PLoS ONE: epigenetisk inaktivering af IRF7 og /eller IRF5 i Lung Cancer celler fører til øget følsomhed over for onkolytiske Viruses

Abstrakt

Defekt IFN signalering resulterer i tab af medfødt immunitet og sensibiliserer celler til forøget cytolytisk drab efter Vesticular stomatitis virus (VSV) infektion. Undersøgelse af den medfødte immunitet status af normale humane bronchiale epitelceller Beas2B og 7 lungecancerceller afslørede, at ophævelsen af ​​IFN-signalering i cancerceller er forbundet med større følsomhed over for VSV-infektion. Afbrydelsen af ​​IFN-vejen i lungekræft-cellelinjer og primære tumorvæv er forårsaget af epigenetisk inaktivering af kritisk interferon responsive transkriptionsfaktorer IRF7 og /eller IRF5. Selvom 5-aza-2′-deoxycytidin behandling ikke genaktivere IRF7 og IRF5 ekspression eller beskytte celler mod VSV-infektion, manipulere IFN signalering ved at ændre IRF-ekspression ændrer den virale følsomhed af disse celler. Lung kræftceller kan være delvist beskyttet mod viral drab hjælp IRF5 + IRF7 overekspression, mens IFN pathway afbrydelse ved transfektion af siRNA’er til IRF5 + IRF7 øger cellernes sårbarhed over for virusinfektion. Derfor IRF5 og IRF7 er vigtige transkriptionsfaktorer i IFN vej, der bestemmer viral følsomhed lungekræft celler; den epigenetisk svækket IFN vej i lungekræft væv giver potentielle biomarkører for vellykket selektiv drab af kræftceller ved onkolytisk viral behandling

Henvisning:. Li Q, Tainsky MA (2011) epigenetisk inaktivering af IRF7 og /eller IRF5 i Lung Cancer celler fører til øget følsomhed for onkolytiske virus. PLoS ONE 6 (12): e28683. doi: 10,1371 /journal.pone.0028683

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: August 15, 2011; Accepteret: November 13, 2011; Udgivet: December 14, 2011

Copyright: © 2011 Li, Tainsky. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Barbara og Fred Erb Begavet Stol i Cancer Genetics Dr. Tainsky, midler fra Karmanos Cancer Institute, Molekylær Medicin og Genetik Applied Genomics Technology center på Wayne State University, og Genomforskning og Biostatistik kerner af Karmanos Cancer Institute , P30CA022453. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Som den førende årsag til kræft-relaterede dødsfald i både mænd og kvinder, lungekræft er ansvarlig for langt over 1 million dødsfald på verdensplan om året. Selv diagnose og behandling er blevet forbedret, de fem-års overlevelse er kun 14% i høj grad på grund af svigt af tumor debulking kirurgi og systemisk kemoterapi. Forbedringen af ​​lungekræft behandling er et vigtigt mål for folkesundheden. For nylig, naturligt forekommende eller genetisk manipuleret oncolytiske virus, herunder mæslingevirus, Newcastle disease-virus (NDV), VSV, adenovira, reovirus og Herpes simplex virus tilbyde en effektiv og lovende alternativ terapeutisk metode til at bekæmpe denne sygdom [1]. Anvendes alene eller i kombination med kemoterapi, oncolytiske vira selektivt ødelægger tumorceller ved at målrette kræft defekter i større veje, såsom p53 tumor suppressor, ras signaltransduktion og IFN signalveje [1], [2]. I øjeblikket effektiviteten og sikkerheden af ​​forskellige onkolytiske virus i behandlingen af ​​forskellige kræftformer evalueres i prækliniske dyremodeller og kliniske fase I-III-forsøg [3]. Blandt dem, en negativ strenget RNA-virus VSV, som kan udløse medfødte immunforsvar mekanismer, har vist sig at være effektiv mod malignt gliom, melanom, leukæmier, hepatocellulære, bryst, blære og prostatacancer, der har defekte antivirale responser. [4], [5], [6], [7].

