eksponentielt voksende celler blev transficeret med negativ kontrol og GCLC siRNA- 1 til 24 timer efter behandling med BNI (20 um), BNI (20 uM) og GSH (1 mM), BNI (20 uM) og NAC (1 mM). ROS-niveauer blev målt. Grafer indikerer ROS (som bestemt ved DCF) niveauer (%) i forhold til negative kontrol celler. Hver søjle repræsenterer middelværdien (± SD n = 4) af tredobbelte bestemmelser. ** P 0,01

BNI igangsætte apoptose og nekrose i celler transficeret med GCLC siRNA

beviser for, at BNI inducere celledød og øge produktionen af ​​intracellulær ROS fået os til yderligere at undersøge hvorvidt BNI forårsage apoptose og nekrose i GCLC siRNA behandlede celler. Dobbelt farvning af celler med Annexin V-FITC og PI blev anvendt til at skelne apoptotiske og nekrotiske celler fra normale celler. Som vist i fig. 5, BNI øget andelen af ​​AnnexinV-farvede celler, når de GSH niveauer blev nedsat med lyddæmpende GCLC udtryk. Befolkningen af ​​totale PI positive celler, der omfatter apoptose og nekrose, var også signifikant forøget i GCLC siRNA og BNI behandlede celler. Behandling med GCLC siRNA alene ikke øget bestanden af ​​apoptose og nekrose i forhold til kontrolgruppen (S3 Fig.). Disse data viste, at BNI relativt påvirke Annexin V-PI farvede celleantal i celler transficeret med GCLC siRNA. For at teste om apoptose eller nekrose blev aktiveret ved ROS, anvendte vi det exogene GSH og NAC. Behandling med GSH og NAC både undertrykte signifikant fremkomsten af ​​Annexin V og PI positive celler induceret af BNI i GCLC siRNA behandlede celler (fig. 5). Disse resultater viste, at BNI initiere apoptose og nekrose ved at hæve intracellulære ROS-niveauer i lungecancerceller forbehandlet med GCLC siRNA. Salg

Celler blev transficeret med enten ikke-target kontrol siRNA eller GCLC-specifik siRNA-1. En dag senere blev cellerne behandlet med BNI (20 um), BNI (20 uM) + GSH (1 mM) og BNI (20 uM) + NAC (1 mm) for yderligere 72 timer. AnnexinV-FITC og PI-celler blev målt med flowcytometri. (A) Den fluorescens mønster af AnnexinV-FITC og PI-farvede A549-celler efter behandling. (B) Procentdelen af ​​Annexin V-positive eller PI-positive celler for forskellige behandlinger. Hver søjle repræsenterer middelværdien (± SD n = 3). ** P 0,01, *** P. 0,001 versus kontrol

BNI forårsage depolarisering af mitochondriemembranpotential i GCLC siRNA behandlede celler

Fordi depolarisering af mitochondriemembranpotential (ATm) spiller en central rolle i apoptose [35], vi undersøgt, om BNI ændret mitrokondriemembranen i celler transficeret med GCLC siRNA-1. Den fluorescerende probe JC-1 farvestof blev anvendt til at vurdere ændringen i mitokondrielle membranpotentiale og fluorescensen shift (rød til grøn) af prøver blev målt ved flowcytometri. Vi observerede, at BNI forårsagede en stigning i grøn /rød fluorescens intensitet i GCLC siRNA behandlede celler (fig. 6). Mens celler transficeret med GCLC siRNA i fravær af BNI viste ingen ændring af mitochondriemembranpotential som sammenlignes med kontrolgruppen (S4 Fig.). Disse resultater viste, at induktionen af ​​apoptose og nekrose af BNI i GCLC siRNA forbehandlede celler er tæt forbundet med mitochondriemembranpotential.

