PLoS ONE: GMP-kompatibel, storskalaforsøg Udvidet Allogen naturlige dræberceller Har Potent cytolytisk aktivitet mod kræftceller i vitro og in vivo

Abstrakt

Ex vivo

-expanded kan allogene naturlige dræberceller (NK-celler) anvendes til behandling af forskellige former for kræft. I allogen NK celleterapi, skal NK celler fra raske donorer udvides for at opnå et tilstrækkeligt antal højt oprensede, aktiverede NK-celler. I den foreliggende undersøgelse, vi etableret en forenklet og effektiv metode til storstilet udvidelse og aktivering af NK-celler fra raske donorer under god fremstillingspraksis (GMP) betingelser. Efter et enkelt trin af magnetisk depletering af CD3

+ T-celler blev de udtømte mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) stimuleret og udvidet med bestrålede autologe PBMC’er i nærvær af OKT3 og IL-2 i 14 dage, hvilket resulterer i en meget ren population af CD3

-CD16

+ CD56

+ NK celler, som er ønsket til allogen formål. Sammenlignet med frisk isolerede NK-celler, disse ekspanderede NK-celler viste robust cytokinproduktion og potent cytolytisk aktivitet mod forskellige cancercellelinier. Notatet udvidede NK-celler selektivt dræbt kræftceller uden at påvise cytotoksicitet mod allogene ikke-tumorceller i cokultur analyser. Anti-tumor aktivitet af ekspanderede humane NK-celler blev undersøgt i SCID-mus injiceret med humane lymfomceller. I denne model, ekspanderede NK-celler effektivt kontrolleret lymfom progression. Afslutningsvis blev der allogene NK-celler effektivt udvidet i et GMP-kompatibelt anlæg og demonstrerede potent anti-tumor aktivitet både

in vitro

in vivo

Henvisning:. Lim O, Lee Y, Chung H, Hendes JH, Kang SM, Jung Min, et al. (2013) GMP-kompatibel, storskalaforsøg Udvidet Allogen naturlige dræberceller Har Potent cytolytisk aktivitet mod Cancer Cells

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 8 (1): e53611. doi: 10,1371 /journal.pone.0053611

Redaktør: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxembourg

Modtaget: 3. september 2012; Accepteret: November 29, 2012; Udgivet: 11 Jan 2013

Copyright: © 2013 Lim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling på Korea Healthcare teknologi R D Project, Ministeriet for sundhed, velfærd Familiestyrelsen, Republikken Korea (A062260). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Eui-Cheol Shin er en PLoS ONE Editorial Board medlem, og forstår, at dette gør ikke ændre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: MJ og HS er ansat i Green Cross LabCell Corp. Mogam Biotechnology Research Institute er en non-profit forskning fundament. Patent Nummer: KR2008-74069. Dato Patent Udgivet: 28. marts 2012. titel Patent: Vækst metode til naturlige dræberceller. Rettighedserhverver: Green Cross LabCell Corp og Seoul National University Hospital. Opfinder: Mi-unge Jung, Dae Seog Heo, og Yu Kyeong Hwang. Patent Nummer: JP2011-521023. Dato Patent Gemt: 31. januar 2011. titel Patent: Vækst metode til naturlige dræberceller. Rettighedserhverver: Green Cross LabCell Corp og Seoul National University Hospital. Opfinder: Mi-unge Jung, Dae Seog Heo, og Yu Kyeong Hwang. Patent nummer: CN200980130121.5. Dato Patent Gemt: 30. januar 2011. titel Patent: Vækst metode til naturlige dræberceller. Rettighedserhverver: Green Cross LabCell Corp og Seoul National University Hospital. Opfinder: Mi-unge Jung, Dae Seog Heo, og Yu Kyeong Hwang. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. De andre forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Introduktion

Naturlig killer (NK) celler er specialiserede lymfocytter, der giver en første linje i forsvaret mod virusinfektioner og kræft [1]. NK-celleaktivitet er reguleret af signaler i at aktivere og inhibitoriske receptorer [2]. NK aktiverende signal medieres af adskillige NK receptorer, herunder NKG2D og naturlige cytotoksiske receptorer (NCRs) [2], [3]. I modsætning hertil er NK inhibering tillagt ved killer celle immunoglobulinlignende receptorer (KIR’er), der binder til MHC klasse I molekyler på målceller [2], [4]. MHC klasse I-ekspression en tendens til at gå tabt eller nedreguleret i cancerceller [5] og som følge heraf er den NK inhiberende signal ophævet, således NK-celler til at blive aktiveret og dræbe maligne mål.