Type I IFN signalvejen aktiveres af VSV-infektion som første linje medfødte immunforsvar til at beskytte normale væv fra viral drab, og derfor tumorceller der har mistet deres antivirale reaktivitet udgør selektive mål for VSV. Den primære respons ved viral infektion og optagelse af dobbeltstrengede RNA’er er TLR3 aktivering som medieres af IRF-3, cJun /ATF-2, og NFKB, hvorved der induceres produktion af øjeblikkelig-tidlige respons gener primært IFNp. Disse tidlige respons IFN’er binder til type I IFN receptorer (IFNAR) i en autokrin eller parakrin måde at aktivere STAT1 og inducerer ekspressionen af ​​sekundære antivirale respons gener, herunder transskription faktor IRF7 som derefter fremmer udtrykket andre IFN stimulerede gener (ISGs). Endelig den tertiære transkriptionelle bølge af IFNa etablerer et antiviralt tilstand [8], [9].

svækkelse af IFN-signalering er forbundet med en forøget risiko for tumor udvikling [10], [11], [12 ] som IFN-vejen også udviser antiproliferative og immune overvågningsaktiviteter mod kræft. Derfor er de fleste (-80%) af NCI 60 panel kræft cellelinjer display forstyrret medfødte immunitet svar [9]. Vi har vist, at IFN signalvejen blev ophævet under spontan immortalisering i fibroblaster fra Li-Fraumeni syndrom (LFS) patienter, som er disponerede for tidlig indtræden og multiple tumorer på grund af kimlinje-mutationer i p53. Som et vigtigt epigenetisk kontrolmekanisme, DNA hypermethylering af CpG’er i promotorregioner undertrykker genekspression både under udvikling og tumorigenese. Adskillige ISGs blev nedreguleret af epigenetisk inaktivering under immortalisering, et tidligt og nødvendigt skridt i carcinogenese, og nogle af de samme ISGs blev opreguleret på replikativ aldring [13], [14], [15]. Behandling af de udødelige LFS cellelinier med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC), en inhibitor af DNA-methyltransferaser restaureret IFN signalering og inducerede en senescens-lignende tilstand [13], [15].

IFN-inducerbare transkriptionsfaktorer, IRFS, er væsentlige mediatorer af IFN-respons. Mangel på

IRF7

udtryk svarede til afvigende promotor hypermethylering af CpG øer i sin promotor og blev også udpeget som en af ​​methylering-lyddæmpet gener i flere kræftformer, herunder lunge, hepatocellulær, gastriske og pancreascancer [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. Reduceret udtryk for IRF5, en anden vigtig transskription faktor for IFN-vejen, blev også observeret i blodkræftsygdomme, hvilket er i overensstemmelse med dens rolle at fremkalde G2-M vækst anholdelse og apoptose [20]. Epigenetisk inaktivering af

IRF5

blev ligeledes observeret i hepatocellulære og gastrisk kræft [21], [22]. Som direkte inducere af IFN vej, IRF7 og IRF5 fremkalde overlappende ISG transkriptionelle profiler, dog differential ekspressionsmønstre og kinetik ISGs tiltalt, at de besidder redundante og adskilte roller i medfødte immunrespons. Sammenlignet med IRF7, IRF5 er en meget stærkere aktivator af de tidlige antivirale gener, herunder IFNp [23]. I en nylig rapport viste vi, at øget ekspression af IRF5 og /eller IRF7 kunne genaktivere IFN relaterede gener, hæmmer cellevækst, og fremkalde aldring [15]. Silencing af disse væsentlige IRFS og væksten-undertrykkende IFN vej kan være en nødvendig tidlig begivenhed i udviklingen af ​​kræft, især i forbindelse med immortalisering.

Selvom kræftceller, med deres IFN-vej-ophævet, kan have erhvervet en vækst /overlevelse fordel over deres normale modstykker, de samtidig bringe deres antivirale beskyttende evne. Her bliver nye terapeutiske paradigmer involverer onkolytiske RNA-vira til at målrette det defekte medfødte immunsystem i kræftceller blive undersøgt. Vi fandt, at følsomheden over for onkolytiske VSV kraftigt og væsentligt var forbundet med afbrydelse af IFN signalvejen. En manglende opregulere ISG udtryk på dsRNA stimulering angivet en svækket antiviral respons sensibiliserende lungekræft-cellelinjer til VSV-induceret onkolytisk celledød. Men ikke alle lungecancerceller kan dræbes ved VSV-infektion, som nogle af dem har en relativt normal medfødte immunitet pathway og derfor er resistente over for VSV-medieret viral drab. Bisulfit sekventering afslørede promoter hypermethylering af enten