Efter transficeret med negativ kontrol siRNA eller GCLC siRNA-1 blev celler behandlet med BNI (20 uM ) for yderligere 72 timer, derefter opsamlet og farvet med JC-1 i mørke ved 37 ° C, skyllet med PBS. Fluorescensen shift (rød til grøn) af prøver blev målt ved flowcytometri. Hver søjle repræsenterer middelværdien (± SD n = 4) af tredobbelte bestemmelser. *

s

. 0,05 sammenlignet med negativ kontrolgruppe

BNI inducerer aktivering af caspase-3 i celler transficeret med GCLC siRNA

Mitochondrial-afhængig apoptose initieres ved rekruttering og aktivering af caspase [36]. Således har vi spørger videre, om caspase-3 er aktiveret under BNI induceret apoptose i GCLC siRNA behandlede celler. Når den labile cytosolisk GSH pulje blev udtømt ved GCLC siRNA blev celler dyrket med eller uden BNI. Aktiveringen af ​​caspase-3 blev målt ved anvendelse af specifikke antistoffer, som genkender den særligt spaltet og aktiverede form ved flowcytometri. Som vist i fig. 7, BNI steget markant caspase-3 aktiviteter i GCLC siRNA behandlede celler. GCLC siRNA alene næppe påvirket aktiviteten af ​​cascase-3 i sammenligning med kontrolgruppen (S5 Fig.). Derfor BNI induceret apoptose hovedsagelig gennem mitokondrie-afhængige caspase pathway.

Aktivering af caspase-3 blev målt ved anvendelse af specifikke antistoffer ved flowcytometri. Intracellulær GSH blev udtømt ved GCLC siRNA-1, efter ca. 72 timers BNI behandling, blev cellerne opsamlet, behandlet med 0,1% Triton X-100 og blokeret med 1% BSA, derefter inkuberet med spaltet caspase-3 (Asp175) antistof ( Alexa fluor 488-konjugat) i 30 minutter. Fluorescensintensiteten blev målt ved flowcytometri. Hver søjle repræsenterer middelværdien (± SD n = 4) af tredobbelte bestemmelser. *

s

. 0,05 sammenlignet med negativ kontrolgruppe

Diskussion

I løbet af de seneste år, apoptose induktion grund af ændringer i intracellulær redox status ved visse oxidativ eller ikke-oxidative stimuli er blevet et fokus for omfattende forskning [23, 25, 37, 38]. ROS og GSH er de to store determinanter for cellulær redox ligevægt. ROS ofte forårsager cellulær skade og føre til celledød, især i høj koncentration. Farmakologisk GSH udtømning af BSO meget sensibiliserer tumorceller til apoptose induceret af kemoterapeutiske midler. Derfor manipulation af cellulær redox status betegner en levedygtig strategi for apoptose induktion af anti-cancermidler. I mellemtiden har guld nanopartikler i kræft diagnose og behandling blive den internationale forskning hot spot. Tidligere fandt vi, at GSH metaboliske vej er direkte involveret i afgiftning af BNI [24]. Når det intracellulære GSH-ekspression blev inhiberet af BSO, cytotoksiciteten af ​​BNI var indlysende. BNI fremkalde celledød ved reaktive ilt arter (ROS) generation i A549 celler med lav intracellulær glutathion [24, 32]. Geng F og kolleger har rapporteret, at samspillet mellem røntgen stråling med BNI inducerede forhøjede niveauer af ROS produktion er en af ​​de mekanismer, som BNI kan forbedre strålebehandling på ovariecancer [39]. Oxidativ stress bidrager til guld nanopartikel-induceret cytotoksicitet i human leukæmi (HL-60) og hepatom (HepG2-celler) [40]. Disse resultater er klare beviser for, at BNI kan anvendes ikke kun som bærere selv, men også som potentielle lægemidler ved at udnytte deres evne til at formindske intracellulær GSH udtryk og generere cytotoksiske reaktioner. I denne undersøgelse vi vedtager GCLC-specifikke siRNA til at inhibere ekspressionen af ​​GCLC og føre til et signifikant fald i GSH produktion, og detekteres derefter cytotoksicitet BNI. Efter behandling med GCLC siRNA blev ROS detekteret i nærvær af BNI i A549-celler. Resultatet viste, at BNI kan påvirke ROS-niveauer i GCLC siRNA behandlede celler. GSH og NAC kan eliminere ROS at neutralisere cytotoksiciteten af ​​BNI i lungekræft celler transficeret med GCLC siRNA. Disse resultater sigtet at efter banker ned af GCLC af siRNA, ROS tilskrives celledød induceret af BNI i lungecancerceller.