nylig, antitumoraktiviteten af ​​NK-celler er blevet påvist i fastsættelsen af ​​allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) [6]. I T-celle-depleteret HSCT, donor NK-celler er de store effektorceller ansvarlige for at kontrollere tilbageværende kræftceller [7]. Den graft-versus-tumor (GVT) aktivitet af donor NK-celler er væsentligt forbedret, når KIR’er og MHC klasse I er uforeneligt mellem donor og modtager, som inhibitoriske signaler er fraværende [8], [9]. Derfor øget GVT aktivitet af NK-celler med KIR-MHC uforenelighed er det underliggende rationale for udvikling af allogen NK celleterapi.

I allogen NK celleterapi, NK-celler fra raske donorer er udarbejdet af

ex vivo

ekspansion og aktivering, og derefter gives til kræftpatienter [10]. Allogene NK celler fra raske donorer er overlegen i forhold til autologe NK-celler fra cancerpatienter, som bliver funktionelt svækkede under tumorprogression [11], [12]. Derudover er anti-tumor effekt af allogene NK-celler øges gennem donor-recipient uforenelighed mellem KIR’er og MHC klasse I-ligander [13].

For at tillade terapeutisk anvendelse af allogene NK-celler i det kliniske miljø skal opnås et tilstrækkeligt antal højt beriget NK-celler. Der er rapporteret forskellige fremgangsmåder til

ex vivo

NK-celle ekspansion med klinisk kvalitet [14]. Selvom NK-celler differentieret fra navlestrengsblod [15] eller NK-92-celler [16], er blevet anvendt til terapi, er mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) opsamlet fra fuldblod eller leukapherese anvendes som almindelige kilder til NK-celler [17], [18]. På grund af den fordel, aseptisk samling i et lukket system, har PBMC samling ved leukaferese været almindeligt anvendt til god fremstillingspraksis (GMP) -kompatibelt udvidelse af NK-celler [14]. Den generelle ekspansionsprocessen til allogen anvendelse starter med to sekventielle trin magnetisk depletering af CD3

+ T-celler og berigelse af CD56

+ NK celler [19] – [21]. For at stimulere NK-celleproliferation, bestrålede fødeceller, såsom PBMC’er [19], Epstein-Barr-virus-transformerede lymfoblastoide cellelinier (EBV-LCLS) [20] eller manipulerede leukæmiske cellelinier [21] ofte anvendes. Bestrålede feederceller stimulere NK-celler via både humorale faktorer og direkte celle-til-celle-kontakt [22].

I den foreliggende undersøgelse har vi etableret en forenklet og effektiv fremgangsmåde til storstilet udvidelse og aktivering af NK celler fra raske frivillige under GMP forhold. Efter et enkelt trin af magnetisk depletering af CD3

+ T-celler blev de udtømte PBMC’er stimuleret og ekspanderet med bestrålede autologe PBMC’er i nærvær af OKT3 og IL-2 i 14 dage, hvilket resulterede i en meget ren population af CD3

-CD16

+ CD56

+ NK celler, som er ønsket til allogen formål. Disse celler viste potent cytotoksicitet mod tumorceller

in vitro

, mens besparende allogene ikke-tumorceller. De effektivt kontrolleret tumorprogression i en SCID-musemodel af human lymfom. Tilsammen blev allogene NK-celler effektivt udvidet i et GMP-kompatibelt anlæg og demonstrerede potent anti-tumor aktivitet både

in vitro

og

in vivo

.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Forsøgsmedarbejderne prøver blev opnået efter erhvervelsen af ​​undersøgelsens deltagere skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. Denne forskning protokol blev gennemgået og godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for Seoul National University Hospital (Permit nummer: H-1004-027-315).