IRF7

og /eller

IRF5

i flere lungekræft-cellelinjer. Tilsvarende, når vi undersøgte DNA fra friske frosne lungekræft væv, observerede vi promoter methylering af

IRF7

og /eller

IRF5

, tyder på, at deres IFN antivirale respons også blev epigenetisk tavshed som funktionelle IRF7 og IRF5 er nødvendige for en intakt IFN pathway. Men 5-aza-dC behandling mislykkedes at genaktivere IRF5 eller IRF7 udtryk eller redning lunge kræftceller fra VSV-infektion. Ændring medfødte immunitet ved at manipulere IRF udtryk ændret viral modtagelighed normal Beas2B bronchieepithelceller celler eller lunge kræftceller. Celler uden en funktionel IFN respons er delvist beskyttet mod virus efter IRF5 og IRF7 overekspression, hvorimod afbrydelse af IFN-signalering ved at målrette IRF5 og IRF7 hjælp siRNA’er øgede Beas2B cellernes sårbarhed over for de cytolytiske virkninger af VSV. Derfor IRF5 og IRF7 er afgørende faktorer i IFN sti, der bestemmer den virale følsomhed af cellerne til onkolytiske virus. Den meget selektive VSV drab af lungekræft celler med et svækket IFN vej på grund af epigenetisk nedregulering af IRFS indikerer, at disse gener er ideelle biomarkører til bestemmelse af følsomheden af ​​tumorer til onkolytisk viral behandling.

Resultater

IFN signalering mangel er forbundet med VSV følsomhed

IFN pathway styrer den cellulære respons på virusinfektion og dsRNA. Celler, der har en fuldt funktionel medfødte antiviral systemet er i stand til at beskytte sig mod virus, hovedsageligt på grund af induktion af IFN signalering kaskade. Vi har vist, at IFN-vejen epigenetisk blev inaktiveret i fibroblaster fra LFS patienter efter spontan immortalisering [14]. Undersøgelse af medfødte immunitet status i normal bronchieepithelceller cellelinje Beas2B,

sine

ras transformerede afledte celler og 2 tumorigene kloner afslørede, at som IFN signalering aktivitet faldt følsomheden over for VSV drab steg i lunge tumorigenese (Li og Tainsky, upubliceret data). Fordi funktionel inaktivering af IFN-vejen har været et fælles træk ved mange kræftformer, vi brugte 7 langsigtede lungekræft cellelinier (4 adenocarcinomer: CRL5800, CRL5807, CRL5810 og CRL5872, 2 pladecarcinomer: HTB172 og CRL5928 og en lille celle karcinom: CRL5869) at undersøge ændringer i deres medfødte immunsystem.

Brug et repræsentativt sæt ISGs i Q-RT-PCR-assays, undersøgte vi både baseline ISG ekspressionsniveauer og deres ekspression efter stimulering af IFN-vejen ved syntetisk dsRNA polyI: C, som efterligner viralt RNA [15]. Vi fandt lavere baseline ekspression af de fleste testede i alle lungekræft cellelinier sammenlignet med Beas2B celler (tabel 1) ISGs. IFN pathway kunne aktiveres i Beas2B celler som 12 ud af 14 gener var inducerbar med polyI: C stimulation. I modsætning hertil polyI: C undlod at fremkalde mRNA af alle 14 gener testet i CRL5810 celler, mens variable induktion mangler essentielle antivirale respons gener såsom

IFN

,

IFNp

,

IRF7

,

IRF5

STAT1

blev påvist i CRL5800, CRL5807, CRL5872 og CRL5869 celler. Overraskende Q-RT-PCR demonstrerede polyI:. C inducerbar ekspression af 10 ud af 14 ISGs i HTB182 og CRL5928-celler på lignende niveauer til Beas2B indikerer en relativt normal antiviralt respons i disse to lungecancerceller (tabel 2)

