PLoS ONE: Påvisning og karakterisering af CD133 + Cancer Stamceller i human Solid Tumours

Abstrakt

Baggrund

Osteosarkom er den mest almindelige primære tumor i knogle. Solide tumorer er lavet af heterogene cellepopulationer, som viser forskellige mål og roller i tumor økonomi. En forholdsvis lille celle delmængde kan holde eller erhverve stamceller potentialer, vinder aggressivitet og stigende forventede for tilbagefald. The CD133-antigen er en pentaspan membranglycoprotein, som er blevet foreslået som en kræft stamcelle markering, da det tidligere er blevet påvist at være i stand til at identificere en cancer initierende subpopulation i hjernen, colon, melanom og andre faste tumorer. Derfor er vores mål var at observere den mulige tilstedeværelse af celler, der udtrykker CD133-antigen i solide tumor cellelinier af osteosarkom og derefter, forstår deres biologiske karakteristika og ydeevne.

Metode og vigtigste resultater

I denne undersøgelse, hjælp SaOS2, MG63 og U2OS, tre humane sarkom cellelinjer isoleret fra unge kaukasiske personer, var vi i stand til at identificere og karakterisere, blandt dem, CD133

+ celler, der viser følgende funktioner: høj spredning sats, cellecyklus detektion i en G2 \\ M fase, positivitet for Ki-67, og udtryk for ABCG2 transportører. Desuden ved FACS, var vi i stand til at observere CD133

+ cellefraktion viser side befolkning profil og danner kugle-klynger i serum-frit medium med en høj klonogen effektivitet.

Konklusioner

tilsammen vores resultater fører til den tanke, at vi kan antage, at vi har identificeret, for første gang, CD133

+ celler i osteosarkom cellelinjer, som viser mange funktioner i cancer stamceller. Dette kan være af temmelig interesse for at designe nye behandlingsformer mod knoglekræft

Henvisning:. Tirino V, Desiderio V, d’Aquino R, De Francesco F, Pirozzi G, Galderisi U, et al. (2008) Detektion og karakterisering af CD133

+ Cancer Stamceller i Human solide tumorer. PLoS ONE 3 (10): e3469. doi: 10,1371 /journal.pone.0003469

Redaktør: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: 12. maj 2008; Accepteret: September 29, 2008; Udgivet 21. oktober, 2008

Copyright: © 2008 Tirino et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. MURST ( Italien), 2. universitetet i Napoli. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

osteosarkom er den mest almindelige primære tumor af knogle. Det sker i knogler og ekstra ossøse steder, og viser en bimodal aldersfordeling, med en første højdepunkt i det andet årti af livet, relateret til den unge voldsomme vækst (400 nye pædiatriske tilfælde om året i De Forenede Stater), og en anden top i ældre voksne [1]. Forekomsten er lidt højere i afrikansk-amerikanere end hos kaukasiere og død er som regel resultat af progressiv pulmonal metastaser med respirationssvigt grund af udbredt [2] sygdom. Sarkom genetiske ændringer omfatter både oncosuppressor og onkogene veje, hvis produkter regulerer cellecyklusprogression [3]. Faktisk er det velkendt, at solide tumorer er befolket af heterogene cellepopulationer, der omfatter celler med stamceller-lignende egenskaber, såsom høj spredning sats, hurtig ekspansion og invasive vækst [4], [5].

A tumor kan tænkes som en helhed orgel, som udgøres af forskellige celler, som viser tydelige roller i økonomien i tumoren. Det er velkendt, at funktionen af ​​stamceller er at vedligeholde og reparere væv. Stem potentiale kan også erhverves af kræft celle, og denne begivenhed er meget vigtigt for tumor progression.

Aktuel mening er, at tumorer kan stamme fra et lille antal celler med stamceller-lignende egenskaber. Nye behandlingsformer rettet mod disse celler, som er grundlæggende for tumor progression, i væsentlig grad kan forbedre den kliniske behandling af cancer. Derfor er det af afgørende betydning at identificere, inden tumorer, subpopulationer af celler, der udviser betydelige forskelle med hensyn til spredning, stamceller markør udtryk og adfærd.

