PLoS ONE: Modstand mod ROS1 Hæmning medieret af EGFR Pathway Aktivering i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

målretning af onkogen “fører” kinaser med små molekyleinhibitorer har vist sig at være en yderst effektiv terapeutisk strategi i udvalgte ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter. Men erhvervet resistens over for målrettede behandlinger uvægerligt opstår, og er en stor begrænsning for patientpleje. ROS1 fusionsproteiner er en nyligt beskrevet klasse af onkogen chauffør, og NSCLC patienter, der udtrykker disse fusioner generelt reagerer godt på ROS1 målrettet terapi. I denne undersøgelse har vi forsøgt at bestemme mekanismer erhvervet resistens over for ROS1 inhibering. For at opnå dette, analyserede vi tumorprøver fra en patient, der initialt responderede på ROS1 inhibitor crizotinib men til sidst udviklet erhvervet resistens. Desuden frembragte vi en ROS1 inhibering-resistent derivat af den oprindeligt følsomme NSCLC cellelinie HCC78. Tidligere beskrevne mekanismer erhvervet resistens over for tyrosinkinaseinhibitorer herunder målkinase-domæne mutation, målkopiantal gain, epithelial-mesenchymal overgang, og omdannelse til småcellet lungecancer histologi viste sig at ikke ligge til grund resistens i patientprøven eller resistente cellelinie. Men vi observere en switch i kontrollen af ​​vækst- og overlevelse signalveje fra ROS1 til EGFR i den resistente cellelinje. Som følge af denne kontakt, ROS1 hæmning-resistente HCC78 celler blev følsomme for EGFR-inhibering, en effekt, der blev forstærket ved samtidig behandling med et ROS1 inhibitor. Vores resultater tyder på, at co-hæmning af ROS1 og EGFR kan være en effektiv strategi til bekæmpelse af resistens over for målrettet terapi i nogle ROS1 fusion-positive NSCLC patienter

Henvisning:. Davies KD, Mahale S, Astling DP, Aisner DL Le AT, Hinz TK, et al. (2013) Resistens mod ROS1 Hæmning medieret af EGFR Pathway Aktivering i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (12): e82236. doi: 10,1371 /journal.pone.0082236

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Juni 17, 2013; Accepteret: 22 oktober 2013; Udgivet: December 13, 2013 |

Copyright: © 2013 Davies et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsmidler fra Cancer League of Colorado til KD Davies, den Boettcher Foundation Webb-Waring Biomedical Research Award til R.C. Doebele, og University of Colorado lungekræft SPORE tilskud (P50CA058187) til M. Varella-Garcia og R.C. Doebele. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling eller analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. D. L. Aisner har modtaget honorarer fra Abbott Molecular. P. A. Bunn Jr. har modtaget konsulenthonorarer fra Pfizer, Novartis, Genentech /Roche, AstraZeneca, Boehringer Ingelheim, Astellas, og GlaxoSmithKline. D.R. Camidge har modtaget rådgivning board honorarer fra Pfizer. R.C. Doebele har modtaget forskningsmidler, konsulenthonorarer, og rådgivning board honorarer fra Pfizer, honorarer fra Abbott Molecular samt konsulent- og rådgivende board honorarer fra Boehringer Ingelheim, forskningsmidler fra ImClone, og forskningsstøtte fra Eli Lilly. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft, hvoraf ca. 80-85% kan kategoriseres som ikke-small celle lungecancer (NSCLC), er den førende årsag til cancerrelateret mortalitet i verden [1]. For nylig er det blevet klart, at NSCLC er en heterogen sygdom, der i vid udstrækning kan der præsenteres på grundlag af genetiske ændringer, der skaber dominerende driver onkogener [2]. NSCLC tumorceller er ofte “afhængige” til disse aktiverede onkogener, således at hæmning af deres aktivitet blokke proliferative og pro-overlevelse cellulær signalering, i sidste ende fører til vækst anholdelse og /eller celledød. Vigtigt er det, mange af de onkogene drivere opdaget til dato er aktiverede kinaser, der kan målrettes ved småmolekylære inhibitorer. Gefitinib og erlotinib behandling af NSCLC patienter huser

EGFR

aktiverende mutationer og crizotinib behandling af NSCLC patienter huser aktivering