NK celleforarbejdningsprocesser og ekspansion

PBMC’er blev isoleret fra raske donorer ved leukaferese. CD3

+ T-celler blev depleteret ved VarioMACS (Miltenyi Biotec, Tyskland). T-celle-depleterede PBMC’er blev ekspanderet ved en podning koncentration på 2 × 10

5 celler /ml i Cellgro SCGM serum-frit medium (CellGenix, Tyskland) med 1% auto-plasma, 1 × 10

6 celler /ml bestrålede (2.000 rad) autologe PBMC’er, 10 ng /mL anti-CD3 monoklonale antistof OKT3 (Orthoclon, Schweiz) og 500 IU /ml IL-2 (Proleukin, Schweiz) i en a-350N kultur pose (NIPRO, Japan). OKT3 blev suppleret enkelt gang ved begyndelsen af ​​ekspansionen for at stimulere T-celle population i de bestrålede fødeceller. NK-celler blev fodret frisk medium med 500 IU /ml IL-2 hver to dage uden fjernelse af forud eksisterende dyrkningsmedium for at opretholde cellulær koncentration på 1~2 × 10

6 celler /ml i 14 dage. Levedygtigheden af ​​ekspanderede NK-celler blev vurderet ved farvning af propidiumiodid. NK-celle ekspansion blev udført under betingelserne for GMP på Green Cross LabCell Corp. (Korea).

Humane cellelinjer

K562, Jurkat, SW480, Ramos og Raji celler blev opnået fra amerikansk Type Culture Collection (ATCC). SNU398 celler blev opnået fra koreansk cellelinje Bank (KCLB). Celler blev dyrket i RPMI-1640 medium (GIBCO) suppleret med 10% føtalt bovint serum (GIBCO). Alle cellelinier blev opretholdt i logaritmisk vækstfase ved 37 ° C i en fugtig atmosfære suppleret med 5% CO

2.

Immunfarvning og flowcytometrianalyse

NK-celler blev farvet med passende monoklonale antistoffer som følger: anti-CD56-PE-Cy5 (B159), anti-CD3-FITC (UCHT1), anti-NKp30-PE (P30-15), anti-NKp44-PE (P44-8.1), anti- NKp46-PE (9E2 /NKp46), anti-dNAM-1-PE (DX11), anti-CD25-PE (M-A251), anti-CD158b-FITC (CH-L) (alle fra BD Biosciences), anti- NKG2A-PE (131.411), anti-NKG2C-PE (134.591), anti-NKG2D-PE (149.810), anti-CD69-PE (298.614) (alle fra R BD Biosciences) eller anti-TNF-α-PE-Cy7 (Mab11 ; eBioscience). Prøver blev erhvervet på en BD FACS Canto II eller LSR Fortessa og data blev analyseret ved hjælp FlowJo software (TreeStar Inc., OR).

51Cr-release cytotoksicitet assay

En standard 4 h

51Cr-frigivelse cytotoksicitet assay blev udført. Målceller blev mærket med 100 uCi

51Cr natriumchromat (BMS), og inkuberet med NK-celler ved tre forskellige E:T forhold i U-bundede plader med 96 brønde (Nunc, Danmark). Spontan frigivelse og maksimal frigivelse blev bestemt ved at inkubere målceller uden effektorer i medium alene eller i 4% Triton X-100, hhv. Assayet blev udført tre gange. Radioaktivitet blev talt i en gammatæller, og procentdelen af ​​specifik lysis blev bestemt ifølge formlen:% specifik lyse = [(gennemsnitlig eksperimentel cpm release-middel spontan cpm frigivelse) /(gennemsnitlig maksimal cpm release-middel spontan cpm frigivelse)] × 100. Til blokering eksperimenter, var NK-celler præinkuberet med 10 ug /ml anti-muse IgG1ĸ (MOPC-21; BD Biosciences), 10 ug /ml anti-dNAM-1 (DX11; BD Biosciences), 2 ug /ml anti- NKG2D (149.810; R BioLegend) i 30 minutter ved 4 ° C, og

51Cr-release assay blev udført mod SW480 og SNU398 på E:T forholdet 10:01. Inhibering af drab blev beregnet som en procentdel af inhibering med den isotypekontrolantistof.