CD133-antigenet er en pentaspan membran glycoprotein, præget af to uafhængige undersøgelser [6], [7] og oprindeligt identificeret i neuroepitelceller stamceller [8]. Dens interesse som en kræft stilk markør er vokset dramatisk, da det viste sig, at det var i stand til at identificere en kræft initierende delpopulation i hjernen [9] og kolon [10]. Desuden CD133

+ -celler er også fundet i leverkarcinom [11] og melanom [12], men hidtil endnu ikke i osteosarkomer, hvor tilstedeværelsen af ​​formodede stamceller-lignende celler danner kugler er blevet rapporteret [13 ].

Derfor har vi til formål at bruge CD133 som en markør til påvisning af eventuel tilstedeværelse af cancer stamceller inden SaOS2, MG63 og U2OS menneskelig sarkom cellelinjer isoleret fra osteosarkomer unge kaukasiske personer. Disse cellelinjer er tidligere blevet brugt som modeller for osteosarkom [14], [15] og osteoblast-lignende celler [16], [17]. I denne undersøgelse med henblik på at specifikt at identificere CD133

+ cancer stamceller, har vi undersøgt forholdet mellem stamceller træk og kinetikken for CD133 markørekspression.

Vores resultater, først og fremmest demonstrerer, for første gang, at CD133-antigen kan observeres i celler i forskellige osteosarkom stabiliseret cellelinier. Desuden har vi vist, at disse celler udviser høj proliferationshastighed og at de er stand til at danne klynge kugler. Desuden har vi fundet, at disse celler er meget klonogene og tumorigene. Tilsammen vores data føre til den tanke, at cancer stamceller (CSCS), der er tumor initierende celler, kan findes i osteosarkomer og dette kan være af afgørende betydning ved udformningen af ​​nye kræftbehandlinger for knogle.

Resultater

SaOS2, U2OS og MG-63 osteosarcom cellelinier blev testet for at detektere, i dem, tilstedeværelsen af ​​en CD133

+ cellepopulation. CD133 er et stamcellemarkør beskrevet for første gang i neuro-endotel progenitorer, og for nylig er blevet formodes at være en selektiv markør for cancer stamceller (CSC) i nogle kræftformer. Vores resultater viser klart, at i alle de tre cellelinier, to subpopulationer: en CD133

+ (fra 3% til 5%) og en CD133

-, kan identificeres (fig. 1). Brug af FACsorting, opnåede vi en CD133

+ beriget population (98,8%) og en CD133

– cellepopulation. Ekspressionen af ​​CD133-antigen blev analyseret ved anvendelse af to forskellige antistoffer. Resultaterne bekræftede, at de CD133-negative celler ikke udtrykte antigenet på celleoverfladen, og at CD133-positive celler blev udtrykt på samme procentvise niveau med begge antistoffer.

A CD133

+ kan detekteres cellepopulation i alle tre cellelinier.

Desuden alle tre cellelinier var negative for CD34-antigenet, men de fremgår lig stærk positivitet for CD29, CD44 og CD90, mesenchymale og cancerstamceller markører. Både fraktioner af CD133

+ og CD133

– celler var positive for CD29, CD44 og CD90 antigener i alle tre cellelinjer (fig 2.)

Alle tre cellelinjer er negative for CD34. antigen, men de beviser lige stærke positivitet for CD29, CD44 og CD90

de to cellepopulationer (CD133

+ og CD133

-). blev derefter brugt til at udføre cellecyklus analyse, vækst analyse, sfære dannelse klynge assay, blød agar assay og afsløring side befolkning.

celle cyklus, proliferation assays og vækst analyser

propidiumiodid (PI) assay viste en markant forskel i cellecyklus af CD133 sorteret celler. CD133

+ -celler var hovedsagelig i G2 \\ M-fasen, mens CD133

– celler var overvejende G0 \\ G1 (figur 3A.), Hvilket indikerer, at CD133

+ subpopulationen er den aktive prolifererende cellefraktion. Desuden er alle de CD133

+ celler viste sig at være Ki-67

+ (Fig 3B.), Mens størstedelen af ​​CD133

– celler var negative for denne markør. Ki-67 er et protein kun udtrykkes i prolifererende celler, således vores resultater bekræfter, at CD133

+ fraktion er kilden til nyligt genererede celler.