Fordi kompromitteret medfødte immunsystem signalering fører ofte til øget følsomhed for viral drab, blev VSV følsomhed undersøgt for at afgøre, om manglen på ISG aktivering svarer til forhøjet sårbarhed over for onkolytisk viral drab i lungecancerceller. Som forventet Beas2B celler med intakt IFN respons modstand VSV-infektion, der udviser lille ændring i cellelevedygtighed. Desuden HTB182 og CRL5928 var relativt resistente sammenlignet med andre lungecancerceller som mere end 60% af cellerne stadig var i live ved høj dosis VSV (MOI5) selv uden eksogent IFNa forbehandling (figur 1A). I modsætning hertil resten af ​​lungekræft cellelinier variabelt mistet deres evne til at beskytte sig mod VSV. Et stigende antal IFN-signalering-deficiente lungecancerceller (fra -30% til -70%) blev dræbt ved at hæve dosis af VSV eksponering og tilsætning IFNa til mediet inhiberede ikke cytotoksicitet af højdosis VSV (MOI5) i CRL5800, CRL5810 og CRL5869-celler (figur 1A). Interessant, de nedsatte basale niveauer af de fleste ISGs i alle lungekræft cellelinier foreslog ingen sammenhæng mellem VSV modtagelighed og basale ISG niveauer (tabel 1). Den variable følsomhed for viral drab svarede til den differentielle ophævelsen af ​​IFN respons i lungekræft cellelinier. De selektive virolytic virkninger af VSV var størst i CRL5810-celler i overensstemmelse med de mest alvorlige defekter i deres medfødte antiviral systemet (tabel 2 og figur 1A). Vi identificerede også 5 ISGs (

IRF5

,

IRF7

,

STAT1

,

IRF3

IFI16

), hvis udtryk var markant forhøjede 3-fold som reaktion på poly i: C behandling kun i VSV-resistente cellelinier (tabel 2 og figur 1A). Western blot-analyse bekræftede, at det forhøjede ISG mRNA-ekspression ved polyI: C induktion resulterede i opreguleres proteinniveauer i VSV-resistente celler. Ser727 phosphorylering af STAT1 kan kun induceres af IFNp men ikke af IFNa [24], og blev anvendt som en specifik markør for tidlig reaktion genaktivering af IFN-vejen. En stærk polyI: C-induktion af phosphoryleret-STAT1 (p-STAT1, Ser727), STAT1, IRF5 og IRF7 proteinniveauer stemte overens med den modstand af normale Beas2B celler og de to cancerceller, HTB182 og CRL5928, at VSV-infektion og vice versa for den virale-sensitive lungecancer-cellelinie. Mild Ser727 phosphorylering af STAT1 kan påvises i CRL5807-celler indikerer relativt normal tidlig IFN signalering i denne cellelinie sammenlignet med andre VSV-følsomme cellelinier. IRF5 og IRF7 proteinniveauer var ensartet ikke inducerbar ved polyI: C behandling i alle de virus-følsomme lungekræft cellelinier (figur 1B). Ingen signifikant ændring af IRF3 protein blev observeret ved polyI: C behandling blandt alle lungecancerceller måske fordi dens aktivitet er hovedsagelig reguleret posttranslationelt af ændringer i phosphorylering (data ikke vist). Derfor støttede vores observationer den inverse sammenhæng mellem onkolytiske følsomhed over for VSV og inducerbarheden af ​​IFN-signalering i normale bronchiale epitelceller Beas2B og lungecancerceller.

A. Selektiv cytotoksicitet VSV i lungekræft celler med defekte IFN-vejen. Beas2B og 7 lungekræft cellelinier blev evalueret for deres evne til at inducere antiviral respons ved VSV-infektion med eller uden IFNa forbehandling af virus-induceret cytopaticitet hjælp MTT assay. Værdierne blev normaliseret til værdien af ​​kontrol-inficerede celler, der var sat til 100% fra mindst to uafhængige forsøg (

n

= 3) med SD på 10%. (-): Ingen VSV bekæmpelse af infektioner. MOI0.05: infektionsmultiplicitet 0,05, lav dosis af VSV-infektion. MOI5: infektionsmultiplicitet 5, høj dosis af VSV-infektion. B. Protein-ekspressionsniveauer af adskillige ISGs i polyI: C-behandlede Beas2B og lungekræft celler blev sammenlignet med ubehandlede celler under anvendelse western blots. Fold ændringer af IRF5 og IRF7 ekspression efter polyI: C behandling blev angivet. Tubulin blev anvendt som en normaliserende kontrol.