Flowcytometrisk cytotoksicitet assay

Cytotoksicitet af ekspanderede NK celler mod allogene PBMC’er blev vurderet ved flowcytometrisk cytotoksicitet assay. K562 tumormålceller blev mærket med 100 nM calcein-AM (Molecular Probes, Eugene, OR), og allogene eller autologe PBMC målceller blev mærket med anti-HLA-klasse I. Udvidet NK-celler, mærket K562 målceller, og mærket PBMC målcellerne blev samdyrket i forholdet 03:01:01 i 2 timer. Døde celler blev farvet med 7-AAD (BD Biosciences). Procentdelen af ​​specifik lysis blev bestemt ifølge formlen:% specifik lyse = (gennemsnitlig% af 7-AAD

+ -celler i brønde med NK cokultur) – (gennemsnitlig% af 7-AAD

+ farvede celler i brønde med målet kun)

In vivo

studie i SCID-mus

CB-17-Prkdc

SCID mus (Animal Resources Centre, Australien) blev anvendt ved 7 uger af alder. SCID-mus blev huset i microisolator bure, og alle de fødevarer, vand og strøelse blev autoklaveret før anvendelse. Ekspanderede NK-celler blev mærket med 5 uM CFSE (Sigma), og 2 × 10

7 i CFSE-mærkede celler blev intravenøst ​​injiceret i hver mus. Mus blev aflivet efter 2, 24, 48, 72 og 168 timer under generel anæstesi. Enkeltcellesuspensioner blev fremstillet ud fra større organer såsom lunger, milt, perifert blod, lever, lymfeknuder, knoglemarv, nyrer, æggestokke, testikler og hjerne. Procentdelen af ​​CFSE

+ -celler blev analyseret i lymphogating ved flowcytometrisk analyse af de enkelte cellesuspensioner fra serielle prøver. Til evaluering antitumoreffektivitet af ekspanderede NK-celler, CB-17-Prkdc

SCID-mus blev injiceret intravenøst ​​i halevenen med 1 x 10

5 Raji-celler og 1 x 10

7 ekspanderede NK-celler i 400 pi PBS på dag 0. Tre yderligere doser af udvidede NK-celler (1 x 10

7cells /mus) blev administreret inden for ni dage. Det monoklonale anti-CD20-antistof, rituximab (0,01 ug /mus) blev injiceret subkutant på tidspunktet for den første indgivelse af ekspanderede NK-celler. Individuelle mus blev overvåget dagligt for tumorassocieret sygelighed og dødelighed. Især blev den unormale positur bagbenene følge af en manglende evne til at udvide bagbenene noteret. Når mus viste tegn på tumor-associerede sygelighed såsom overdreven vægttab, sløvhed og /eller angst, blev de aflivet efter institutionelle retningslinier for dyr pleje. Generel anæstesi blev induceret ved en intramuskulær injektion af 100 mg /kg ketamin (Yuhan, Korea) og 12,5 mg /kg xylazin (Rompun, Bayer). Animal boliger, håndtering, og alle procedurer, der involverer mus blev godkendt af den institutionelle udvalg af Mogam Biotechnology Research Institute (Permit nummer: MG-10-111A), og alle forsøg blev udført i overensstemmelse med den nationale retningslinje vedrørende pasning af dyr i Korea

Statistisk analyse

uparret t-test blev anvendt til at sammenligne cytotoksicitet og cytokinsekretion af NK-celler før og efter ekspansion. Den parrede t-test blev anvendt til sammenligning overflademarkør ekspression af NK-celler før og efter ekspansion. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism software (GraphPad Software Inc., CA).

Resultater

Karakteristik af store, GMP-udvidet NK-celler

I den nuværende undersøgelse, vi effektivt udvidet NK celler fra raske donorer ved dyrkning T-celle-depleterede PBMC’er og bestrålede autologe PBMC’er i nærvær af IL-2 og OKT3 i 14 dage i et GMP-kompatibel facilitet. På dag 14 blev produkterne, kaldet MG4101, der består af højt beriget CD3

-CD56

+ (98,10 ± 0,88%) eller CD56

+ CD16

+ (97,43 ± 1,66%) NK-celler med minimal forurening med CD3

+ T-celler (0,06 ± 0,14%), CD14

+ monocytter (0,09 ± 0,14%) eller CD19

+ B-celler (0,04 ± 0,07%) (fig. 1A-B ). Under dyrkning blev NK-celler ekspanderet 691,4 ± 170,2 fold (fig. 1C) med 95,2 ± 1,9% levedygtighed (Fig. 1D). I cytotoksicitetsassays mod forskellige tumorceller, ekspanderede NK-celler udøvede stigende cytolytisk aktivitet sammenlignet med frisk isolerede NK-celler (fig. 1E). Den potente aktivitet af ekspanderede NK-celler blev også demonstreret ved degranulering markør CD107a, og ved sekretion af IFN-γ og TNF-α ved cokultur med K562-celler (fig. 1F).