(A) Figur af cellecyklus analyser udført på SaOS2, MG63 og U2OS cellelinier. En CD133

+ celle befolkning er primært observeres i G2 \\ M fase, hvorimod CD133

– celler var overvejende G0 \\ G1; (B) Figur viser Ki-67-reaktivitet. CD133

+ celler resulterede at være Ki-67

+, hvorimod CD133

– var overvejende negative for denne markør; (C) Figur viser vækstkurver CD133

+ celler med respekt CD133

– celler i SaOS2, MG63 og U2OS cellelinjer. CD133

+ -celler har en høj proliferativ potentiale i alle tre cellelinier.

Desuden, for at vise, om CD133

+ -celler var i stand til extensivelly proliferere sammenlignet med CD133

– celler, observerede vi deres vækst. Vores data viste, at tumor kulturer afledt af CD133

+ celler udviser højere proliferativt potentiale med hensyn til CD133

– celler i alle tre cellelinier. Faktisk (Fig 3C) CD133

+ celler udviste en gennemsnitlig fordoblingstid på ca. 40 timer, 33 timer og 38 timer i SaOS2, MG63 og U2OS cellelinjer, hvorimod CD133

– celler viste en gennemsnitlig fordoblingstid på 48 timer, 44 timer og 42 timer i SaOS2, MG63 og U2OS cellelinier hhv. Når celler var Tilhænger, efter sortering, procentdelen af ​​CD133 udtrykkende celler faldt betydeligt (p 0,001) med tidspunktet for kultur (data ikke vist)

Sphere klyngedannelse

evne til at vokse. i suspension i serumfrit medium, der er beskrevet for første gang for at vælge neural stamcelle gennem neurosfære dannelse, er stort set blevet undersøgt som en tumorfremkaldende celleselekteringen metode. Glioblastom, coloncancer, og melanomceller frem for alt udvalgt for deres evne til at danne sfære klynger, fandtes at være stærkt tumorigene og i stand til at udbrede og rekonstituere oprindelige tumor arkitektur når de injiceres i tolerante værter. Vores resultater på osteosarkom cellelinjer viste, at kugle klynger klart blev observeret allerede efter 24 timer i CD133

+ kulturer, mens CD133

(Fig 4A, C, D.) – Ikke danner kugler (Fig 4B.). Efter 7 dages dyrkning, kugler opnået i CD133

+ -celler blev podet i standard plader med 10% FBS. Celler migrerede fra sfærerne i løbet af få timer, og klæbet til bunden af ​​kolberne, under antagelse af en polygonal form. Disse celler resulterede at være mindre i størrelse sammenlignet med CD133

– celler. Efter en uge, vi foretaget en ekstra test for CD133 antigenet på klæbende celler. Interessant, igen en CD133

– blev observeret befolkning, der beviser, at CD133

– celler, på dette tidspunkt, stammer fra CD133

+ celle. Derefter udførte vi en ny sortering af disse celler, og observeret, at CD133

+ fraktion stadig bevaret evnen til at danne kugler, mens CD133

-. Gjorde ikke Salg

(A) Sphere klynger dannet af CD133

+ celler i halvfast medium efter 24 timer (Original Forstørrelse x 100); (B) CD133

– celler i halvfast medium efter 7 dage, ikke danner kugler. (Original Forstørrelse x 100); (C) Sphere klynger dannet af CD133

+ celler efter 48 timer (Original Forstørrelse x 200); (D) Sphere klynger dannet af CD133

+ celler efter en ny sortering (Original Forstørrelse × 400).

Desuden testede vi OCT3 /4 og CD133 udtryk ved 6

th celle passage og ved 4

th og 6

th passage, henholdsvis på sarcospheres afledt af CD133

+ -celler efter sortering. Resultaterne viste, at kuglerne blev beriget både i OCT3 /4 og CD133 med cirka kultur (fig. 5).