ALK

omrokeringer er vellykkede eksempler på denne strategi [3], [4]. Behandling med disse kinase inhibitor lægemidler resulterer i forbedret effektivitet og har mere tolerable bivirkninger i forhold til standard kemoterapi i patienter, der på forhånd screenet for aktivering genetiske ændringer [5], [6], [7].

på trods af den indledende effekt af gefitinib, erlotinib, og crizotinib i udvalgte NSCLC patienter, erhvervet resistens uvægerligt opstår, typisk i mindre end et år. På celleniveau, denne modstand sker ved flere mekanismer. Den første af disse er mutation af målkinasen domæne, der reducerer evnen af ​​lægemidlet til at inhibere kinase. For eksempel T790M-mutationen, betegnet den “gatekeeper” mutation, reducerer evnen af ​​EGFR inhibitorer at udkonkurrere ATP-binding til EGFR [8]. Denne mutation (sammen med andre langt mindre hyppige resistensassocierede mutationer) er fundet i cellelinje modeller for modstand og i ca. 50% af patienter, der udvikler erhvervet resistens over for EGFR-hæmmere [9], [10], [11]. Den analoge gatekeeper position på ALK, L1196, er ligeledes fundet at være muteret i ALK fusion-positive lungekræft på tidspunktet for resistens over for crizotinib og hos resistente cellelinje modeller, som er flere andre aminosyrer, for hvilke mutation reducerer også vanskeligt for lægemidlet til at inhibere kinase [12], [13], [14], [15], [16]. Den anden mekanisme af resistens er amplifikation af mål-kinase. I teorien kan en stigning i mængden af ​​kinase, der udtrykkes af cellen reducere muligheden for lægemidlet til mætning af målet. Forstærkning af

ALK

fusioner er blevet demonstreret i resistente celler og patienter, der har udviklet resistens [13], [14], [16]. Desuden amplifikation af

EGFR

er blevet korreleret med resistens i

EGFR

mutant lungekræft, selvom det amplificerede allel i de fleste tilfælde huser T790M-mutationen [17], [18]. En anden væsentlig mekanisme af resistens er aktiveringen af ​​alternative signalveje komponenter. I dette tilfælde bliver proteiner, som er nedstrøms eller at funktionen parallelt målkinasen aktiveret og undergrave afhængighed målkinasen til udelukkende stimulere proliferativ og pro-overlevelse signalering. MET, PI3K, BRAF, IGF-1R, FGFR1, MEK, og ERK1 /2-aktivering er alle blevet observeret i EGFR inhibitor-resistente

EGFR

mutant sygdom og /eller cellelinie modeller [18], [19] [20], [21], [22], [23], [24]. Aktivering eller forstærkning af EGFR, KRAS, og KIT har på lignende måde observeret i crizotinib-resistente

ALK

omarrangerede patienter og cellelinjer [14], [15], [16], [25]. Endvidere en nylig undersøgelse viste, at udsættelse for fælles vækstfaktorer er tilstrækkeligt til at inducere modstandsdygtighed over for målrettede behandlinger i cancercellelinier fra en række forskellige genetiske baggrunde, og denne virkning korreleret med en redning fra lægemiddel-induceret AKT og ERK inaktivering [26]. Endelig er blevet demonstreret at korrelere med resistens histologiske og morfologiske ændringer. Konkret konvertering til småcellet lungekræft histologi og epitelial-mesenkymale overgang (EMT) er blevet observeret i

EGFR

mutant patienter og cellelinier resistente over for EGFR-hæmmere [11], [18]. De mekanistiske baser bag disse ændringer er ikke helt forstået.

ROS1

er en receptortyrosinkinase, der er nært beslægtet med

ALK

, og ligesom

ALK

, det undergår genomisk omlejring, der skaber fusionsproteiner i NSCLC og andre kræftformer [27]. Det er velkendt, at disse fusionsproteiner fungere som onkogene drivere og at ROS1 inhibering er antiproliferativ i celler, som udtrykker ROS1 fusioner [28]. Desuden crizotinib, som har aktivitet mod ROS1, demonstrerer effekt i

ROS1

fusion-positive NSCLC patienter i et fase I forsøg [29]. Således overvejer succes crizotinib i