(A-B) T- celle reducerede PBMC’er blev ekspanderet under GMP betingelser beskrevet i Materialer og Metoder. Den procent af CD3

-CD56

+, CD56

+ CD16

+, CD3

+, CD14

+ og CD19

+ celler blev analyseret ved flowcytometriske analyser ( B, n = 8). Repræsentative FACS dot plots præsenteres (A). (C) Den fold ekspansion af NK-celler blev bestemt før (D0) og efter (D14) NK-celle ekspansion (n = 8). (D) Levedygtigheden af ​​ekspanderede NK-celler blev vurderet ved farvning af propidiumiodid. (E) Cytotoksicitet af NK-celler mod forskellige tumorceller blev sammenlignet før (D0) og efter (D14) NK-celle ekspansion (n = 4). Den effector:target forholdet var 10:01. (F) NK-celler blev dyrket sammen med K562-celler ved 1:01 ratio for 4 timer, og farvning for intracellulære cytokiner (IFN-y og TNF-a) og CD107a blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene blev sammenlignet før (D0) og efter (D14) ekspansion. Middelværdi og SD er vist. *

s

0,05; **

s

0,01; ***

s

. 0,001

Angivelse af NK celle receptorer i stor skala, GMP-udvidede NK-celler

Surface udtryk for aktivering eller hæmmende NK-receptorer blev analyseret før og efter større udvidelse. Blandt aktiverende receptorer, NKG2C, NKp30 og NKp44 steg betydeligt i ekspansionen mens NKG2D, NKp46 og dNAM-1 ikke gjorde (fig. 2A). Ekspression af hæmmende receptorer, NKG2A og KIR stort set uændret på kultur, mens andelen af ​​CD158a

+ b

+ e

+, CD158a

+ e

+ og CD158b

+ e

+ NK celler blev reduceret (fig. 2B). Aktiveringsstatus af NK-celler blev vurderet ved farvning for CD25, CD62L og CD69, som alle blev fundet at forøges på overfladen af ​​ekspanderede NK-celler (fig. 2C). Ekspression af kemokinreceptorer såsom CXCR3 og CXCR4 blev også evalueret. Hyppigheden af ​​CXCR4

+ NK celler blev øget betydeligt i NK-celle ekspansion mens hyppigheden af ​​CXCR3

+ NK-celler blev ikke ændret (fig. 2D).

Surface udtryk for at aktivere receptorer (A ), inhibitoriske receptorer (B), aktiveringsmarkører (C) og chemokinreceptorer (D) blev analyseret ved flowcytometri før (D0) og efter (D14) NK-celle ekspansion (n = 10~12). Individuel eller coekspression af KIR’er (CD158a, CD158b eller CD158e) blev beregnet ved booleske porte ved hjælp FlowJo software (B). *

s

0,05; **

s

0,01; ***

s

. 0,001

cytotoksisk aktivitet mod forskellige tumorcellelinjer

Dernæst den cytotoksiske aktivitet af den udvidede NK-celle population blev evalueret. Forskellige tumorcellelinier viste forskellige niveauer af modtagelighed for ekspanderede NK-celler (fig. 3A). For at forstå dette varierede modtagelighed blev ekspressionen af ​​ligander for NK-receptorer analyseret på tumorcellelinjer. Af dem analyseret for ekspressionen, de mest relevante ligander var HLA klasse I, NKG2D ligander; ULBP-1, ULBP-2 og MIC-A /B og dNAM-1-ligander; CD112 (nectin-2) og CD155 (Necl5). De mest modtagelige cellelinie, K562, udtrykt NKG2D ligander, men ikke KIR ligand, HLA klasse I (fig. 3B). Jurkat, SW480 og SNU398 celler udtrykte ikke kun NKG2D ligander, men også HLA klasse I, og var moderat modtagelige for ekspanderede NK-celler. NK-sensitive målceller (K562, Jurkat, SW480 og SNU398) har tendens til at over-express CD112 og CD155 forhold til NK-resistente målceller (Ramos, Raji og PBMC’er). Af note, havde NK-celler ikke dræbe allogene PBMC’er, som udtrykte HLA klasse I uden NKG2D og dNAM-1-ligander (fig. 3A og B).