Den blå linje angiver isotypekontroller, røde og grønne linjer angiver ekspressionen af ​​CD133 på 4

th og 6

th celle passage hhv. I histogrammerne er OCT3 /4-ekspression analyseret ved 6

te celle passage; den grønne linje angiver isotypekontroller. Sarcospheres både i CD133 og OCT3 /4 er stærkt positiv.

blød agar-assay

blød agar-assays blev udført for at observere forskelle i celle tumorigenicitet ved hjælp af evnen hos CD133

+ celler til at danne kolonier i forhold CD133

– celler. Som vist i tabel 1, blev kolonier dannet mere effektivt ved CD133

+ celler, som gav anledning til en 5,5 ± 1,8 gange større antal kolonier end der er registreret i CD133

– population (

p

0,005) i SaOS2; 7,7 ± 1,5 gange større antal kolonier end dem observeret i CD133

– population (

s

0,001) i MG63, og 6,8 ± 1,7 gange større antal kolonier end dem observeret i CD133

– befolkningen i U2OS (P 0,005)

Side befolkning og ABCG2

Inden for CD133

+ fraktionen en meget lille delmængde (0,97%) udtrykte det karakteristiske. profil af en side befolkning. Det er kendt, at den side befolkning fænotype er den mest betydningsfulde egenskab ved cancer stamceller. I denne undersøgelse viser vi for første gang, at i osteosarcom cellelinier kan påvises en side population. Endvidere fandt vi, at alle de tre cellelinier udtrykte ABCG2 transporter (fig. 6), som er normalt forbundet med side befolkning fænotype og medikamentresistens.

(A) cytometrisk analyse af side- befolkning. The CD133

+ fraktion omfatter en lille delmængde (0,97%), der udtrykker den karakteristiske profil af en side befolkning på FACS. (B) ABCG2 ekspression i SaOS2 cellelinie, der viser en tydelig positivitet; den grå linje angiver isotypekontrol.

Immunhistokemi og immunofluorescens

Både immunhistokemiske og immunofluorescens analyser på klæbet celler og flydende kugler blev udført i denne undersøgelse. Vores resultater derfor med FACS analyser, bekræftede tilstedeværelsen af ​​CD133-antigen på cellemembranen af ​​CD133

+ sorterede celler. Desuden viste flydende kugler et bredt diffus farvning for CD133, der bekræfter, at kuglerne er dannet af CD133

+ celler. Interessant nok CD133

– blev sorteret fraktion farvet for CD133, som blev lokaliseret i intra-cytoplasmiske vesikler som vist ved confoal mikroskopi (figur 7A, B, C, D, E, F.). For at dybt forstå dette aspekt, udførte vi, ved FACS, en intra-cellulær farvning for CD133. Vi fandt, at i alle de tre cellelinier et intracellulært positivitet blev observeret (fig. 8A), mens kontrol isotyper var negative.

(A) Immunohistokemisk analyser på adhærerende celler og (B) flydende kugler viser tilstedeværelsen af CD133 antigen (pile). (Original Forstørrelse × 100.); (C) Immunofluorescensanalyse på SAOS-2 for CD133 PE, er cytoskeleton farvet med phalloidin-FITC, kerne med DAPI (Original Forstørrelse × 400.); (D) Immunoflurescence analyse på Saos-2-sfærer for CD133 PE efter 24 timer i adhæsion. (Original Forstørrelse x 200); (E) Konfokal analyser på adhærerende celler og (F) flydende kugler, der bekræfter tilstedeværelsen af ​​CD133-antigen. (Original Forstørrelse. × 400).

(A) Figur udføres på FACS viser intracellulær ekspression af CD133-antigen i SAOS-2, MG-63 og U2OS. (B) Figur viser på Real time PCR mRNA udskrift udtryk i CD133

+ og CD133

– celler. Niveauerne er næsten identiske som påvist ved både CD133 positive og negative celler.

Real Time-PCR-analyse

udtryk for CD133 mRNA-niveauer i CD133

+ og CD133

– adhærente celler var næsten identiske som påvist af Real Time PCR (fig 8B.). Dette bekræfter både FACS og immunofluorescens resultater, som vist ovenfor.