epigenetisk inaktivering af kritiske transkriptionsfaktorer

IRF7

IRF5

resultater i ophævelse af IFN vej

promotor hypermethylering er en epigenetisk mekanisme genregulering kendt for at lukke munden på genekspression i mekanismer for celle skæbne beslutsomhed og carcinogenese. Vi har tidligere rapporteret, at IFN-vejen er blevet ophævet ved epigenetisk inaktivering af en nøgle antiviral forsvar mediator IRF7 i udødelige LFS fibroblaster [14], [15]. Interessant, en anden undersøgelse fandt cigaretrøg eksponering førte til undertrykkelse af IFN signalering grund

IRF7

promotor hypermethylering, hvilket resulterede i et fald antivirale forsvar af det respiratoriske epitel [25]. Derfor undersøgte vi, om promotor methylering af

IRF7

kunne også være årsag til IFN pathway forstyrrelser i lungekræft cellelinier. DNA-sekventering af natriumbisulfit behandlet genomisk DNA afslørede

IRF7

promotor hypermethylering i to lunge cancer cellelinjer (CRL5810 og CRL5869), som tyder på, at epigenetisk inaktivering af

IRF7

har spillet en rolle i afbrydelse af IFN signalering i disse cellelinier (figur 2A). Da IRF5 inducerede en stærkere transskription profil af de tidlige antivirale gener [23] og er for nylig blevet identificeret som en ny methylering markør for kræft [21], [22], vi yderligere undersøgt status methylering af

IRF5

promotor regioner i lungecancerceller. Forøgelse

IRF5

hypermethylering blev fundet i CRL5800, CRL5807, CRL5872 og CRL5810 cellelinjer (figur 2B), således den tilsvarende virus modtagelighed

IRF7

-unmethylated CRL5800, CRL5807, CRL5872 celler var en konsekvens af epigenetisk

IRF5

inaktivering. Desuden promotor hypermethylering af både

IRF7

IRF5

forklarede den højeste følsomhed til VSV manifesteret ved CRL5810 celler. I modsætning hertil promotorområder af hverken

IRF7

eller

IRF5

viste sig at være methyleres i Beas2B, CRL5928 og HTB182 cellelinier i overensstemmelse med deres intakte medfødte immunitet og resistens mod onkolytisk viral drab. Helt den selektive tab af viral beskyttelse i lungecancerceller var relateret til epigenetisk inaktivering af mindst et af de IRFS implicerer nødvendigheden af ​​både IRF7 og IRF5 at være aktiv i en funktionel IFN pathway.

status for methylering af CpG øer i

IRF7

IRF5

promotorområder i Beas2B, menneskelige lungekræft-cellelinjer og primære væv blev undersøgt ved sekventering af bisulfitbehandlet genomisk DNA. A. IRF7. B. IRF5. Lukkede cirkler, methyleret C i CpG-dinukleotider; åbne cirkler, umethyleret C i CpG-dinukleotider. TSS, transskription startstedet.

Fordi der kan forekomme epigenetiske begivenheder under langtidsbehandling kultur, som ikke var til stede i den oprindelige kræft, vi undersøgte IRF-promoter methylering mønstre i frisk-frosne primær lungekræft væv .

IRF7

promotoren var fuldt methyleret i 6 ud af 20 NSCLCs, mens 5 andre tumorer havde 5′-partiel methylering (figur 2B) som et første begivenhed, der kan sprede sig til tilstødende bindingssteder for CpG [26]. Samtidig fandt vi tungt methylering i 4 af 20 NSCLC prøver og 11 andre havde delvis methylering af

IRF5

promotorregioner. Samlet set 15 ud af 20 patientprøver havde promotor methylering af enten den ene eller begge IRFS, at begivenheder tilstrækkelige dæmpe deres IFN respons. Ingen afvigende

IRF7

eller

IRF5

hypermethylering blev påvist i de matchende buffy coat DNA fra disse samme patienter angiver, at IRF promotor hypermethylering ikke havde medført fra kim-line epigenetiske ændringer. Derfor methylering

IRF7

eller

IRF5

initiativtagere fundet i lungekræft cellelinjer formentlig havde sin oprindelse i tumoren snarere end at være en begivenhed valgt under til cellekultur. Vores resultater viste, at den øgede følsomhed over for virusinfektion medieres af epigenetiske mekanismer nedregulere centrale antiviral forsvar pathway regulatorer IRF5 og IRF7. Forekomsten af ​​epigenetisk inaktivering af IRFS og dens tætte tilknytning til VSV følsomhed gør dem ideelle theranostic biomarkører til at screene lungekræftpatienter for mulig onkolytisk viral behandling.