ALK

fusion-positiv NSCLC, fremgår det, at ROS1 målrettet terapi vil sandsynligvis snart være standarden for pleje for denne patientgruppe. Men baseret på erfaringer med andre kinase hæmmere i lungekræft, er det fuldt forventes, at vil forekomme erhvervet resistens over for ROS1 hæmning, og det vil i sidste ende begrænse behandlingsmuligheder for disse patienter. Til støtte for denne, en nylig undersøgelse rapporteret et klinisk tilfælde af en

ROS1

omlejring-positive patient, der udviklet resistens over for crizotinib efter et første svar [30]. Patienten blev fundet at have undergået en mutation i

ROS1

kinase domæne, som blandede sig med narkotika bindende [30]. I denne undersøgelse har vi forsøgt at bestemme resistensmekanismer til ROS1 inhibering. Dette blev opnået ved hjælp af kliniske prøver fra en patient, der blev resistente over for crizotinib og en ROS1 hæmning-resistent derivat af

ROS1

omarrangeret NSCLC cellelinje HCC78.

Resultater

Vi tidligere rapporteret identifikation af en NSCLC patient, der gav udtryk for

SDC4-ROS1

fusion og den vellykkede behandling af denne patient med crizotinib [28]. Patienten oplevede 57% tumor krympning efter to 28-dages behandling cyklusser. Men trods kontinuerlig behandling, tegn på sygdomsprogression blev opdaget ca. 18 uger efter behandlingens start. På dette tidspunkt blev en excisional biopsi af forløber tumor taget. Målrettet sekventering af dette resistente biopsiprøve afslørede, at i lighed med forbehandlingen biopsi, hele

ROS1

kinasedomæne var vildtype (WT), således, at

ROS1

kinasedomæne mutation var ikke den mekanisme af resistens (tabel 1). Snapshot analyse også indikeret WT status almindeligt muterede rester i flere andre kendte onkogener (herunder

EGFR

,

KRAS

, og

BRAF

) i både forbehandling og post -resistance prøver (tabel 1). Vi derefter undersøgt kopi nummer gevinst af

ROS1

fusion gen som en potentiel mekanisme af resistens. Dette blev opnået ved anvendelse af fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) med prober til både 5′- og 3′-regioner af genet. Middel enkelt 3’signal (repræsentativt for fusionsgenet) antal pr tumorcelle var 1,7 i forbehandlingsprøve og 1,82 i den post-resistens prøve, en ikke-signifikant forskel (figur 1A). Dette fund antydede, at kopi nummer gevinst ikke var den mekanisme af resistens i denne patients tumor. Den post-modstand prøve afslørede et tab i det indre 5’signal; men dette ikke forventes at være funktionelt signifikant (figur 1A). Vi kontrolleret, at fusion genet blev udtrykt ved modstand, og at forholdet mellem lange (

SDC4

exon 2 fusioneret til

ROS1

exon 32 (SD2; R32)) til kort (

SDC4

exon 2 fusioneret til

ROS1

exon 34 (SD2; R34)) varianter lignede forbehandlingen prøve (figur 1B). Morfologisk undersøgelse af prøven taget ved resistens påvist fyldigt epithelioide celler med en stor kerne og cytoplasma ratio, fremtrædende nucleoli og eosinofil cytoplasma, svarende til forbehandling biopsi (figur 1C). Disse resultater antydede, at småcellet transformation ikke var sket. Endelig er der ingen morfologisk bevis for EMT, såsom cellulær spindling iagttoges, og biopsi taget ved resistens påvist negative immunhistokemisk farvning for vimentin, en EMT markør (fig S1). Den manglende beviser for disse fælles resistensmekanismer var antydede opregulering af alterative signalering som den underliggende mekanisme af resistens over for crizotinib i denne patient.

(A) forbehandling og post-modstand patientprøver analyseres ved pause- bortset FISH analyse for

ROS1

. Røde prober er til 5′-regionen af ​​ROS1 og grønne prober til 3′-regionen. Værdier repræsenterer det gennemsnitlige antal af signaler pr celle. Det indre 3 ‘signal (værdier understreget) er betegnende for den

ROS1

fusion genkopital. (B) RT-PCR under anvendelse af primere til

SDC4

og

ROS1

der spænder over smeltepunktet, udføres på forbehandling og post-resistens tumorprøver. SD2, R32 er den “lange” variant (sammensmeltning af

SDC4

exon 2 til

ROS1

exon 32) og SD2, R34 er “korte” variant (sammensmeltning af

SDC4

exon 2 til

ROS1

exon 34). (C) Hematoxylin og eosin-farvning af forbehandling og post-resistens patientprøver.