Diskussion

Osteosarkom er en yderst aggressiv tumor, der overvejende rammer unge mennesker. Efter de seneste undersøgelser [10] – [13], [18] at støtte tilstedeværelsen af ​​en meget tumorigen celle delmængde – kaldet Cancer Stamceller (CSCS) – inden for tumor bulk, vi forsøgte at isolere og karakterisere denne delpopulation i osteosarkom cellelinjer . Tumor læsioner omfatter heterogene cellepopulationer, blandt hvilke forekomsten af ​​stamceller antigener kan dokumenteres ved hjælp af fænotypiske analyser. Tilstedeværelsen af ​​en CD133

+ subpopulationen inden humane faste tumorer er blevet dokumenteret af adskillige rapporter [10] – [13], [18] – [21], og celler, som udtrykker denne markør synes at være forskellig fra de andre cancerceller . Især CD133

+ celler besidder stamceller-lignende funktioner, såsom differentiering evne, høj proliferationshastighed, dannelse sfære klynge og evnen til at propagere tumor i tolerante værter. Kræft terapi fejl kan skyldes ineffektive virkningerne af en nuværende terapi upon potentielt hvilende CSCS, som fortsat vital og fastholde evnen til at regenerere tumoren [22], [23]. Udvikling af nye CSC-målrettede strategier er i øjeblikket hindres af manglen på pålidelige markører til identifikation af CSCS og ringe forståelse af deres adfærd og skæbne. Cellelinier, der stammer fra tumorer, fastholde hierarkiske stamcelle mønstre, påviselige med forskellige klonogene evner, relateret til cellulære egenskaber, såsom størrelse, klæbeevne, udelukkelse farvestof og genekspressionsmønstre [24].

I denne undersøgelse vi brugte CD133-antigenet som en kræft stamcelle markør for at identificere, inden stabiliseret osteosarkom cellelinjer, celler udviser forskellige egenskaber med hensyn til spredning sats, klonogene effektivitet, dannelse sfære-cluster og farvestof udstødelse. Screening tre osteosarcom cellelinier blev CD133

+ delmængder fundet at være 3% til 5% af totale celler, ifølge den antagelse, at CSCS bør kun være en meget lille celle delmængde. Der er ingen forskel i CD29, CD44 og CD90 udtryk både i CD133

+ og CD133

– celler. Faktisk er cancer stamceller betragtes som hvilende

in vivo

og de sjældent deler asymmetrisk, føder stærkt prolifererende afkom [5]. Men hvis en stilk hierarki eksisterer i cellelinier, celler med stamceller funktioner kan ikke være hvilende; Ellers skal de gå tabt i et par passager. Ifølge denne betragtning, fandt vi, at CD133

+ celler var meget proliferativ, når man sammenligner med CD133

– celler, hvilket bekræftes af PI-analyse, Ki-67 mærkning og vækst analyser

CD133

+ -celler viste mange forskelle med hensyn til deres negative modstykker, der har evnen til at vokse som sfærer i en halvfast medium og til effektivt at danne kolonier i blød agar. Disse analyser er almindeligt betragtes som henholdsvis indekser af selvfornyelse, tumorigenicitet og clonogenicity. Desuden sarcospheres, som er afledt af CD133

+ -celler, udtrykte høje niveauer af OCT3 /4, som er transkriptionsfaktorer kritisk involveret i selvfornyelse og i opretholdelsen af ​​pluripotens af udifferentierede embryonale stamceller [25]. I vores hænder CD133

+ celler viste alle disse evner og udtrykte ABCG2, som er en membran transporter, som regel forbundet med side befolkning fænotype og narkotika modstand [26]. Derfor kan dette betragtes som en yderligere markør for CSCS. Endvidere i denne undersøgelse, vi effektivt viste for første gang, der kan detekteres en side befolkning også i osteosarcom cellelinier. Den side befolkning er defineret af Hoechst udstødelse i flowcytometri [27], [28]. Den udgør kun en lille brøkdel af hele cellepopulationen og udtrykker høje niveauer af forskellige medlemmer af ABC transporter familien, såsom ABCG2 og MDR1, som er ansvarlige for medikamentresistens [29], [30]. Som forventet, fandt vi, at den side befolkning blev foretaget af en meget lille fraktion (0,97%) af de samlede celler, og interessant, det var helt medtaget i CD133

+ delmængde.

