PLoS ONE: Identifikation og karakterisering af celler med kræft Stem Cell Properties i humane primære Lung Cancer Cell Lines

Abstrakt

lungecancer (LC) med sine forskellige undertyper er almindeligt kendt som en terapi resistent cancer med den højeste morbiditet i hele verden. menes terapi modstand af en tumor at være relateret til cancer stamceller (CSCS) inden tumorerne. Der har været tegn på, at lungekræft er opformeres og vedligeholdes af en lille population af CSCS. For at undersøge dette spørgsmål, vi etableret et panel af 15 primære lungekræft cellelinier (PLCCLs) fra 20 friske primære tumorer ved hjælp af en robust serumfri kultur system. Vi efterfølgende fokuseret på identificering af lunge CSCS ved at studere disse cellelinier afledt fra 4 repræsentative lungecancer-undertyper, såsom småcellet lungecancer (SCLC), storcellet carcinom (LCC), pladecellecarcinom (SCC) og adenocarcinom (AC). Vi identificerede en lille population af celler stærkt positive for CD44 (CD44

høj) og en vigtigste befolkning som var enten svagt positiv eller negativ for CD44 (CD44

lav /-). Co-ekspressionen af ​​CD90 yderligere indsnævret den formodede stamceller befolkning PLCCLs fra SCLC og LCC som sfæroid-dannende celler blev primært findes inden for CD44

highCD90

+ delpopulation. Desuden er disse CD44

highCD90

+ celler afsløret mesenchymale morfologi, forøget ekspression af mesenkymale markører

N-Cadherin

Vimentin

, øget mRNA niveauer af embryonale stamceller relaterede gener

Nanog

Oct4

og øget modstand mod bestråling i forhold til andre delpopulationer studeret, hvilket tyder på CD44

highCD90

+ befolkning en god kandidat til lunge CSCS. Både CD44

highCD90

+ og CD44

highCD90

– celler i PLCCL afledt af SCC dannet sfæroider, mens CD44

lave /- celler manglede dette potentiale. Disse resultater indikerer, at CD44

highCD90

+ delpopulation kan repræsentere CSCS i SCLC og LCC, mens der i SCC lungekræft undertype blev CSC potentialer findes inden for CD44

høj delpopulation.

Henvisning: Wang P, Gao Q, Suo Z, Munthe E, Solberg S, Ma L, et al. (2013) Identifikation og karakterisering af celler med kræft stamceller Ejendomme i humane primære lungekræft cellelinier. PLoS ONE 8 (3): e57020. doi: 10,1371 /journal.pone.0057020

Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Juni 26, 2012; Accepteret: 21 januar 2013; Udgivet: 4 mar 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra det norske forskningsråd (SFI-CAST). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

“kræft stamcelle” (CSC) teori indebærer en hierarkisk organisation inden tumoren, hvor CSCS repræsenterer toppen af ​​hierarkiet. Svarende til normale stamceller, CSCS har kapaciteten til at undergå selvfornyelse samt asymmetrisk celledeling. Disse vigtige funktioner kan CSCS at igangsætte og vedligeholde tumorer. Ud over den klassiske sigt, dvs. CSC, forskellige udtryk er blevet brugt i den seneste videnskabelige litteratur til at beskrive væsentlige egenskaber ved CSCS såsom selv-fornyelse og tumorfremkaldende /vedligeholdelse af ejendomme. Blandt andre er sådanne vilkår som tumorfremkaldende celle (TIC), kræft initierende celle (CIC) og tumor udbreder celle (TPC). I denne rapport vil vi bruge CSC udtryk til at karakterisere celler, der var i stand til at igangsætte og opretholde tumordannelse i dyr og langvarig flydende kultur.