Manipulation af IFN signalvejen målrettet IRFS ændrer VSV viral følsomhed

Vi har tidligere vist, at 5-aza-dC demethylering behandling kunne genskabe genekspression af epigenetisk tavshed

IRF7

og andre ISGs derved reaktivere IFN signalvejen i udødelige LFS fibroblast cellelinjer [14], [15] . Til vores overraskelse, IRF7 og IRF5 ekspressionsniveauerne forblev fraværende (figur 3A, mindre end 1,5 gange stigning for både IRF5 og IRF7) i lungekræft cellelinje CRL5810 efter 5-aza-dC behandling, så længe som 4 uger. Bemærkelsesværdigt, sekventering af bisulfit-behandlet DNA på

IRF5

IRF7

promotorområder afslørede, at langvarig 5-aza-dC ansøgning ikke var i stand til at vende promotor hypermethylering af IRFS i CRL5810 celler (data ikke vist). blev fundet lignende resistens over for 5-aza-dC behandling for anden IRF7-methyleret lungekræft cellelinien CRL5869 (data ikke vist). Som et resultat, forlænget demethylering behandling med 5aza-dC ikke var i stand til at påvirke VSV følsomhed CRL5810-celler (figur 3B) og mere tyder på, at IRF5 og IRF7 er to af de grundlæggende faktorer i IFN signalering, der kan regulere onkolytisk viral følsomhed.

A. Western blots viste ingen stigning i IRF7 eller IRF5 proteinekspression efter 5-aza-dC behandling af CRL5810 celler. Fold ændringer af IRF5 og IRF7 ekspression blev indikeret oven på 5-aza-dC behandlet kolonne. B. CRL5810 celler var stadig følsomme over for VSV cytolyic virkninger efter 5-aza-dC behandling.

Ingen af ​​disse to IRF transkriptionsfaktorer var i stand til at blive induceret i VSV-sensitive lunge kræftceller (tabel 2 og figur 1B), hvorimod overekspression af IRF5 og /eller IRF7 i udødelige LFS fibroblaster opreguleres andre ISGs, manifesteret en hurtigere og stærkere medfødte immunsystem signalering upon dsRNA stimulering, som er tilstrækkelig til at inducere senescens [15]. For at genoplive den handicappede IFN respons i lungecancerceller, blev IRF5 og IRF7 alene eller i kombination stabilt transficeret ind CRL5810-celler, i hvilke vedvarende 5-aza-dC behandling havde ingen virkning på demethylering af IRF-promotoren. Western blot-analyse bekræftede forhøjede basale protein ekspression af IRFS i IRF5 og IRF7 overudtrykkende celler (figur 4A). Individuel restaurering af IRF-ekspression delvist beskyttede CRL5810-celler fra VSV cytolyse med den største stigning af cellelevedygtighed fra -50% til over 85% ved MOI0.05, og fra -30% til -50% ved MOI5 af VSV-infektion i celler, der overudtrykker både IRF5 og IRF7 sammenlignet med vektor kontrolceller (figur 4B). Vi forklarede den beskedne gevinst på viral beskyttelse selv efter IRF5 og IRF7 kombineret transfektion af alvorlig tab af andre vigtige ISGs i CRL5810 celler som indikeret af den manglende virkning på eksogen IFN.