Vores data tilsammen kan føre til tought at CD133

+ celler er cancer stamceller. Faktisk, selv om dette bør understøttes af en

in vivo

tumor xenograft, som vist i andre solide tumorer [10] – [13], [18] – [21], desværre, vi var ikke i stand til at udføre

in vivo

eksperimenter, fordi osteosarkom cellelinier ikke pode med nogen vært. Vi effektivt forsøgt at udføre

in vivo

transplantation af vores CD133 stamceller, men uden held, ligesom alle de andre forskere.

Derudover kan vi hypotesen, at den CD133

+ delmængde omfatter en mindre CD133

+ \\ ABCG2

+ \\ SP

+ population, som kunne være resistente over for lægemidler, besidder stamceller funktioner og kan drev effektivt cancer progression.

Interessant og uventet, i vores hænder, nogle celler, som ikke udtrykker CD133 markør på membranen resulterede at producere en påviselig mængde af CD133 mRNA-transkripter, og udtrykte CD133-antigen i cytoplasmiske vesikler som vist ved konfokal mikroskopi. Ikke desto mindre, CD133

+ og CD133

– sorteret befolkninger klart vise forskellige adfærd. Dette fører os til at spekulere på den funktionelle rolle CD133 i organiseringen af ​​membranen og i udvælgelsen CSCS, som følger: i) er CD133 meget involveret i sfære klyngedannelse, er det nødvendigt for ikke-klæbende cellevækst samt for celle-til -celle cross talk, som tillader celler at kommunikere og modtage stimuli, der normalt benytter adhæsionsmolekyler; ii) CD133

+ og CD133

– populationer er i løbende og gensidig udveksling og kun sande CSCS udtrykker CD133 konstant på membranen

Som konklusion, vores resultater tyder på, at CD133 markør kan være nyttigt at. angiver den differentierede /udifferentieret tilstand af osteosarkom tumorer og dette kan føre til nye tilgange for at designe en mere specifik behandling og forbedre prognosen.

Materialer og metoder

Cell kultur

SaOS2, MG63 og U2OS blev købt fra ATCC CELL BANK; celler blev anbragt i α-MEM dyrkningsmedium suppleret med 15% FCS, 100 uM 2P-ascorbinsyre, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (alle købt fra Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milano, Italien) og anbragt i 75 ml kolber med filtreret ventiler. Kolber blev inkuberet ved 37 ° C i en CO 5%

2 og mediet skiftet to gange om ugen. Efter konfluens blev cellerne opdelt i nye kolber indtil slutningen af ​​eksperimentet.

flowcytometri og cellesortering

Celler blev frigjort under anvendelse af 0,02% EDTA i phosphatpufret saltvand (PBS), tælles og vasket i 0,1% BSA i PBS. Mindst 500.000 celler (i 100 pi PBS /0,5% BSA) blev inkuberet med fluorescensmærkede monoklonale antistoffer eller respektive isotypekontroller (1/10 fortyndet 4 ° C i 30 minutter i mørke). Efter vasketrin blev de mærkede celler analyseret ved flowcytometri hjælp af en FACS Vantage cellesorterer (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). De anvendte antistoffer var muse-anti-human CD133 /2 PE konjugeret (Miltenyi Biotec Srl Calderara di Reno, Bologna, Italien), muse-anti-human CD133 PE konjugeret (eBioscience), muse-anti-humant CD29 CY konjugeret (BD Pharmingen, Buccinasco, Milano, Italien), muse-anti-humant CD34 PE konjugeret (Miltenyi Biotec), muse-anti-humant CD44 FITC konjugeret (Miltenyi Biotec), muse-anti-humant CD90 FITC konjugeret (BD Pharmingen), muse-anti-humant OCT3 /4 non konjugeret (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Californien, USA), muse-anti-humant Ki67 FITC konjugeret (Miltenyi Biotec) og muse-anti-humant ABCG2 non konjugeret (Santa Cruz). CD133

+ -celler blev sorteret til eksperimenter. CD133

– celler blev høstet som kontrol. Renheden af ​​sorterede populationer var rutinemæssigt 90%. Isotyper blev brugt som kontrol