Igangværende undersøgelser på området for kræft stamcelleforskning har givet stigende tegn for eksistensen og identifikation af CSCS ved hjælp af flere specifikke biomarkører, såsom CD44, CD133 og CD90. Disse markører er blevet bredt accepteret til isolering af CSCS i humane hæmatologiske maligniteter [1], [2] og i faste tumorer [3] – [11]. Endvidere har CSCS vist sig at være mere modstandsdygtige over for konventionel kemoterapi og radioterapi, end den større population af mere differentierede cancerceller, hvilket indikerer, at CSCS kan forblive i resterende tumorer efter behandling og bidrage til kræft tilbagefald og spredning. Derfor nye behandlinger rettet mod CSCS kan potentielt forebygge tumor tilbagefald og forlænge overlevelsen af ​​patienter. Den epitel-mesenkymale overgang (EMT) spiller en vigtig rolle i fosterudviklingen [12]. Det forårsager epitelceller til at miste deres epitel adfærd, ændrer deres morfologi og cellulære egenskaber til at ligne mesenchymal-celler [13]. EMT er blevet foreslået at bidrage til invasive og metastatiske vækst af mange typer af cancere [14] – [17]. Nylig undersøgelse viste, at stamcellelignende celler fra epiteliale cancere, der har en mesenkymale fænotype udtrykkelige markører associeret med EMT [15].

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed på verdensplan, og har en dårlig prognose med 5-årige overlevelsesrater på ca. 15%. Ifølge den histologiske heterogenitet, er lungecarcinomer kategoriseret i fire store undertyper: småcellet lungecancer (SCLC), pladecellecarcinom (SCC), storcellet carcinom (LCC) og adenocarcinom (AC). I denne undersøgelse, efter “Cancer Stem Cell” hypotese, vi fokuserede på identifikation og karakterisering af CSCS i ovennævnte undertyper af lungekræft.

celleoverfladen markør CD133 er tidligere blevet identificeret som en pålidelig markør for CSCS i nogle af lungekræft undertyper [18]. Imidlertid har pålideligheden af ​​denne markør som CSC markør for lungekræft nylig blevet ubestridt [19]. Derfor fokuserede vi på en anden markør, dvs. CD44, som er blevet foreslået at karakterisere CSCS i bryst-, prostata-, hoved og hals, colorectal, bugspytkirtel og gastrisk kræft [3], [4], [9] – [11], [ ,,,0],20].

i denne undersøgelse tog vi fordel af de primære lungekræft væv udtages under resektion og fokuseret på etablering af PLCCLs fra frisk isolerede tumorer. Vi antog, at PLCCL kan tilvejebringe en mere repræsentativ og hensigtsmæssig kilde af cancerceller, der kan anvendes til identifikation af celler eller cellepopulationer med stamcellelignende egenskaber. Vi først succes etableret et panel af de primære lungekræft cellelinier fra frisk opnåede eksemplarer af de store undertyper af lungekræft. Baseret på detaljeret fænotypisk og funktionel analyse af repræsentative cellelinier fra SCLC, LCC og SCC, leverer vi beviser for, at CD44

stor befolkning kan harbor CSCS i disse kræft undertyper. Derudover co-ekspression af CD90 yderligere indsnævret population af CSCS i SCLC og LCC. Billedet til AC, dog stadig mindre klar, og på nuværende vi har ingen overbevisende dokumentation for, at nogen af ​​de markører, dvs. CD44 og CD90, er karakteristisk for CSCS i denne særlige kræft undertype.

Materialer og metoder

Indsamling af tumor prøver og etablering af primær lunge cancer cellelinjer

Denne undersøgelse blev godkendt af det regionale Etisk Udvalg og Institutional Review Board of Oslo Universitetshospital og udføres i henhold til retningslinjerne i Helsinki-konventionen. Ved underskrevet informeret samtykke blev menneskelig lungekræft væv opnået fra 20 patienter med primær lungecancer (aldersgruppen 55-81 år) undergår lobectomy eller pneumonectomy i Oslo Universitetshospital fra juli 2007 til oktober 2009. Histologisk diagnose blev opgøres på grundlag af mikroskopiske egenskaber carcinomceller (tabel 1).

