PLoS ONE: CD44 + Cancer Stem-lignende celler i EBV-associerede nasopharyngeal Carcinoma

Abstrakt

nasofaryngealt karcinom (NPC) er en unik EBV-associeret epitelial malignitet, viser meget invasive og metastatiske fænotype. Trods stigende dokumentation den kritiske rolle cancer stamceller-lignende celler (CSCS) i vedligeholdelse og udvikling af tumorer i forskellige maligniteter, eksistensen og egenskaberne af CSC i EBV-associerede NPC er stort set ukendt. Vores undersøgelse har til formål at belyse tilstedeværelse og rolle CSCS i patogenesen af ​​denne ondartet sygdom. Sphere-dannende celler blev isoleret fra en EBV-positive NPC cellelinie C666-1 og dets tumor-initierende egenskaber blev bekræftet ved

in vitro

og

in vivo

assays. I disse sfæroider, blev fundet opregulering af multiple stamcellemarkører. Ved flowcytometri, vi demonstreret, at både CD44 og SOX2 blev overudtrykt i et flertal af kugle-dannende C666-1 celler. De CD44 + Sox2 + celler blev påvist i en mindre population i EBV-positive xenotransplantater og primære tumorer og betragtes som potentielle CSC i NPC. Især det isolerede CD44 + NPC-celler var resistente over for kemoterapeutiske midler og med højere kugleformet dannelse effektivitet, viser CSC egenskaber. På den anden side har microarray analyse viste en række differentielt udtrykte gener involveret i transskription regulering (f.eks

FOXN4

,

GLI1

), immunrespons (

CCR7

,

IL8

) og transmembrane transport (f.eks

ABCC3

,

ABCC11

) i sfæroiderne. Blandt disse gener, forøget ekspression af CCR7 i CD44 + CSCS blev bekræftet i NPC xenografter og primære tumorer. Vigtigere, blokering af CCR7 afskaffede kugle-dannende evne C666-1

in vitro

. Ekspression af CCR7 var forbundet med tilbagevendende sygdom og fjernt metastase. Den aktuelle undersøgelse defineres de specifikke egenskaber af et CSC subpopulation i EBV-associeret NPC. Vores resultater forudsat ny indsigt i udvikling af effektive behandlinger målrettet på CSCS, derved at potensere behandlingseffekt for NPC patienter

Citation:. Lun SW-M, Cheung ST, Cheung PFY, Til KF, Woo JK-S, Choy KW et al. (2012) CD44 + Cancer Stem-lignende celler i EBV-associerede nasofaryngealt karcinom. PLoS ONE 7 (12): e52426. doi: 10,1371 /journal.pone.0052426

Redaktør: David Loeb, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: 10. juli 2012; Accepteret: November 12, 2012; Udgivet: December 21, 2012 |

Copyright: © 2012 Lun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af Research Grants Råd Hongkong (GRF: Grant No. 470.321, 471.610, 471.211, 471.709, GRF: Grant Nej CUHK8 /CRF /11R; AOE /M-06/08) og Research Grant Rådet (GRF776608M; GRF777809M). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. I øjeblikket medforfattere Kwok-Wai Lo, Siu Tim Cheung, Pierre Busson og Sai Wah Tsao er medlemmer af PLoS ONE redaktionen. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Ikke-keratiniserende nasopharyngeal karcinom (NPC) er et særskilt epitelial malignitet følge af hovedet og halsområdet. Det konsekvent associerer med Epstein-Barr virus (EBV) og viser unikke klinisk og patologisk træk. Med den klonale udvidelse af en enkelt EBV-inficerede progenitorcelle, konstitutiv ekspression af virale latente gener og akkumulering af multiple genetiske ændringer bidrager til initiering og progression af denne kræft [1], [2].

NPC demonstrerer stærk geografisk præference, viser høj forekomst i Sydøstasien, især i kantonesisk region, herunder Hong Kong med en årlig incidens på 25-50 per 100.000 personer [1]. Grundpillen behandling for NPC er enten strålebehandling eller kombineret kemo-strålebehandling som viser over 90% helbredelse hos patienter med tidlig sygdom stadium [3]. Men resultatet for patienter med fremskredne loco-regional sygdomme og fjernmetastaser er utilfredsstillende. Væsentlige satser for fjernt tilbagefald og metastaser forekommer stadig i disse patienter efter strålebehandling eller kemo-strålebehandling. En af de store mekanismer for en sådan post-terapeutisk gentagelse af NPC er blevet foreslået af “kræft stamceller-lignende celle” (CSC) proposition [4].