Syv dage efter sortering, CD133

-. Celler blev afmonteret og testet to gange for CD133-ekspression. OCT3 /4-ekspression analyseret på 6

th celle passage (en “passage” angiver, at cellerne er fritliggende når ved sammenløbet), mens CD133 ekspressionen blev analyseret ved 4

th og 6

th celle passage på sarcopheres afledt fra CD133

+ celler i de tre cellelinjer

for intracellulær farvning af Ki67, CD133 og OCT3 /4, blev cellerne behandlet ved hjælp af Caltag Fix Perm Kit (Invitrogen, Milano, Italien) i overensstemmelse med producentens retningslinier. Alle data blev analyseret ved anvendelse af en CellQuest software.

Hoechst 33342 Udelukkelse Assay

SaOS2, MG63 og U2OS celler blev resuspenderet ved 2,0 x 10

6 celler /ml i forvarmet α- MEM dyrkningsmedium og deles i to portioner. En portion blev behandlet med 50 pM verapamil og den anden blev efterladt ubehandlet. Begge portioner blev inkuberet i α-MEM dyrkningsmedium med 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma, Milano, Italien) i 90 minutter ved 37 ° C. Efter inkubation blev cellerne vasket i PBS og holdt på is i 5 minutter, og analyseret for Hoechst 33342 efflux ved FACS udsigtspunkt (Becton Dickinson, Milano, Italien) [31]. Den Hoechst 33342 farvestof var ophidset ved 350 nm ultraviolet og resulterende fluorescens blev målt ved to bølgelængder ved hjælp af en 424/44 BP og 675 LP filtre til påvisning af Hoechst blå og røde henholdsvis.

Cell Cycle og proliferation Analyser

Cell cyklus blev analyseret ved flowcytometri. Celler blev høstet i PBS indeholdende 2 mM EDTA, vasket en gang med PBS, fikseret i iced ethanol 70 ° og inkuberet med 50 ug /ml PI (Sigma) plus Rnasi 1 mg /ml i 60 minutter ved 4 ° C i mørke. Farvede kerner blev analyseret med en FACS Vantage cellesorterer (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)., Og dataene analyseres ved hjælp af en Mod-Fit 2.0 cellecyklus analyseprogram (Becton-Dickinson)

vækstanalyse

efter sortering af CD133, SaOS2, MG-63 og U2OS celler blev udpladet med en tæthed på 8,0 x 10

4 celler /brønd i 6-brønds plader. Hver tolvte time celler blev høstet og resuspenderet i PBS. En portion af cellesuspensionen blev fortyndet med 0,4% trypanblåt (Sigma-Aldrich), pipetteres på et hæmocytometer og talt under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. Levende celler udelukkede farvestoffet, mens døde celler optaget farvestoffet og dermed farves intenst med trypanblåt. Antallet af levedygtige celler for hver eksperimentel betingelse blev talt og repræsenteret på en lineær graf. Fordoblingstiden (DT) blev bestemt ud fra vækstkurverne eller ved anvendelse af formlen: hvor t og t

0 var de tidspunkter, hvor cellerne blev talt, og N og N

0 var celletal til tider t og t

0, henholdsvis [32].

Soft Agar Assay

for at analysere de forskellige tumorigent potentiale i to celle fraktioner, CD133

+ og CD133

– celler blev udpladet i blød agar med en tæthed på 100, 500 eller 1000 celler /brønd i plader med 24 brønde i tre eksemplarer. Colo 38 melanoma cellelinien blev anvendt som positiv kontrol.

I basislaget, blev 2,4% agar stamopløsning smeltes i en mikrobølgeovn, afkølet til 40 C i et vandbad og blandes derefter med kulturmedium for at opnå en opløsning af 0,8% agar i α-MEM. 0,5 ml /brønd af denne opløsning blev tilsat til plader med 24 brønde. For det øverste lag, blev agaren stamopløsning fortyndet med dyrkningsmedium til opnåelse af en opløsning af 0,3% agar i α-MEM. 0,5 ml /brønd af opløsningen blev forsigtigt blandet og opdelt i alikvoter i 24-brønds plader. CD133