Frisk opnåede tumorvæv (inden for 1-2 timer efter kirurgisk fjernelse) blev vasket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, USA) indeholdende penicillin-streptomycin (PS, penicillin 100 U /ml og streptomycin 100 ug /ml; Lonza, Belgien). Blodkar og bindevæv blev forsigtigt fjernet og den cancerøse del blev derefter hakket i små stykker mindre end 1 mm

3 under anvendelse skalpel, efterfulgt af grundig vask i RPMI-1640 medium og centrifugering ved 300 g i 5 min. Endelig blev cellerne resuspenderet i RPMI-1640 medium indeholdende collagenase II (Invitrogen, USA) ved en koncentration på 200 U /ml og spaltet i 2-4 timer ved 37 ° C i en fugtig inkubator. Den enzymatiske fordøjelse blev standset, når de fleste af cellerne var i enkelt suspension-celler. Efter vask i RPMI-1640 og 3x centrifugering ved 300 g i 5 minutter blev cellerne overført til standard vævskultur-overtrukne kolber (Corning Life Sciences, USA) og dyrket i det afgrænsede keratinocyt-serumfrit medium (DK-SFM) suppleret med L -glutamine (Invitrogen, USA), EGF 20 ng /ml, basisk-FGF 10 ng /ml (PeproTech Inc., USA), 2% B27 (Invitrogen, USA), PS og amphotericin B (0,25 ug /ml; Invitrogen, USA). Kulturerne af alle PLCCLs blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. Dyrkningsmediet blev skiftet hver 2-3 dage. Celler blev passeret uden tilknyttet med TrypLE ™ Express (Invitrogen, USA), når cellerne nåede 80-90% konfluens. Alle undersøgelser blev udført med de første fem passager af etablerede PLCCLs.

Isolering af nukleinsyre og DNA-fingeraftryk assay

At etablere en genetisk fingeraftryk for hver af de nye cellelinjer, DNA fingeraftryk assay blev udført på de repræsentative PLCCLs (LC004, LC006, LC007 og LC021) samt på en re-etableret cellelinje fra xenograft af LC021. Genomisk DNA blev isoleret fra Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS, Invitrogen) vaskede cellepellets. Totalt genomisk DNA blev opnået under anvendelse NucleoSpin Tissue kit (Macherey-Nagel, Tyskland) ifølge producentens protokol. Identiteten af ​​de DNA-profiler blev bestemt ved STR profilering hjælp Powerplex 16 System (Promega, Madison, WI). Dette kit forstærker 15 STR loci og amelogenin for ligestilling identifikation: Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, VWA, Amelogenin, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 og D5S818. PCR-produkterne blev størrelsesfraktioneret bestemt i en MegaBACE 1000 (Applied Biosystems, USA) ved hjælp af softwaren Fragment Profiler (GE Healthcare). Disse fingeraftryk blev derefter sammenlignet med DNA-profiler i et fingeraftryk database over tidligere fastlagte lunge kræft cellelinier for at sikre deres egenart.

Immunhistokemi

De primære dyrkede lungekræft cellelinier blev indlejret i paraffinblokke ved følgende metode: celler fra væsken kultur blev løsnet og vasket med DPBS og derefter centrifugeret ved 300 g i 5 minutter. Supernatanten blev forsigtigt fjernet før 3 dråber plasma og 2 dråber thrombin blev tilsat og blandet ved røret rotation. Bufret formalin (4%) blev tilsat efter blandingen blev koaguleret. Den koagulerede masse blev derefter anbragt i hør papir før bliver indlejret i paraffinblokke efter standardprocedure. Nogle snit blev farvet med Hematoxylin og Eosin (H Snit fra paraffinblokken indeholdende coloncancercellelinie Caco-2 blev anvendt som positiv kontrol for CD133-antistof. Isotypekontrolantistoffer i samme koncentration blev anvendt som negative kontroller. Alle kontroller blev udført og antistoffet reaktivitet blev verificeret før eksperimentelle anvendelser af antistoffer. Hver farvede afsnit blev revideret uafhængigt af to patologer.