For at skabe en cellelinje model af resistens over for ROS1 inhibering, vi kronisk behandlede

SLC34A2-ROS1

udtrykker NSCLC cellelinje HCC78 med stigende koncentrationer af ROS1 inhibitor TAE684. Denne metode er tidligere blevet brugt til at skabe resistente modeller for både EGFR inhibitorer i

EGFR

mutant celler og crizotinib i

ALK

omarrangerede celler, og de observerede i disse modeller mekanismer er korreleret med, hvad der observeres hos patienter [13], [15], [19]. Vi valgte at bruge TAE684 (en ikke-klinisk forbindelse) i løbet crizotinib (et lægemiddel med klinisk aktivitet mod ROS1), fordi crizotinib har et relativt højt IC

50 i HCC78 celler og kun meget smalle vindue udgange mellem IC

50 og off-target aktiviteter af lægemidlet [28], [31]. Med andre ord, ved at anvende TAE684 at gøre cellerne resistente over for ROS1 inhibering stedet for crizotinib, var vi i stand til at sikre en mere fuldstændig inhibering af ROS1 fusionsproteinet ved doser, der ikke udviste off-target anti-proliferative virkninger. Efter ca. 4 måneder efter kultur i stigende koncentrationer, den resistente derivat af HCC78 linje, som vi betegnes HCC78-TR, var i stand til at formere sig normalt i 500 nM TAE684. Indledende forsøg på at øge dosis i kultur yderligere var forgæves, så 500 nM blev betragtet som et maksimum, og cellerne blev kontinuerligt dyrket i denne koncentration af lægemidlet. Når følsomheden af ​​disse celler til TAE684 blev analyseret i proliferationsassays blev det bestemt, at IC

50 i TAE684 var større end 1 pM (figur 2A). Dette svarer til andre NSCLC cellelinier, som ikke indeholder ALK eller ROS1 fusioner (H322 og HCC4006), hvilket antyder, at anti-proliferative virkninger i dette område skyldes sandsynligvis ikke-tilsigtede aktiviteter. HCC78-TR-celler var også mindre følsomme over for crizotinib, og igen, hvor følsomt var mere ligner celler, som ikke udtrykker ALK eller ROS1 fusioner (figur 2B). Imidlertid desensibilisering var specifik for ROS1 inhibering, som HCC78-TR-celler bevarede deres følsomhed over for pemetrexed, en FDA-godkendt kemoterapi for ikke-squamous lungecancer (figur 2C). Modstanden mod ROS1 inhibering var ikke afhængig af den kontinuerlige dyrkning i nærvær af 500 nM TAE684, fordi celler, der blev taget ud af lægemiddel forblev modstandsdygtig i op til 6 måneder og 47 passager (figur S2). Salg

Celler blev behandlet med TAE684 (A), crizotinib (B), eller pemetrexed (C) som enkelte-agents i 3 dage og derefter analyseret ved MTS-assay. Værdier repræsenterer middel ± SEM (n = 3-7). Beregnet IC

50 værdier for TAE684: forældrenes HCC78 = 0,14 uM, HCC78-TR = 1,09 uM, H322 = 1,42 uM, og HCC4006 = 1,15 uM. Beregnede IC

50 værdier for crizotinib: forældrenes HCC78 = 0,79 uM, HCC78-TR = 1,95 uM, H322 = 4,13 uM, og HCC4006 = 3,03 uM. Beregnet IC

50 værdier for pemetrexed: forældrenes HCC78 = 11 nM og HCC78-TR = 14 nM. HCC78-TR-celler var signifikant mindre følsomme end parentale HCC78 celler til TAE684 (p 0,000005) og crizotinib (p 0,05), men ikke pemetrexed (p 0,05). Som bestemt ved studerendes parret t-test

Sekventering af forældrenes HCC78 og HCC78-TR celler viste, at kinase domæne af

ROS1

var WT for begge linjer, hvilket tyder på, at

ROS1

mutation ikke var ansvarlig for resistens over for ROS1 hæmning (tabel 1).