Ifølge CSC-modellen, kræft er hierarkisk organiseret lignende til normale væv og cancer vækst og progression er drevet af en lille delmængde af tumorceller med stamcellelignende egenskaber, de CSCS. Denne sjældne cellesubpopulation er ansvarlig for tumor initiering, vedligeholdelse og regenerering [4], [5]. CSCS er blevet identificeret i forskellige humane maligniteter såsom bryst-, prostata-, ovarie-, lunge- og hoved og hals carcinom [5], [6], [7], [8], [9]. De evner af disse celler til at initiere tumorvækst, opretholde selv-fornyelse og letter lægemiddelresistens er blevet grundigt dokumenteret. I betragtning af de unikke egenskaber CSCS, er tilbagefald af tumorer foreslået at skyldes den manglende udrydde alle CSCS og overlevende CSCS derefter rekonstruere tumor i lokale og fjerntliggende regioner.

Selvom CSCS har vist sig at være af afgørende betydning i udviklingen af ​​de fleste kræftformer, oplysninger om deres eksistens i EBV-associeret NPC er knappe. Enten forskning blev udført ved hjælp af EBV-negative cellelinjer eller ikke var i stand til at belyse eventuelle funktionelle CSCS [10], [11], [12]. Vores gruppe har tidligere etableret flere EBV-positive tumorer linjer fra NPC patienter i endemiske områder [13], [14], [15], [16] og ved hjælp af disse indfødte EBV-positive tumorceller, vi havde til formål at identificere og karakterisere funktionel NPC CSCS.

I denne undersøgelse blev sfære-dannende celler ( “sfæroider ‘) fra EBV-positive cellelinie C666-1 isoleret og deres stamcellelignende egenskaber blev bekræftet. Vi viste, at CD44 og SOX2 blev udtrykt i et flertal af disse CSCS. Ved microarray analyse blev afvigende udtrykte cellulære gener i CSCS identificeret. Interessant, CCR7, en celleoverflade kemokinreceptor, viste sig at være konsekvent udtrykkes i NPC linjer og primære tumorer. Tilfældigvis blev det overudtrykt i vores identificeret NPC CSCS og neutralisering af denne receptor afskaffede kugle-dannende evne C666-1. Vores nuværende undersøgelse fastsat første beviser for tilstedeværelsen af ​​tumorigene CSCS i EBV-positive NPC og CCR7 kunne spille en rolle i deres tumorgene funktion. De ovenstående resultater vil øge vores forståelse af arten af ​​NPC CSCS, hvilket er afgørende i udviklingen af ​​mere effektiv terapeutisk intervention mod denne sygdom.

Resultater

CSC Capabilities af EBV-positive NPC-afledte Sfæroider

CSCS besad evnen til at danne forankringsuafhængige tumor sfærer ved dyrkning i specialiserede serum-frit medium. Som vist i figur 1A, blev fritflydende tumor sfærer dannes, når dissocierede C666-1 celler blev dyrket på ikke-coatede plader i serumfrit stamcelle medium. Ikke-adhærente sfæroider var observerbare ved 6-8 dage, og de blev enzymatisk dissocieret til enkelte celler til passage ugentligt. Distinct prototypiske sfæroider blev dannet 28 dage efter udpladning. Denne selvfornyende flydende tumor kugler kunne passeres serielt og dyrkes i mere end 3 måneder. Når enkeltceller fra sfæroider blev dyrket i adhærente plader med komplet medium (RPMI-1640 med 10% FBS), flydende celler adhæreret til pladen og dannede systematiske kolonier, der viser epitelcelle morfologi svarende til den i parental monolag C666-1 celler (Fig . 1A, højre panel).