Dyreforsøg

Alle dyreforsøg blev godkendt af og udføres i henhold til de retningslinjer, der er fastsat af Animal Research Ethics Board ved Universitetet i Oslo. Female NOD /SCID-mus (NODSC-M-F /M-M Homozygot NOD /mrkBOMTac-Prkdcscid, Taconic, Danmark) blev købt. Efter at være blevet holdt i karantæne en uge for overvågning i sterilt miljø af dyret facilitet i Oslo Universitetshospital, Rikshospitalet, 4-5 uger gamle NOD /SCID-mus blev anvendt i alle eksperimenter. For at vurdere tumorigenicitet af etablerede PLCCLs, 3 × 10

6 celler af hver cellelinje suspenderet i DK-SFM blev inokuleret subkutant i den højre flanke af NOD /SCID-mus (3 mus i hver gruppe) ved en maksimal volumen på 100 pi. Musene blev inspiceret to gange om ugen og tumorstørrelse blev målt med skydelærer. Mus blev aflivet ved cervikal dislokation, når størrelsen af ​​tumoren nåede en diameter på 15 mm. Xenotransplantater blev derefter fjernet og anvendt til histologisk analyse og etablering af flydende cellekulturer. Serielle xeno-transplantationer blev udført med LCC LC006 cellelinie ved at implantere stykker af den primære xenograft subkutant i sekundær modtager NOD /SCID-mus. Xenotransplantater afledt fra hver passage blev udtaget og fikseret i 4% pufret formalin til histologisk analyse.

Flowcytometrianalyse og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)

Flowcytometri analyse blev udført på PLCCLs ved logaritmiske vækstfase. Celler blev først fritliggende med TrypLE ™ Express og vaskes med DPBS. Resuspenderede celler blev talt og overført til 75 mm polystyren rundbundede reagensglas (BD Falcon, USA) ved en cellekoncentration 1 × 10

6 celler /ml, og efterfølgende farvet med antistoffer i fortyndinger bestemt ved tidligere titrering. Humant immunglobulin-farvning buffer (DPBS + 0,1% humant serumalbumin (Octapharma, Stockholm, Sverige)) og 5 pi 10 mg /ml gamma globulin (Gammagard®, Baxter, UK) blev tilsat til cellerne for at blokere FcR og minimere uspecifik binding af antistoffer. Fluorochrom koblede monoklonale antistoffer (mAb’er) blev tilsat til reagensglassene ved mættende koncentrationer, og cellerne blev inkuberet i 20 minutter på is undgå lyseksponering. En screening for markører blev udført med et panel af mAb’er (se detaljerede data i tabel 2) på fire PLCCLs repræsenterer hver lungecancer-undertype. Celler farvet med isotype-matchede mAb’er (BD Pharmingen, USA) tjente som negative kontroller. Forskellige populationer af celler blev sorteret baseret på udtrykkene for CD44 alene, eller i kombination med CD90 under anvendelse af en FACSAria II cellesorterer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Flow data blev erhvervet på FACSAria II eller LSR II cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Resultaterne blev analyseret ved anvendelse af BD FACSDiva-software (Version 6.1.3). Levedygtighed sorterede celler blev rutinemæssigt kontrolleres ved hjælp Trypan blå (Invitrogen, USA) farvning og normalt var 70%

Cell proliferation assay

FACS sorteres CD44

høj. og CD44

lav /- celler ved densitet på 150 eller 500 celler per brønd blev udpladet i tre eksemplarer i 200 pi DK-SFM med kosttilskud i standard coatede plader med 96 brønde. Brønde indeholdende medium alene blev anvendt som en baggrund negativ kontrol. Cellerne fik lov at klæbe ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet inkubator i en dag før de blev brugt i proliferationsassay. Celleproliferation blev målt under de følgende 8 dage ved anvendelse af CellTiter 96® Aqueous One Solution-celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI) ifølge protokollen tilvejebragt af producenten. Absorbans ved 490 nm blev målt på en Wallac Victor2 pladeaflæser (Perkin Elmer, Waltham, MA). De vækstkurver blev tegnet i henhold til middelværdien af ​​absorbans, relateret til baggrunden.