EGFR

,

KRAS

, og

BRAF

blev også fundet at være WT i begge cellelinier (Tabel 1). FISH-analyse viste, at de HCC78-TR-celler tabt 1 kopi af

ROS1

fusionsgen i sammenligning med den parentale linje (1 kopi vs. 2 kopier henholdsvis), hvilket antyder, at kopiantallet gevinst af fusionsgenet var ikke den mekanisme af resistens (figur 3A). Som et resultat af den genomiske tab på 1 kopi af fusionsgenet, mindre

SLC34A2-ROS1

mRNA blev udtrykt i de HCC78-TR-celler (Figur S3). Selvom betydningen af ​​den reducerede fusion genekspression er uklart, tvungen ekspression af et aktiveret ROS1 fusionsprotein (SDC4-ROS1) i HCC78-TR-celler ikke igen sensibilisere dem til TAE684 (fig S4). Ca. 40% af de HCC78-TR celler vises en stigning i antallet af kopier af 5′-området af

ROS1 Hotel (fra 2 eksemplarer til 4 kopier), selv om dette ikke forventes at være funktionelt signifikant som 5′-område udviser ikke kinaseaktivitet (figur 3A). Desuden har morfologi HCC78-TR celler ikke visuelt adskiller sig fra den for forældrenes HCC78 linje, tyder på, at omdannelsen til et småcellet lungekræft morfologi ikke forekomme (figur 3B). Ved mRNA kvantificering,

CDH1

niveauer var ens mellem de to cellelinjer og

VIM

niveauer blev nedsat tre gange i HCC78-TR streg (Figur S5). Disse resultater antyder, at EMT ikke var resistensmekanisme. Endelig har vi ikke observere betydelige stigninger i mRNA udtryk for nogen af ​​ATP-bindende kassette transportør familie gener i HCC78-TR celler, hvilket tyder på, at øget stof efflux sandsynligvis ikke højde for modstanden mod ROS1 hæmning (tabel S1).

(A) Parental HCC78 og HCC78-TR analyserede celler ved break-apart FISH analyse til

ROS1

. Røde prober er til 5′-regionen af ​​ROS1 og grønne prober til 3′-regionen. Værdier repræsenterer antallet af signaler pr celle. Det indre 3 ‘signal (værdier understreget) er betegnende for den

ROS1

fusion genkopital. I HCC78-TR linje, eksisterede to befolkninger, afveg baseret på antallet af 5 ‘signaler detekteret. (B) Repræsentative lyse felt billeder af forældrenes HCC78 og HCC78-TR celler.

Vi spurgte så, om modstanden mod ROS1 hæmning kan skyldes ændringer i nedstrøms cellulær signalering. Parental HCC78 og HCC78-TR-celler blev behandlet med en dosis-række TAE684 i 4 timer og derefter cellelysater blev analyseret ved western blot. Svarende til, hvad vi tidligere har rapporteret, TAE684 behandling reducerede ROS1 autophosphorylering og aktivere phosphorylering af SHP-2, AKT, og ERK1 /2 i forældrenes HCC78 celler (figur 4A) [28]. Som forudsagt fra det genomiske kopital tab af

ROS1

fusionsgen og den reducerede mRNA-ekspression, de HCC78-TR celler udtrykte mindre af fusionsproteinet end den parentale linje og ROS1 autophosphorylering kunne ikke påvises. Reduktionen i mængden af ​​ROS1 fusionsprotein korreleret med en reduktion i den basale phosphorylering af SHP-2. Trods fusionsproteinet tab, basale niveauer af phosphoryleret ERK1 /2 lignede den parentale linje og basale niveauer af phosphoryleret AKT var større end i den parentale linje. Vigtigere er, at TAE684 behandling ikke resulterer i de-phosphorylering af AKT eller ERK1 /2 i de resistente celler. Lignende resultater blev observeret med crizotinib behandling (figur 4B). Salg

Celler blev behandlet med TAE684 (A) eller crizotinib (B) i 4 timer. Lysater af cellerne blev derefter analyseret ved Western blot under anvendelse af de angivne antistoffer.