A. Protein ekspressionsniveauer for STAT1, IRF5 og IRF7 blev analyseret ved western blots i IRF stabil transficeret CRL5810 celler. Anti-flag antistof blev anvendt til påvisning transficerede IRF proteinniveauer, mens IRF5- og IRF7-specifikke antistoffer blev anvendt til total IRF proteinekspression. B. Overekspression af IRF5 og /eller IRF7 delvist øgede CRL5810 cellernes resistens mod VSV-infektion med de mest stigende i den kombinerede trasfection. * P 0,02, ** p. 0,001

Den selektive replikation af VSV i tumorer med kompromitteret IFN vej er hjørnestenen i den kliniske anvendelse som onkolytisk viral behandling. Men ikke alle lungekræft patienters kræftformer er mangelfuld i deres medfødte immun pathway. For at overvinde denne hindring og ødelægge de VSV-resistente celler blev siRNAs til IRF5 (siIRF5) og IRF7 (siIRF7) anvendes til at undertrykke IFN respons i celler med aktiv IFN vej. Sammenlignet med Beas2B celler transficeret med kontrol scrambled siRNA, celler transficeret med siIRF5 eller siIRF7 resulterede i et fald i IRF5 og IRF7 induktion efter polyI: C behandling, mens transfektion af både siIRF5 + siIRF7 fuldstændig fjernet IRF-aktivering (figur 5A). Transfektion af siIRF5 alene signifikant inhiberede polyI: C-aktivering af både IRF5 og IRF7, hvilket kan forklares ved en væsentlig rolle for IRF5 som en stærk inducer af IFNp [23]. Formindsket IRF5 udtryk ved siIRF5 resulterede i langt mindre IFNß produktion fører til nedsat stimulation af sekundær respons gen IRF7. Som forventet, undertrykkelsen af ​​disse 2 gener ved siRNA’er resulterede i betydeligt tab af beskyttelse mod VSV-infektion med den mest cytotoksicitet stigning til næsten 40% ved højere dosis VSV eksponering i kombination knockdowns sammenlignet med kontrol siRNA (figur 5B). Lignende resultater blev observeret i parallelle transfektionsundersøgelser af VSV-resistente CRL5928-celler, som har relativt intakt IFN signalering (data ikke vist). Dette viser tydeligt, IRF5 og IRF7 er funktionelt afgørende for medfødte immunitet, som bestemmer viral følsomhed af disse celler.

A. Ophævelse af IRF5 og /eller IRF7 induktion af siRNA’er upon polyI: C treatmentwas vist ved western blot. Fold ændringer af IRF5 og IRF7 ekspression efter polyI: C behandling blev angivet. Si (-): kontrol siRNA. B. IRF5 og IRF7 er vigtige faktorer, der bestemmer viral følsomhed af cellerne. Inhibering af disse 2 gener resulterede i tab af beskyttelse mod VSV-infektion med den mest cytotoksicitet stigning i kombination knockdown. * P 0,03, ** p. 0,001

Sammenfattende er nødvendige og tilstrækkelige for øget følsomhed over for drab ved onkolytiske virus tabet af IFN-signalering. Manipulation af IFN-vejen gennem transkriptionsfaktorer IRF5 og IRF7 ændret cellernes respons på VSV-infektion. Analyse af IFN-vejen ved hjælp af disse IRF methylering biomarkører kan give nye theranostic biomarkører til bestemmelse af en patients følsomhed over for oncolytiske vira.

Diskussion

En funktionel medfødte immunforsvar antiviral system beskytter celler mod virusinfektion, hovedsageligt på grund af induktion af den defensive IFN signaleringskaskade, som synes at være basis for virusresistens og immunstimulerende egenskaber. Her har vi vist den stærke og overbevisende omvendt forhold mellem effektiv medfødte antiviralt respons og onkolytisk viral følsomhed under anvendelse lungekræft cellelinier. Desuden transskription faktorer IRF5 og IRF7 blev identificeret som kritiske regulatorer af medfødte immunsystem og nyttige biomarkører for onkolytisk virus modtagelighed i lungekræft celler som begge skal være inducerbart for en funktionel IFN vej. Inaktivering af enten IRF5 eller IRF7 svækket det antivirale respons med den mest betydelige tab, når begge IRFS blev epigenetisk tavshed i CRL5810 celler. Den varierende grad af cytolytisk død var relateret til forskellen sværhedsgraden af ​​IFN pathway defekter. Trods tilstedeværelsen af ​​exogent IFNa, CRL5810-celler er ikke-responsiv og fortsat er udsat for VSV drab svarende til den fuldstændige afbrydelse af IFN pathway aktivitet.