(A) Cytotoksicitet af ekspanderede NK-celler mod forskellige tumorcellelinier blev analyseret ved

51Cr-frigivelsesassay med den angivne effector:target (E:T) forhold i tre eksemplarer. blev også analyseret cytotoksicitet over normale PBMC’er. Assayet blev udført to gange med ekspanderede NK-celler fra forskellige donorer, og repræsentative data blev præsenteret. Hver graf repræsenterer middelværdi ± SD. (B) Ekspression af HLA-klasse I, ULBP-1, ULBP-2, MIC-A /B, blev CD112 og CD155 analyseret ved flowcytometri i forskellige tumorcellelinjer og normale PBMC’er (fuldt optrukne linier). Grå histogrammer repræsenterer isotypekontroller. (C) Udvidet NK-celler blev præinkuberet med blokerende antistoffer til dNAM-1, NKG2D, NKp30 og /eller NKp44, og cytotoksicitet blev analyseret mod SW480 eller SNU398 celler ved

51Cr-frigivelsesassay i tre eksemplarer. E:T forholdet var 10:01. Procent inhibering af cytotoksicitet blev beregnet som en procentdel af inhibering med den isotypekontrolantistof. Assayet blev udført to gange med ekspanderede NK-celler fra forskellige donorer, og repræsentative data præsenteres. Hver søjlediagram repræsenterer middelværdien + SD.

For at vurdere rollen af ​​aktiverende NK-receptorer, blev en cytotoksicitet assay med ekspanderede NK-celler udføres i nærvær af blokerende antistoffer specifikke for NKG2D, dNAM-1, NKp30 og NKp44. Mens blokere en enkelt receptor alene svagt påvirket cytotoksicitet, blokering af flere receptorer førte til en væsentlig reduktion i cytotoksicitet. Især blokering af alle fire receptorer inhiberede cytotoksicitet ved mere end 85% (fig. 3C). Således er cytotoksiciteten af ​​ekspanderet NK-celle population synergistisk forøget ved samtidig aktivering gennem flere aktiverende NK-receptorer.

Fravær af cytotoksisk aktivitet mod allogene ikke-tumorceller

Klinisk anvendelse af ekspanderede NK-celler fra ubeslægtede raske donorer kan resultere i toksicitet, der skyldes cytotoksiske aktivitet mod allogene utransformerede recipientceller. At evaluere potentialet for cytotoksicitet mod normale recipientceller, blev ekspanderet NK-celler dyrket sammen samtidigt med K562 tumorceller og normale allogene PBMC’er, og cytotoksicitet over hver respektive mål blev evalueret. Cytotoksicitet over de allogene PBMC’er blev fundet at være ubetydelig (0,43 ± 0,27%) (fig. 4A) og sammenlignes med den cytotoksicitet mod de autologe PBMC’er (0,40 ± 0,40%) (fig. 4B). Denne minimale cytotoksicitet blev ikke påvirket af tilstedeværelsen eller fraværet af K562-tumorceller. I mellemtiden, ekspanderede NK-celler effektivt dræbt K562 tumorceller uanset tilstedeværelsen af ​​allogene eller autologe PBMC’er (fig. 4A-B). Derfor ekspanderede NK-celler effektivt diskrimineret tumorceller fra allogene normale PBMC’er og selektivt dræbte transformerede celler. Tumor-specifikke cytotoksicitet uden at dræbe af allogene ikke-tumorceller muligt for os at anvende de ekspanderede NK-celler fra ubeslægtede, raske donorer i en allogen indstilling.