Reduktionen i mængden af ​​udtrykt ROS1 fusionsprotein, persistensen af ​​basal AKT og ERK1 /2-aktivering, og manglen på inhibering af AKT og ERK1 /2 af ROS1 inhibitorer foreslået, at en alternativ signalvej blev aktiveret i HCC78-TR-celler. I et forsøg på at identificere de opreguleret pathway komponenter, udførte vi to phospho-Proteinarray eksperimenter: en, der undersøgte receptortyrosinkinaser (RTK) og en, der analyseres downstream kinaser (blandt andre proteiner). Som vi har observeret tidligere, forældrenes HCC78 linje udtrykt phosphoryleret EGFR og MET, når undersøgt med phospho-RTK array (figur 5A) [28]. Den HCC78-TR linje udtrykte stadig phosphoryleret EGFR, men phospho-MET var signifikant reduceret (figur 5A). Ingen andre signifikant phosphoryleret receptortyrosinkinaser blev observeret. Som forudsagt ud fra western-blot-analyse, blev AKT phospho-S473 steget i de HCC78-TR-celler sammenlignet med de parentale celler, som var flere phosphoryleringssteder på p53 (figur 5A). Disse var de eneste forskelle observeret af phospho-protein array.

(A) Phospho-RTK (øverst) og phospho-kinase (nederst) matrix analyser udført på ubehandlet forældrenes HCC78 og HCC78-TR celler. Proteiner af interesse er mærket. Umærkede pletter ved hjørnerne af begge sæt arrays er den positive kontrol. (B) Parental HCC78 og HCC78-TR-celler blev behandlet med TAE684, gefitinib, eller en kombination af begge i 4 timer. Lysater af cellerne blev derefter analyseret ved Western blot under anvendelse af de angivne antistoffer. (C) Parental HCC78 (P) og HCC78-TR (T) -celler blev efterladt ubehandlet, behandlet med 1 uM gefitinib i 4 timer, eller behandlet med 100 ng /ml EGF i 10 minutter. Lysater af cellerne blev derefter analyseret ved Western blot under anvendelse af de angivne antistoffer.

Vi har tidligere påvist, at EGFR-signalering er delvist aktiv i den parentale HCC78 linje, som en kraftig anti-proliferativ effekt af TAE684 kunne kun opnås med co-behandling med EGFR-inhibitor gefitinib [28]. På grund af de iagttagelser, at EGFR var den eneste signifikant phosphoryleret RTK i HCC78-TR linje, og at AKT, som almindeligvis aktiveres nedstrøms for EGFR, var tungere phosphoryleret i HCC78-TR linje, vi hypotese, at måske EGFR signalering havde været yderligere involveret i de resistente celler. For at teste denne hypotese, vi behandlede parentale HCC78 og HCC78-TR-celler med 200 nM TAE684, 1 uM gefitinib, eller en kombination af begge i 4 timer. Igen, phospho-AKT og phospho-ERK1 /2 var følsomme over for TAE684 behandling i den parentale linje, men ikke den HCC78-TR linje (figur 5B). Imidlertid vendte situationen, når disse linjer blev behandlet med gefitinib, med nedstrøms signalering er følsomme i HCC78-TR linje, men ikke den parentale linje (figur 5B). Lignende virkninger blev observeret med kemisk forskellige EGFR-hæmmere erlotinib, lapatinib, og afatinib, hvilket tyder på, at virkningerne skyldtes on target EGFR hæmning (Figur S6). Således var WT EGFR blevet den dominerende drivkraft for vækst og overlevelse signalveje i HCC78-TR celler. Denne ændring i cellulær signalering korreleret med en beskeden stigning i de samlede EGFR niveauer i HCC78-TR-celler sammenlignet med de parentale HCC78 celler (figur 5C). Autophosphorylering af EGFR som bestemt ved western blot under anvendelse af en cocktail af phosphoryleringssted-specifikke antistoffer, var relativt lav i begge cellelinier. Men efter stimulering med EGFR-ligand EGF blev autofosforylering steget og var højere i HCC78-TR-celler (Figur 5C). mRNA kvantificering afslørede, at de fleste EGFR-ligander ikke var signifikant mere udtrykt i HCC78-TR-celler, med undtagelse af NRG1 som udviste en 4 gange stigning i mRNA-niveauer (fig S7).