+, CD133

– og wilde typen SAOS-2, blev MG63 og U2OS celler successivt udpladet og inkuberet i 21 dage ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 i luft og 50 pi α-MEM . Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev kolonier farvet med 150 pi /brønd af NBT (nitrobluetetraziolium) i en koncentration på 1 mg /2 ml i PBS og talt under anvendelse af et omvendt mikroskop (Nikon TS 100, Nikon, Milano, Italien) .

immunfluorescensfarvning

CD133

+ og CD133

– celler dyrket i plader med 24 brønde blev fikseret med en opløsning af 4% paraformaldehyd /0,2% Triton i PBS i 30 min ved 4 ° C, vasket i PBS, behandlet med PBS /5% mælk i 60 minutter ved stuetemperatur og derefter farvet med primære antistoffer ved 4 ° C natten over. De primære antistoffer blev anvendt, var muse-anti-humant CD133 /2 PE konjugeret (Miltenyi Biotec), muse-anti-humant Phalloidin FITC konjugeret (AlexaFluor-Invitrogen) inkuberet i 60 minutter ved 4 ° C. Kernerne blev farvet med DAPI. Celler blev derefter vasket to gange som beskrevet ovenfor og observeret under fluorescensmikroskop (Nikon TE 2000 S, Milano, Italien). Isotyper og ikke-probet celler blev anvendt som kontroller.

Sphere assays Salg

Celler blev udpladet ved en densitet på 60.000 celler /brønd i 6-brønds ultra lave montagepladerne (Corning Inc., Corning , NY, USA) i DMEM /F12 cellemedium, suppleret med 1% methylcellulose, progesteron (10 nM), putrescin (50 uM), natriumselenit (15 nM), transferrin (13 ug /ml), insulin (10 pg /ml; Sigma) og human EGF (10 ng /ml) og human bFGF (10 ng /ml; Sigma) [13]. Friske prøver af EGF og bFGF blev tilsat hver anden dag. Efter dyrkning i 48-72 timer, kugler var synlige ved omvendt fase-kontrast mikroskop (Nikon TS 100, Nikon).

Laser-scanning konfokalmikroskopi

Celler dyrket i 24 brønds plader blev fastsat med 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved 4 ° C, vasket i PBS, behandlet med PBS /5% mælk i 60 minutter ved stuetemperatur og derefter inkuberet med primære antistoffer ved 4 ° C natten over. Det primære antistof var et muse-anti-humant CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec); det sekundære antistof (gede-anti-muse FITC eller PE-konjugeret ABCAM) blev inkuberet i 60 minutter ved 4 ° C, og DAPI, anvendt til at farve kernen blev inkuberet i 7 minutter ved stuetemperatur. Den samme procedure blev udført på sarcospheres. Alle mærkede celler blev opbevaret ved 4 ° C før købet billeder, anvendelse af et Zeiss laser-konfokalt LSM 510 Meta (Zeiss- Oberkocken-Tyskland). Billeder blev taget til fange med en opløsning på 512 × 512 pixels. Den passende argon laser fluorescens til visualisering af CD133 blev brugt med en excitationsbølgelængde på 488 nm og emission filter BP 505-530.

Immunhistokemi

Immunoistochemistry for CD133 på SaOS2, MG63 og U2OS celler blev udført. Celler blev udpladet ved en densitet på 50.000 celler /brønd i pladerne med 24 brønde, fikseret med 3,5% paraformaldehyd i 10 minutter ved 4 ° C, og vasket i PBS. Anvendte primære antistof var muse-anti-humant CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec). For sekundært antistof og farvning blev DAKO Cytomation En Vision + System-HRP kit (AEC) anvendt ifølge producentens anvisninger. Kernerne blev farvet med hæmatoxylin og cellerne blev observeret under et omvendt lysmikroskop. Denne procedure blev også udført på sarcospheres.

RT-real time PCR

Sekvenser for mRNA’er fra nukleotid databank (National Center for Biotechnology Information, USA) blev anvendt til at designe primer par for RT -PCR-reaktioner (Primer Express, Applied Biosystems, CA, USA). Primer sekvenser er tilgængelige på anmodning. Passende områder af HPRT (hypoxanthin-guanin phosphoribosyltransferase) cDNA blev anvendt som kontroller.