2 dimensional (2D) enkelt celle kolonidannende og heterogenitet assay

CD44high og CD44

lav /- celler fra SCLC cellelinie LC004 og LCC cellelinie LC006 blev sorteret og podet ved en enkelt celle per brønd i standard 96-brønds plader indeholdende 200 pi DK-SFM suppleret med EGF 20 ng /ml, basisk-FGF 10 ng /ml, og 2% B27. Enkelt celleudpladning blev valideret af fasekontrastmikroskop (Nikon, Tyskland). Kulturer blev holdt ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator. Efter 2 uger antallet af positive brønde indeholdende kolonier blev talt og morfologiske forhold på kolonierne blev evalueret. At studere selv-fornyelse og differentiering af enkelte celler, kolonier af forskellige typer dvs holoclones, meroclones og paraclones, blev udsat for serielle passager ved at udvælge og re-seeding dem først i 24-godt, derefter 6 brønde (Corning Life Science , USA), og til sidst ind i kolberne (Corning Life Science, USA), hvor de blev yderligere udvidet. Colony vækst i 2D enkelt celle kolonidannende assay og de langsigtede flydende kulturer afledt af disse kolonier blev observeret ved hjælp fasekontrastmikroskop (Nikon, Tyskland).

2D kolonidannelse effektivitet assay

FACS sorteres CD44

høj, CD44

lav /- og CD44

highCD90

+ og CD44

highCD90

– celler fra cellelinier SCLC LC004 og LCC LC006 blev podet i tre eksemplarer på en densitet på 200 celler per brønd i standard overtrukket brønd pladen 6 (Corning Life Science, USA) indeholdende 5 ml DK-SFM med kosttilskud per brønd. De sorterede celler blev holdt i kultur ved 37 ° C i 5% CO

2 befugtet inkubator i ~ 10 dage. Når de genererede kolonier var synlige og indeholdt 100 celler blev supernatanten aspireret, og brøndene blev skyllet to gange med DPBS, fikseret i 4% bufret formalin i 15 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af farvning med krystalviolet i yderligere 15 minutter ved stuetemperatur. Efter skylning væk farvestoffet blev kolonien nummer tælles og kolonidannelse effektivitet (CFE), dvs. antallet af kolonier pr forgyldt celle, blev beregnet og sammenlignet mellem forskellige subpopulationer.

Sfæroide dannelse assay

FACS sorterede celler blev podet ved tæthed på 100 celler per brønd i ultralav binding (ULA) plade med 96 brønde (Corning Incorporated) indeholdende 200 pi DK-SFM med kosttilskud og dyrket ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet inkubator indtil cellerne begyndte at danne sfæroider. Mediet blev skiftet hver 2. dag ved omhyggeligt at fjerne 50 ul af det øverste lag af medium og erstatte det med lige så stort volumen frisk medium. Brøndene blev inspiceret hver 2 dage ved hjælp af fasekontrast-mikroskop. Når sfæroiderne var stor nok (de fleste af cellen sfæroider var 200 um)., Blev de talt og fotograferet (Nikon, Tyskland)