På grund af kontakten i kontrol af vækst- og overlevelse signalveje fra ROS1 til EGFR i HCC78-TR-celler, vi hypotese, at proliferation af disse celler ville være følsomme over for EGFR inhibition. For at teste denne hypotese, vi behandlede både forældrenes HCC78 og HCC78-TR-celler med gefitinib som enkeltstof i proliferationsassays. Som vi tidligere har rapporteret, var gefitinib ved koncentrationer op til 5 uM ikke påvirke udbredelsen af ​​forældrenes HCC78 celler (Figur 6A) [28]. Imidlertid lægemidlet beskedent inhiberede proliferationen af ​​HCC78-TR-celler (figur 6A). Lignende effekter blev observeret med erlotinib (data ikke vist). Vores hypotese derefter at eftersom HCC78-TR-celler stadig udtrykte nogle, omend reducerede niveauer af ROS1 fusionsproteinet, ville et komplet antiproliferativ virkning induceret af gefitinib kræve samtidig inhibering af ROS1. For at teste denne hypotese, behandlede vi HCC78-TR-celler med et dosisområde på gefitinib i kombination med 500 nM TAE684 (koncentrationen af ​​lægemiddel, at disse celler var kontinuerligt dyrket i). Tilsætningen af ​​500 nM TAE684 havde nogen antiproliferativ virkning i sig selv; Men det yderligere sensibiliserede cellerne til gefitinib behandling (figur 6B). Under disse betingelser, de HCC78-TR-celler var ikke så følsomt som HCC827 NSCLC cellelinie, som er drevet af E746_A750del EGFR. Dette er forventet, fordi aktiverende mutationer på EGFR forbedre dets affinitet til EGFR kinase inhibitorer [32]. Imidlertid HCC78-TR-celler var som eller mere følsomme end WT EGFR udtrykkende NSCLC linjer H358 og H322, (figur 6B). Disse to cellelinjer er blevet rapporteret at være meget følsomme over for gefitinib sammenlignet med andre WT EGFR udtrykkende NSCLC linjer [33]. Vigtigt er det, i HCC78-TR celler, blev signifikant anti-proliferativ aktivitet observeret ved klinisk relevante doser af gefitinib (~ 1 uM), når det kombineres med ROS1 hæmning [34].

(A) Parental HCC78 og HCC78- TR-celler blev behandlet med gefitinib som enkeltstof i 3 dage og derefter analyseret ved MTS-assay. (B) Parental HCC78 og HCC78-TR-celler blev co-behandlet med 500 nM TAE684 og gefitinib, og HCC827, H322, og H358 celler blev behandlet med monoterapi gefitinib i 3 dage og derefter analyseret ved MTS assay. Beregnet IC

50 værdier: forældrenes HCC78 (under 50% med single-agent TAE684), HCC78-TR = 0,86 uM, HCC827 = 0,04 uM, H322 = 5 uM, og H358 = 1,0 uM. Alle værdier repræsenterer middelværdien ± SEM (n = 4).

Som en proof-of-concept, som EGFR-aktivering kan de-sensibilisere ROS1 fusion-drevne celler til ROS1 hæmning undersøgte vi effekten af ligand-induceret receptoraktivering på følsomhed. For at opnå dette udførte vi proliferationsassays undersøger følsomhed for TAE684 i fravær eller nærvær af EGFR-liganden EGF. Vi fandt, at tilsætningen af ​​EGF ved begyndelsen af ​​assayet markant desensibiliseret de parentale HCC78 celler til inhibering af ROS1 (figur 7A). I modsætning hertil EGF havde ingen effekt på følsomheden af ​​HCC78-TR-celler, som var forventet på grund af den allerede maksimal ufølsomhed for denne linje (

cf

figur 2A). Mekanistisk, desensibilisering i forældrenes HCC78 celler korreleret med en redning af EGF fra TAE684-inducerede de-fosforylering af AKT og ERK1 /2 (Figur 7B).