Tab af tumorsuppressorgen ekspression af afvigende promotor methylering er en tidlig og fælles epigenetisk begivenhed under debut og progression af kræft [27]. Vi har vist epigenetisk inaktivering af

IRF5

IRF7 dele på CpG øer af promotorområder i lungekræft. Farmakologisk målretning af afvigende epigenetiske ændringer ved demethylering agenter har vist klinisk effekt i flere hæmatologiske maligniteter [28]. Dog kan disse methylering hæmmere ikke forhindre en gentagelse af hypermethylering og vi har præsenteret beviser for, at epigenetisk deregulering ikke fuldt ud kan gendannes i en serie af lungekræft-cellelinjer. Svigt af demethylering midler til at genoprette afgørende ISG ekspression indikerer, at disse lungecancerceller er ideelle mål for onkolytisk viral behandling.

Selvom basale niveauer af de fleste ISGs blev reduceret i alle lungekræft cellelinier forhold til normal bronchieepithelceller celler, er oncolytisk viral følsomhed kun forbundet med polyI: C-inducerbare ekspressionsniveauer af visse centrale ISGs såsom IRF7 og IRF5. Men IRF5 og IRF7 overekspression er ikke tilstrækkelig til fuldstændigt at genoprette IFN-vejen og kun delvist reddet celler fra virusinfektion grund af mangel på andre vigtige ISGs. Manglende fremkalde Ser727 fosforylering på polyI: C behandling foreslog yderligere medfødte immunitet defekter i flere VSV følsomme cellelinjer (Figur 1B). Desuden er mRNA af 3 andre ISGs (STAT1, IRF3 og IFI16, tabel 2) konsekvent induceret i VSV-resistente celler. er behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte dem som theranostic biomarkører og kan identificere yderligere ISGs som biomarkører i lungekræft, hvis aktivering kan skelne virus-resistent fra virus-sensitive kræftformer.

Vi præsenterede beviser for, at funktionel inaktivering af IRF5 og IRF7 er den vigtigste mekanisme til at afbryde IFN signalering i lungecancerceller. Alligevel forskellige maligniteter harbor forskellige molekylære defekter af denne vej. Dereguleret JAK3 og RNase L veje i LNCaP prostatacancerceller [29], defekt STAT1 og STAT2 aktivering i fibrosarcomceller og melanom celler [30], [31] og nedreguleret IFNAR i høj kvalitet blærekræft [32] er alle blevet indberettet til deaktivere medfødte immunsystem signalering. Samlet set er det IFN vej ofte nedreguleret under tumorigenese selvom forskellige sæt ISGs er undertrykt af forskellige mekanismer i en cancer-type specifik måde.

En manglende aktivere medfødte immunitet respons på onkolytisk RNA-virus-infektion fører til den stærkt selektive clearance af IFN-nonresponsive tumorceller. Foruden VSV, har andre RNA-vira, såsom NDV [33] og influenzavirus [34] også blevet påvist at have tumor-selektive cytotoksicitet ved hjælp af den samme mekanisme til at målrette celler med formindsket IFN-aktivitet. Kliniske forsøg med intravenøs administration af NDV (PV701) viste sine første onkolytiske virkninger i flere solide tumorer [35]. Desuden VSV stammer med M-protein-mutationer (AV1 og AV2) udløses mere robust antiviralt respons på grund af deres defekter i evnen til lukning IFN signalering; disse mutanter selektivt ødelagt i IFN-responsive celler ved en lavere terapeutisk dosis, mens de resterende stærkt lytiske i cancerceller [9]. Ekspression af immunstimulerende proteiner, såsom interleukin-2 (IL-4) eller IFNp i gensplejsede VSV er også blevet genereret til fremme virale cytolytiske responser [5], [6]. Derfor vil øge antivirale responser i normale celler forbedre onkolytisk selektivitet i IFN-nonresponsive tumorer.

Selvom en reduceret antiviralt respons kan være et fælles træk ved en lang række cancere, den onkolytiske virkning af naturligt forekommende RNA vira kan stadig være relativt lav, da nogle tumorer manifestere robuste medfødte immunforsvar reaktioner, der inhiberer viral replikation og spredning.