RNA-ekstraktion og real-time PCR-analyse

totalt RNA blev ekstraheret fra 10

5 FACS sorterede celler og efterfølgende revers transkriberet under anvendelse af Taqman celle-til-CT kit (Applied Biosystems, USA) ifølge protokollen tilvejebragt af producenten. Real-time PCR blev udført ved anvendelse af Taq-Man Gene Expression Assay-system (Applied Biosystems, USA) på 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) ifølge producentens instruktioner og data blev analyseret ved SDS 2.3 Software ( Applied Biosystems, USA). Hver prøve, herunder ingen skabelon kontroller blev udført i to eksemplarer. PCR reaktion uden skabelon tjente som negativ kontrol. Termiske cyklingsbetingelser var 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C efterfulgt af 1 min ved 60 ° C. De Ekspressionsniveauerne blev bestemt til følgende gener

Nanog

(assay ID 8S02387400_gl),

Oct4

(assay ID Hs03005111_g1),

Sox2

(assay ID Hs01053049_sl),

E-Cadherin Hotel (assay ID Hs01023895_m1),

N-Cadherin Hotel (assay ID Hs00169953_m1),

Vimentin

(assay ID Hs00958111_ml),

høj mobilitet gruppe AT-hook 2 (HMGA2) Hotel (assay ID HS00171569_ml) og

phosphoglyceratkinasepromotor 1 Hotel (

PGK1

) (assay ID Hs99999906_m1). Udtrykket af målgener var relateret til ekspressionen af ​​

PGK1

normaliseret til de usorterede kontrol celler ved hjælp af ddCT metoden.

Stråling følsomhed assay

FACS sorteret celler blev podet ved en densitet på 500 celler per brønd i dubletter i standard coatede 96-brønds plader (Corning Incorporated) indeholdende 200 pi DK-SFM med kosttilskud. Efter 24 timers konventionel inkubation blev celler i monolagskulturer bestrålet ved stuetemperatur med doser af 1Gy, 2Gy og 4Gy henholdsvis anvendelse af et Siemens Stabilipan røntgenenhed, drevet ved 200 kV, 20 mA med 0,5 mm kobber filtrering (Siemens , Tyskland). Cellerne blev derefter dyrket i regelmæssige dyrkningsbetingelser i yderligere 5 dage med udskiftning af medium hver 2 dage. Virkningen af ​​bestråling på forskellige cellepopulationer blev testet ved CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, som beskrevet ovenfor. Virkningen af ​​bestråling på proliferation er givet som inhibering forholdet og blev beregnet ifølge formlen:. Hæmning forhold = ((ikke bestrålet kontrolbrønd absorbans – bestrålet godt absorbans) /ikke bestrålet kontrolbrønd absorbans) x 100%

Resultater

1. Primær lungekræft-cellelinjer

For at skabe grundlag for den foreliggende undersøgelse blev en roman, robust metode til dyrkning af lungekræft celler fra frisk resektion lungecarcinomer etableret (se materiale og metoder). Femten primære lungekræft cellelinjer blev etableret med succes fra 20 lungekræft væv udtages. Disse omfattede 7 ACs, 6 VKF, en LCC og en SCLC (tabel 1). Succesen-hastighed på oprettelse primære kulturer var 75%. Størstedelen af ​​svigt indtraf i den første del af undersøgelsen, før optimale koncentrationer af vækstfaktorerne var blevet bestemt. DK-SFM gjorde understøtte den selektive vækst af typiske epitelceller, klart inhibering af væksten af ​​sameksisterende fibroblaster. Dette var i modsætning til kulturer indeholdende serum anvendes i begyndelsen, hvor hurtig overvækst af fibroblaster indtraf (data ikke vist). Monolag celler med typisk epithelmorfologi blev opnået ved meget høj renhed i hver af de etablerede PLCCLs (figur 1). De primære cellelinjer opretholdes under disse betingelser blev passeret for flere generationer med den længste passage hidtil over 30 generationer, uden nogen tegn på vækstnedgang.