(A) Parental HCC78 og HCC78-TR celler blev behandlet med TAE684 i 3 dage med eller uden tilsætning af 100 ng /ml EGF og derefter analyseret ved MTS-assay. Værdier repræsenterer middel ± SEM (n = 3). Beregnet IC

50 værdier for TAE684: forældrenes + køretøj = 0,18 uM, forældrenes + EGF = 0,57 uM, HCC78-TR + køretøj = 1,39 uM, og HCC78-TR + EGF = 1,45 uM. EGF væsentligt desensibiliseret parental HCC78 men ikke HCC78-TR-celler til TAE684 som bestemt ved studerendes parret t-test (p 0,05). (B) Parental HCC78 celler blev behandlet med TAE684 i 4 timer, EGF i 10 minutter, eller en kombination af begge. Lysater af cellerne blev derefter analyseret ved Western blot under anvendelse af de angivne antistoffer. (C) Cutò-2-celler blev behandlet med TAE684 i 4 dage med eller uden tilsætning af 100 ng /ml EGF og derefter analyseret ved MTS-assay. Værdier repræsenterer middel ± SEM (n = 3). Beregnede IC

50 værdier for TAE684: + vehicle = 0,2 uM og + EGF = 0,81 uM. EGF væsentligt desensibiliseret Cutò-2-celler til TAE684 som bestemt ved studerendes parret t-test (p 0,01). (D) Cutò-2-celler blev behandlet med TAE684 i 4 timer, EGF i 10 minutter, eller en kombination af begge. Lysater af cellerne blev derefter analyseret ved Western blot under anvendelse af de angivne antistoffer. Phosphoryleret ROS1 bands var under detektionsgrænsen, og blev derfor ikke medtaget.

En cellelinje blev afledt fra biopsi, der blev taget fra patientens resistente tumor. Etablering af denne cellelinie, som vi har kaldt Colorado University Thoracic Oncology-2 (Cuto-2), tog ca. et år i kultur og blev udført i fravær af en ROS1 inhibitor. Når cellerne nået tilstrækkelig passage nummer ( 35 passager) og tilstrækkelig vækstrate for eksperimentel analyse undersøgte vi ROS1 fusion gen status, ROS1 fusionsproteinekspression, og følsomhed over for ROS1 hæmning. De Cuto-2 celler blev verificeret stadig udstille omlægning af

ROS1

gen og udtrykke et ROS1 fusionsprotein (figur S8A, B). I proliferationsassays, de Cutò-2-celler demonstrerede en lignende følsomhed til TAE684 og en let forøget følsomhed over for crizotinib sammenlignet med de parentale HCC78 celler (figur 7C og fig S8C). Interessant, ligesom de parentale HCC78 celler, følsomhed over for ROS1 inhibering kunne reduceres med EGF ansøgning, og denne desensibilisering korreleret med redning fra TAE684-induceret reduktion af phosphoryleret AKT og ERK1 /2 (figur 7 C og D).

diskussion

Erhvervet resistens over for målrettede behandlinger er en vigtig begrænsning for behandling af patienter med lungecancer. Dog kan udvikles rationelle tilgange til bekæmpelse af modstand, når de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for den, er identificeret. I denne undersøgelse undersøgte vi resistensmekanismer til ROS1 hæmning i NSCLC. Dette blev opnået ved hjælp af tumor prøver fra en NSCLC patient, der blev resistente over for crizotinib og en NSCLC cellelinie, som vi gjorde resistente over for ROS1 hæmning ved kontinuerlig kultur i ROS1 inhibitor TAE684. Ideelt, undersøgelser forpligtet sig til at undersøge resistensmekanismer inddrage eksempler banker fra flere patienter og flere forskellige cellelinjer. Men som

ROS1

omrokeringer er kun til stede i 1-2% af NSCLC patienter, havde vi kun adgang til en patient, som blev resistente over for behandling. Endvidere forud for vores afledning af Cutò-2 linje, HCC78 var den eneste publicerede NSCLC cellelinie kendt for at udtrykke et ROS1 fusionsprotein. På trods af disse begrænsninger, resultaterne fra denne undersøgelse har stor betydning for

ROS1

omlejring-positive patienter, der bliver resistente over for crizotinib behandling. Forud for vores undersøgelse, havde kun én offentliggjorte rapport identificeret en mekanisme af resistens over for ROS1 hæmning. I undersøgelsen af ​​Awad et al., En

ROS1

omlejring-positive patient, der oprindeligt reagerede på crizotinib men blev resistente fandtes at have erhvervet en mutation i codon 2032 af en

ROS1

fusion gen (

CD74-ROS1

). Denne mutation blev påvist at interferere med crizotinib binding til ROS1 ATP-bindingssted [30].