(A) fritsvævende tumor sfærer blev dannet af EBV-positive C666-1 celler (venstre panel), og de påviste evne til at differentiere sammenligneligt at monolag celler efter administration komplet medium ( højre panel). (B) Ved QRT-PCR, flere stamcelle-relaterede gener (OCT4, NANOG, ALDH1, CKIT, CD44, CD133) blev beriget i sfæroider sammenlignet med parental C666-1. Transskription af SOX2 blev ikke øget i sfæroiderne. (C) SOX2 protein blev ofte udtrykt i C666-1 sfære-dannende celler. Ved flowcytometri blev SOX2-positive (SOX2 +) celler findes at være beriget i og udgjorde mere end 60% af kugle-dannende cellepopulation. (D) Over 80% af kugle-dannende celler udtrykte celleoverflademarkør CD44 mens CD44 + celler i fundet i forældrenes C666-1 og andre NPC xenografter var signifikant lavere (alle

P

0,001). Histogrammer angiver middelværdi ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnet ved t-test (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001)

for at måle tumorigen kapacitet sfæroider blev forskellige antal af kugle-dannende celler og uselekterede forældrenes C666-1 celler injiceres subkutant i flankerne af nøgne mus.. Vi fandt, at 10.000 sfære-dannende celler kan danne tumorer i alle inokulerede mus (tabel 1). Injektion af 1.000 sfæroide celler lejlighedsvis dannes en tumor ud af seks mus. Dog var nødvendige for tumordannelse mindst 500.000 uselekterede C666-1 celler. De sfæroide celler viste mindst 50 gange højere tumorigent potentiale end de ikke valgte celler. For yderligere at kontrollere, om kugle-dannende celler er i stand til serielt udbreder i nøgne mus, blev implanteret udviklet fra sfæroider serielt indpodet i nøgne mus. Alle af dem viste succesfulde serielle transplantationer og tumorer var observerbar på 3-4 uger (data ikke vist).

Vi undersøgte derefter udtrykket mønster af flere stamcelle markører og overfladeantigener i disse sfæroider. Ved QRT-PCR-analyse, fandt vi, at ekspressionen af ​​flere stamcelle markører (OCT4, NANOG, ALDH1, CD44 og CD133) i sfæroider var signifikant højere end de monolag forældrenes C666-1 celler (alle

P

0,05, figur 1B).. Forøget ekspression af CKIT, KLF4 og KLF5 i sfæroiderne blev også bemærket. Selvom vi ikke registrerer opregulering af SOX2 transskription på området-dannende celler, blev SOX2-udtrykkende (SOX2 +) celler vist sig at være stærkt beriget i sfæroiderne (70,8 ± 2,16%) ved flowcytometri (alle

P

0,001, figur 1C).. Vi har detekteret også SOX2 udtryk i 0,77 ± 0,13% af celler i NPC xenografter. Resultaterne bekræftede, at sfæroiderne afledt af EBV-positive C666-1 celler udviser CSC fænotyper.

Sphere-dannende CSCS Express celleoverfladeprotein CD44

Siden transkription af CD44 og CD133 blev væsentligt forøget i sfæroider, verificeres derefter vi, om ekspressionen af ​​disse CSCS overflademarkører var specifik for NPC sfære-dannende celler. Ved flowcytometri og immunfluorescensfarvning, har vi vist, at et flertal af cellerne i C666-1 sfæroider (84.14 ± 1.12%) var CD44 positive (fig. 1 D og fig. S1). CD44 + celler blev også fundet som en subpopulation af de parentale C666-1 celler (5,28 ± 1,29%) og tre NPC xenotransplantater, xeno-666 (12,31 ± 1,97%), xenotransplantation-2117 (9,58 ± 1,80%), og C17 (17.31 ± 1,76%) (fig. 1D). Imidlertid blev CD133-udtrykkende celler påvist i kun 32,11 ± 2,35% af sfæroider celler og 1,90 ± 0,84% af forældrenes C666-1 celler. Endvidere CD133 + -celler var helt fraværende i 2 af xenotransplantater (xeno-666 og xeno-2117) (Fig. S2). Foreslog derfor vi, at CD44 er en fælles kandidat CSC overflade markør for EBV-positive NPC.

CD44 + celler udtrykker SOX2 og Exhibit Højere Clone- og Sphere-dannende Effektivitet

Angivelse af stamceller transskription faktor SOX2 konsekvent påvist i en tumor celle delpopulation i primær NPC og menes at være en potentiel markør for NPC CSCS [12]. Derfor vurderede vi co-ekspression af CD44 og SOX2 i sfæroider-valgte monolag C666-1 celler, samt 3 xenotransplantater og 5 primære tumorer ved flowcytometri. Som vist i figur 2, over 60% af kugleformede celler (66,57 ± 2,72%) udtrykte både CD44 og SOX2. Tilfældigvis blev SOX2 udtryk sjældent påvist i CD44- brøkdel af C666-1 sfære-dannende celler, hvilket tyder på en privilegeret udtryk for denne stamcelle transskription faktor i CD44 + celler. Co-ekspression af CD44 og SOX2 blev også påvist i 0,1-9% af celler i NPC-cellelinien, xenotransplantater og primære tumorer. Resultaterne antydede, at CD44 + Sox2 + celler er potentielle CSCS i NPC. For at bevise denne hypotese, vi udførte funktionelle assays i CD44 + og CD44- celler isoleret fra forældrenes C666-1 celler. Repræsentative tal for CD44-ekspression i de isolerede CD44 + og CD44- celler er vist i fig S3. Som vist i figur 3A, blev signifikant højere klon dannelse effektivitet detekteret i CD44 + cellefraktion end CD44- fraktionen (