A. SCLC cellelinie LC004; B. LCC cellelinje LC006; C. AC-cellelinie LC007; D. SCC cellelinie LC021. Alle de repræsentative billeder var fra primære dyrkede lungekræft cellelinier ved den anden passage. Mikrofotografi forstørrelse, × 200.

For at sikre, at de etablerede cellelinjer var af unikke oprindelse og ikke forurenet med tidligere etablerede cellelinjer [21], dna-profiler ved hjælp af et sæt af meget polymorfe mikrosatellitmarkører blev genereret fra en delmængde af de cellelinier, der repræsenterer de fire forskellige typer af lungekræft. Resultaterne viste, at de fire cellelinjer var enestående og uden forbindelse (tabel Sl).

2. Fænotype PLCCLs og kræft forældrenes væv har lignende /er sammenlignelige for ekspression af P53, Ber-EP4 og CD44

Vi fokuserede vores arbejde på fire PLCCLs repræsenterer de fire lungekræft undertyper: SCLC cellelinje LC004, LCC cellelinie LC006, AC-cellelinien LC007 og SCC cellelinien LC021. Fra de udvalgte repræsentative PLCCLs, vi forberedt paraffinblokke, og sektioner fra disse cellelinjer blev farvet med H LCC cellelinje LC006; AC-cellelinien LC007 og SCC cellelinien LC021. Cellerne stammer fra de fire undertyper af lungekræft viste heterogenitet i cellulær og nuklear morfologi. Celler af hver primær cellelinie havde epitelial morfologi. Mikrofotografi forstørrelse, × 200. B. Analyse udtryk for P53, Ber-EP4 og CD44 i de 4 primære cellelinier og deres tilsvarende arkivers patienters tumorvæv. Alle de primære cellelinier undersøgte viste diffus positiv farvning for P53 undtagen den oprindelige SCC væv af cellelinien LC021. Epitelmembran antigen Ber-EP4 var bredt positiv i alle de oprindelige lungekræft væv og diffus positiv i alle de primære cellelinier. CD44 viste diffus positiv farvning med forskellig intensitet i de primære cellelinier og deres tilsvarende arkivers patienters kræft væv undtagen svagt positiv i den oprindelige tumor væv af AC cellelinje LC007. Sektioner fra paraffinblokke indeholdende humane seminom og brystkræft prøve blev anvendt som positive kontroller for antistoffer P53, Ber-EP4 og CD44 hhv. Mikrofotografi forstørrelse, × 200.

Tumor-suppressor p53 mutationer er kendetegnende for kræft og er generelt opreguleret [22]. Vi næste sammenlignet ekspressionsniveauer af P53 i serielle snit fra arkivers patienters tumorvæv og de nyetablerede PLCCLs bruger IHC. Alle fire PLCCLs udviste diffus positiv farvning for P53. Den samme type farvning blev observeret i den oprindelige patientens cancer væv med undtagelse af SCC parentale væv, som var negativ for P53 (figur 2B). Interessant nok cellelinie afledt fra SCC (LC021) udtrykt P53. Ekspressionsniveauerne af Ber-EP4 og CD44 blev undersøgt på samme måde. De arkivers patienters tumorvæv og deres tilsvarende PLCCLs viste generelt positive farvning for den pan-epitel markør Ber-EP4. Diffus positiv farvning med forskellig intensitet i arkiveringsmulighederne patienternes tumorvæv og deres tilsvarende cellelinier blev set med CD44-farvning, bortset fra AC parentale tumorvæv, som var svagt positive over det meste af afsnittet undersøgt (figur 2B, tabel S2). Ekspression af CD133 i de parentale tumorvæv blev også undersøgt ved IHC-farvning. CD133 viste en mere variabel mønster, med alle de forældrenes tumorer at være negativ, undtagen SCLC (LC004), hvor der blev observeret udtryk i isolerede områder (data ikke vist). Alle PLCCLs afledt fra de tilsvarende forældrenes kræft væv var ensartet negative for CD133-ekspression ved IHC farvning.