Det er kendt, at divergerende celledødsveje sameksistere i pattedyrceller og deres aktivering afhænger af type og intensitet af stimulus. En masse betydning er blevet givet til den apoptotiske og nekrotiske celledød i antitumorterapi [41-44]. Flere former for celledød er samtidigt induceret i BNI-eksponerede lungecancerceller med lav intracellulær GSH, herunder apoptose og nekrose. Vi observerede, at BNI kan inducere apoptose og nekrose samtidigt, når GCLC blev bragt til tavshed af siRNA i lungerne kræftceller. Disse resultater antydede, at både apoptose og nekrose er vigtig mekanisme af BNI-induceret celledød.

For at konkludere, guld nanopartikler spille mere og mere vigtig rolle i anvendelsen af ​​anti-tumor forskning. De guld nanopartikler engang konjugeret med GCLC-specifikke siRNA kan effektivt inducere tumor celledød. Men mere omfattende og dyreforsøg med forskellige dyrearter er nødvendige for at tage resultaterne af denne undersøgelse til kliniske forsøg.

Støtte Information

S1 Fig. Effekt af GCLC siRNA på celleoverlevelse i A549-celler.

Celler blev podet før transficeret med GCLC siRNA, og derefter dyrket i normalt vækstmedium. De celletal blev talt ved 48-timers intervaller for levedygtighed celler. Hver søjle repræsenterer middelværdien (± SD n = 3) af tredobbelte bestemmelser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s001

(TIF)

S2 Fig. ROS-produktion i A549-celler transficeret med GCLC siRNA.

Celler dyrket i 6-brønds plader blev transficeret med den negative kontrol eller GCLC siRNA. En dag senere blev celler dyrket i normalt vækstmedium for yderligere 48 timer og derefter behandlet med 10 pM DCFH-DA. Fluorescensintensiteten af ​​cellerne blev målt med et fluorescens-spektrofotometer. Barer repræsenterer middelværdien (± SD n = 3) af tredobbelte bestemmelser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s002

(TIF)

S3 Fig. Apoptotisk og nekrotisk respons af A549-celler transficeret med GCLC siRNA.

Efter knockdown af GCLC ekspression blev celler farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) og analyseret ved flowcytometri. Repræsentative flowcytometriske Resultaterne er vist som dot plot

doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s003

(TIF)

S4 Fig. Virkning af GCLC siRNA på mitokondrie membranpotentiale (A ^ m) i A549-celler.

Cellerne behandlet med negativ kontrol eller GCLC siRNA blev farvet med JC-1 i 20 minutter ved 37 ° C. Fluorescensen shift (rød til grøn) af prøver blev derefter detekteret under anvendelse af flowcytometri. Dataene repræsenterer middelværdien (± SD n = 3) af tre uafhængige forsøg

doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s004

(TIF)

S5 Fig. Virkning af GCLC knockdown på aktiviteten af ​​caspase-3 i A549-celler.

Fireogtyve timer efter transfektion med negativ kontrol eller GCLC siRNA blev celler opretholdt i normalt vækstmedium for yderligere 48h. Caspase-3 aktiviteter i prøverne blev bestemt under anvendelse af spaltet caspase-3 (Asp175) antistof (Alexa Fluor 488-konjugat) ved flowcytometri. Værdierne er udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg

doi:. 10,1371 /journal.pone.0118870.s005

(TIF)

anerkendelser

Forfatterne takker Dr. Xiaohu Gu og professor Yi Ding fra Shandong University School of Chemistry og Kemiteknik, til at understøtte guld nanopartikler.