P

0,01). Desuden kunne CD44 + -celler til væsentligt højere antal sfæroider forhold til CD44- celler (

P

. 0,001, figur 3B).

ved flowcytometri, SOX2 viste sig at være fortrinsvis udtrykt på CD44 + celler og sammenfaldende, var SOX2 ekspression sjældent detekteres i CD44- celler. Celler med coekspression både CD44 og SOX2 viste sig at være beriget i sfæroider. Histogrammer angiver middelværdi ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnet ved t-test (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001)

CD44 + cellefraktion udviste en signifikant højere (a) klon dannelse effektivitet og (B) kugle-dannende effektivitet i forhold til CD44- fraktionen celle. Derudover (C) CD44 + celler udviste signifikant højere proliferationshastighed end CD44- celler. (D) Developmental hierarki træk ved CD44 + -celler. Procentdel af CD44 + celler blev reduceres kontinuerligt i den isolerede CD44 + cellefraktion over tid. (E) CD44 + celler udviste højere resistens mod 5-FU behandling sammenlignet med CD44- og parentale C666-1 celler. Alle grafer angiver middelværdi ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnet ved t-test (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001)

spredning af CD44 + celler

Ved WST1 proliferation assay, CD44 + celler udviste en signifikant højere spredning sats i forhold til CD44- og forældreorlov C666-1 celler, mens CD44- celler viste en signifikant lavere spredning sats i forhold til forældrenes C666-1 celler. (alle P. 0,01, figur 3C)

hierarkisk forhold af CD44 + og CD44- Cells

i overensstemmelse med CSC egenskaber, afslørede vi, at de sorteres CD44 + C666-1 celler besad evnen til at give anledning til både CD44 + og CD44- celler. Som vist i fig. 3D, et fald i CD44 + cellefraktion i de sorterede CD44 + -celler blev påvist ved flowcytometri over tid. Det er sandsynligt, sorteret CD44 + -celler give anledning til en heterogen population ved nedregulering af CD44 i en undergruppe af disse celler efter dyrkning

in vitro.

Imidlertid ingen signifikant ændring i procentdelen af ​​CD44 + cellefraktion i både usorteret parental og sorteret CD44- celler blev påvist efter 3-6 dages passage. Resultaterne tyder på en hierarkisk forhold af CD44 + og CD44- celler i EBV-associeret NPC.

kemoresistens af CD44 + celler

For at undersøge kemoresistens af CD44 + celler til anti-cancer kemoterapeutiske midler, vi udførte celleoverlevelse assays for de CD44 + og CD44- cellefraktioner behandlet med fluoruracil (5-FU), cisplatin eller doxorubicin. CD44 + cellefraktion af C666-1 udviste stærkere kemoresistens til 5-FU sammenlignet med de parentale ikke valgte C666-1 celler og CD44- fraktionen (alle

P

0,05) (. Figur 3E). Den kemoresistens af CD44 + celler i retning af cisplatin eller doxorubicin var ligner CD44- og forældrenes C666-1 celler (data ikke vist).

differentielt udtrykte gener i NPC-afledte Spheroids

For at omfattende karakterisere egenskaber af NPC CSCS undersøgte vi ekspressionen af ​​cellulære og EBV-gener i NPC sfære-dannende celler under anvendelse olignonucleotide microarray og qPCR assays. For det første vurderes vi EBV kopital og ekspressionsniveauet af EBV-gener, herunder EBNA1, LMP1, LMP2A, BARF1, EBER1 og BZLF1 i C666-1 sfæroider. Kuglen-dannende celler viste højere EBV kopi nummer og latent genekspression end de parentale C666-1 celler (Fig. 4A). Vi har registreret en betydelig stigning af EBER1, BARF1 og LMP1 udtryk i sfæroiderne (alle

P

0,05). blev ikke observeret nogen signifikant forskel i ekspressionen af ​​EBV øjeblikkelig tidlig lytisk gen BZLF1 mellem sfæroiderne og forældrenes C666-1 celler.