Samlet summerede eksperimenter tyder på, at PLCCLs i tidlige passager (op til 5) er repræsentative for forældrenes tumor væv i alle fire kræft undertyper.

3. Primære kulturer af lunge kræftceller er så tumorgene som xenotransplantater

malignt potentiale PLCCLs blev undersøgt i en eksperimentel dyremodel. En tumorigenese assay blev udført på 5 til 6 uger gamle NOD /SCID-mus. Syv af de PLCCLs blev testet i tidlige passager og alle var i stand til at generere xenotransplantater inden for 3 uger efter injektion. De fire cellelinjer SCLC LC004-P4, LCC LC006-P2, SCC LC021-P2 og AC LC007-P3, blev valgt til yderligere undersøgelser, formerings subkutane bulk-tumorer i 2/2, 3/3, 2/2 og 2/2 dyr. Desuden var vi i stand til at re-etablerede PLCCLs

in vitro

fra xenotransplantaterne taget fra disse dyr (Figur S1). Desuden DNA fingeraftryk var nyttigt at spore individuelle cellelinier fra xenotransplantater af LC021 (tabel S1 og fig S1).

Baseret på disse resultater konkluderer vi de PLCCLs med tumorigenese kapacitet i immunsvækkede mus kan nemt og reproducerbart genereres fra alle fire undertyper af lungekræft og opformeret i

in vitro

flydende kultur.

sekundært xenotransplantation blev udført ved at implantere subkutant stykker af den primære LCC xenograft (LC006) i sekundær modtager . Primære modtager transplanteret med LC006-celler afslørede lunge metastase foruden subkutan tumor. Men i de følgende serielle xeno-transplantationer blev tumorer dannet kun subkutant. Når morfologiske funktioner i PLCCL og de serielle xenotransplantater og forældrenes væv blev sammenlignet, de viste stor lighed understøtter den observation, at PLCCLs og xenotransplantater repræsenterer den oprindelige tumor.

4. Ekspression af CSC associeret celleoverflademarkører er dynamisk i den langsigtede kultur PLCCLs

For at identificere subpopulationer af formodede lungekræft stamceller i de primære cancer cellelinjer, undersøgte vi udtryk for en bredt panel af markører tidligere beskrevet som differentielt udtrykt i en række humane cancer stamceller. Data fra seks repræsentative PLCCLs analyseret på forskellige passager er angivet i tabel S3. Ekspressionsprofilen afslørede et variabelt mønster med nogle fælles træk. I to cellelinjer (SCLC LC004 og SCC LC021) testet gentagne gange fænotypen flyttet under langsigtet

in vitro

kultur (tabel S3). Nogle markører (CD29, CD49b og CD49f) blev ensartet udtrykt ved høje niveauer i alle passager, og alle cellelinjer undersøgte, mens andre, såsom CD44, CD166 og CD142, viste en højere udtryk i senere i forhold til tidligere passager. Det modsatte blev observeret for CD90 og CD326 udtryk, hvor andelen af ​​positive celler formindsket med stigende passage nummer. Interessant distinkte mindre subpopulationer udtrykker CD117, CD184 og CD15 var til stede i hver af de testede cellelinier. CD24 og CD326 viste variable udtryk niveau i forskellige PLCCLs. Ekspressionen af ​​CD133 var lav, som testet ved to forskellige antistoffer, og varierede mellem 0-2,4% bekræfter resultaterne opnået ved IHC.

Således ekspressionsniveauet og hyppigheden af ​​CD44 og /eller CD90 positive sub -populations var dynamisk, afslørende differentiel ekspression af antigenerne på forskellige tidspunkter. Disse forskellige ændringer, der skete under langvarig kultur indikerer enten mulig udvælgelse af visse delpopulationer i langvarig kultur eller respons på

in vitro

dyrkningsbetingelser.

Alt i alt vores resultater (B). b. c. b.