Selektiv cytotoksicitet af ekspanderede NK celler mod blandede mål for normale PBMC’er og K562-celler blev analyseret ved flowcytometrisk cytotoksicitet assay som beskrevet i Materialer og Metoder. K562 tumormålceller blev mærket med calcein-AM, og enten allogen (A) eller autologe (B) PBMC-målceller blev mærket med anti-HLA-klasse I. De ekspanderede NK-celler, de mærkede K562 målceller, og det mærkede PBMC målcellerne blev samdyrket i forholdet 03:01:01 i 2 timer. Døde celler blev farvet med 7-AAD, og ​​den procentvise specifikke lyse blev beregnet. Cytotoksicitet mod PBMC’er (til venstre for hvert panel) og K562-celler (ret af hvert panel) præsenteres separat. Assayet blev udført i duplikeret. Hver søjlediagram repræsenterer middelværdien + SD.

In vivo

anti-tumor aktivitet udvidede NK-celler i SCID-mus

For

in vivo

undersøgelse af udvidede NK-celler, vi administrerede CFSE-mærket, udvidet humane NK-celler til SCID-mus og overvåget kinetik deres distribution. Mærkede NK-celler først dukkede op i lungerne, hvor de opholdt i 48 timer, derefter gradvist forsvundet (fig. 5A). I milten, perifert blod og lever, frekvensen af ​​de administrerede NK-celler toppede ved 48 timer og derefter gradvist faldt (fig. 5A). I knoglemarven, lymfeknuder, hjerne, nyrer, æggestokke og testikler, det infunderede CFSE

+ NK celler blev minimalt påvist (≤1.1%) (tabel S1). Alle NK-indgivne mus forekom sunde svarende til kontrolgruppen i løbet af undersøgelsen.

(A) CFSE-mærkede NK-celler (2 x 10

7 celler /mus) blev intravenøst ​​injiceret i SCID-mus. Mus blev aflivet efter 2, 24, 48, 72 og 168 timer, og procentdelen af ​​CFSE

+ celler i lungerne, blev milt, perifert blod og lever analyseret i lymphogating ved flowcytometri (n = 4). Hver graf repræsenterer gennemsnit ± SEM. (B-C) SCID-mus blev injiceret intravenøst ​​i halevenen med 1 x 10

5 Raji-celler og 1 x 10

7 ekspanderet NK-celler i 400 pi PBS på dag 0 (n = 10 /gruppe) . Tre yderligere doser af udvidede NK-celler (1 x 10

7cells /mus) blev administreret inden for ni dage. Det monoklonale anti-CD20-antistof, rituximab (0,01 ug /mus) blev injiceret subkutant på tidspunktet for den første indgivelse af ekspanderede NK-celler. Tumorassocieret lammelse (B) og overlevelse (C) blev overvåget. Effekten test blev bekræftet ved ekstra sæt eksperiment med 10 mus per hver gruppe, og repræsentanten sæt af data præsenteres.

Dernæst anti-tumor aktivitet udvidede NK-celler blev undersøgt i SCID-mus intravenøst ​​injiceret med humane Raji B-celle lymfomceller. Morbiditet blev evalueret ved bagben paralyse, som Raji celler har rygmarv tropisme, og dødelighed blev vurderet. Administration af ekspanderede humane NK-celler betydeligt ophævet tumorudvikling, målt som reduceret sygelighed (fig. 5B) og mortalitet (fig. 5C). Effekten af ​​ekspanderede humane NK-celler blev yderligere forstærket af samtidig administration af lavdosis rituximab (0,01 ug /mus), mens den samme dosis af rituximab uden NK-celler ikke blev bedre udfald sygdom. Denne dosis af rituximab anses for at være ekstremt lavt og kan sammenlignes med 1 /25.000 af den regelmæssige dosis hos mennesker [29]. Sammenfattende udvidede NK-celler påvistes

in vivo

anti-tumor-aktivitet i en murin tumormodel, og tilsætningen af ​​tumor-specifikt antistof signifikant forøget deres effektivitet, formodentlig ved at udløse antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC).

diskussion

Cancer immunterapi har brugt flere typer af immunceller, herunder dendritiske celler (DC’er), cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er), lymfokin-aktiverede dræber (LAK) -celler, cytokin-induceret killer (CIK) -celler og NK-celler [23] – [26]. Selv om der har været de seneste fremskridt inden DC terapi og CTL terapi, er den kliniske anvendelse noget begrænset, da kræft-antigener først skal karakteriseres [23], [24]. I modsætning hertil LAK-celler, CIK-celler og NK-celler har antigen-uafhængig cytolytisk aktivitet mod tumorceller. Ofte er LAK celler eller CIK celler fremstillet af kræftpatienter og autologt administreres efter

ex vivo

manipulation [25], [26]. I tilfælde af NK-celler, kan både allogene og autologe NK-celler anvendes til anti-cancerterapi. Tidligere værker har vist, at allogene NK-celler kan administreres sikkert til kræftpatienter [10]. Allogen NK celleterapi er særlig fordelagtig, da det øger anti-cancer effekt af NK-celler via induktion af donor-recipient inkompatibilitet mellem KIR’er på donor NK-celler og MHC klasse I-ligander på modtagerens væv [13].

i tidligere undersøgelser, forskellige metoder til

ex vivo

NK-celle ekspansion er blevet udviklet til klinisk anvendelse [14]. PBMC’er indsamlet af leukaferese ofte anvendes som en generel kilde til NK-celler, som har en fordel ved aseptisk samling i et lukket system [14]. Den generelle ekspansionsprocessen til allogen anvendelse starter med to sekventielle trin magnetisk depletering af CD3

+ T-celler og berigelse af CD56

+ NK celler [19] – [21]. I nærværende undersøgelse, der kun et enkelt trin af magnetisk udtømning af CD3

+ T-celler opfyldte produktets kvalitet i respekt for renhed og levedygtighed. På day14 blev det endelige produkt, der består af meget ren CD3

-CD56

+ NK-celler (98,10 ± 0,88%) med minimal forurening med CD3

+ T-celler (0,06 ± 0,14%), CD14

+ monocytter (0,09 ± 0,14%) eller CD19

+ B-celler (0,04 ± 0,07%). Blandt T-celle-depleterede PBMC’er blev NK-celler selektivt ekspanderet mens andre celler, såsom B-celler og monocytter blev minimalt påviselige. Hvad angår den allogene kliniske anvendelse, er T-celle depletion i slutproduktet ønskes at undgå graft-versus-host sygdom [10].

I tidligere undersøgelser blev forskellige forsøg forsøgt at stimulere NK-celleproliferation med bestrålede fødeceller såsom PBMC’er, EBV-LCLS eller manipulerede leukæmiske cellelinjer [19] – [21]. Den foreliggende fremgangsmåde omfatter bestrålede autologe PBMC’er følger med OKT3 ved begyndelsen af ​​ekspansionen. OKT3-stimulerede T-celler blandt bestrålede feeder celler kan stimulere NK-celler proliferation gennem både humorale faktorer og direkte celle-til-celle-kontakt. Yderligere undersøgelser er under undersøgelse for at klarlægge den funktionelle rolle af fødeceller.

I den foreliggende undersøgelse, ekspanderede NK-celler viste robust cytokinproduktion og potent cytolytisk aktivitet mod forskellige cancercellelinjer sammenlignet med frisk isolerede NK-celler. Disse celler overekspression NKG2C, NKp30, NKp44, og aktivering markører herunder CD25, CD62L og CD69. Notatet udvidede NK-celler selektivt dræbt kræftceller uden cytotoksicitet mod allogene ikke-tumorceller i cokultur analyser. Denne rettet cytotoksisk aktivitet af udvidede NK-celler antydede, at allogen anvendelse af udvidede NK-celler i kræftpatienter ville være sikker. Faktisk har ingen væsentlige bivirkninger blevet bemærket i et igangværende fase I studie bruger udvidede allogene NK-celler (www.clinicaltrial.gov, NCT 01.212.341).

For at overvåge kinetikken af ​​

in vivo

distribution, vi administreret CFSE-mærkede, ekspanderet humane NK-celler til SCID-mus. Mærkede NK-celler først dukkede op i lungerne, hvor de opholdt i 48 timer, derefter gradvist forsvundet (fig. 5A). I milten, perifert blod og lever, frekvensen af ​​de administrerede NK-celler toppede ved 48 timer og derefter gradvist faldt (fig. 5A). I mellemtiden har vi også undersøgt ekspressionen af ​​chemokinreceptorer såsom CXCR3 og CXCR4 på ekspanderede NK-celler.