(A) ved QRT-PCR, flere EBV gener (Eber BARF1, LMP1, LMP2A, EBNA1 og BZLF1) sig at være overudtrykt i sfæroider sammenlignet med monolag C666-1 celler. EBV kopital i disse celler blev bestemt ved qPCR. (B) Udvalgte gener afvigende udtrykt i sfæroider blev bekræftet ved QRT-PCR. De markant opreguleres gener omfatter chemokiner og receptorer (CCR7, CCL4, CX3CL1 og IL-8), celleadhæsionsmolekyle SELE, signalmolekyler (GLI1, FOXN4) og ABC transportører (ABCC3, ABCC11). (C) Cell overflade-udtrykte CCR7 viste sig at være ofte udtrykt i kugle-dannende celler ( 60%) ved flowcytometri. Den CCR7 + celle delpopulation blev også påvist i NPC linjer og primære tumorer ( 5%). Der blev også fundet (D) CD44 + CCR7 + celler, der skal beriges i sfæroider. Histogrammer angiver middelværdi ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnet ved t-test (*

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001)

De cellulære gener udtrykkes forskelligt i sfæroider og monolag C666-1 celler blev identificeret ved microarray analyse. Angivelse af 830 og 260 gener viste sig at vise mere end 5-fold stigning og fald i kugle-dannende celler hhv. Gene ontologi analyse viste, at de 5 store molekylære funktion kataloger beriget i de differentielt udtrykte gener indbefatter: regulering af transkription, immunrespons, regulering af apoptose, celleadhæsion og transmembrane transport, hver med betydelige P-værdier (tabel 2 og tabel S2). Et udvalg af differentielt udtrykte gener blev anført i tabel 2. Ved QRT-PCR, valideret vi ekspressionen af ​​udvalgte gener involveret i at opretholde stamcelle-egenskaber i sfæroiderne og parentale C666-1 (fig. 4B). Markant øget ekspression (

P

0,05) af kemokiner og receptorer (IL8, CCI4, CX3CL1, CCR7), signalvej gener (FOXN4 og GLI1), og celleadhæsionsmolekyler (Sele) blev bekræftet i sfæroiderne (fig. 4B). Især er to ATP-bindende kassette (ABC) transporter gener (ABCC3 og ABCC11) også stærkt til udtryk i sfæroiderne (alle

P

0,01). Den overekspression af disse gener kunne være ansvarlig for kemoterapi træk ved NPC CSCS (fig. 4B).

Angivelse af CCR7 i CD44 + CSCS af NPC

Blandt de differentielt udtrykte gener, CCR7, en kemokinreceptor, viste den højeste gange ændring i ekspression i sfæroiderne ved microarray analyse og blev således udvalgt til yderligere undersøgelse. Ved flowcytometri, en betydelig berigelse af CCR7 + -celler blev påvist i sfæroider sammenlignet med parentale celler (alle

P

0,001, figur 4C.). Vi har detekteret også CCR7 udtryk i 0,53 ± 0,14% og 2,87 ± 1,53% af celler i xenografter og primære tumorer hhv. Flerfarvet flowcytometrisk analyse viste, at et flertal af CCR7 + celler blev co-udtrykt med CD44. CD44 + CCR7 + celler blev beriget i sfæroider sammenlignet med xenotransplantater og primære tumorer (alle

P

0,001, figur 4D.). Denne kandidat CSC fraktion blev også påvist i NPC tumor linjer og primære tumorer.

Siden CCR7 blev stærkt udtrykt i NPC sfære-dannende celler og korreleret med lymfeknude metastaser i forskellige menneskelige kræftformer, vi derefter fastsat sammenslutningen af ​​CCR7 ekspression med de kliniske parametre i 39 primære NPC tilfælde. Repræsentative CCR7 ekspressionsmønstre i primære tumorer blev vist i figur 5. CCR7 ekspression er signifikant korreleret med CD44-ekspression i disse tilfælde (fig. S4). Blandt de NPC prøver, 8 (20,5%) var negative for CCR7 farvning. Svag, medium og høj ekspression af CCR7 blev påvist i 13, 7 og 11 primære tilfælde hhv. Vigtigere, fandt vi, at CCR7 ekspression korrelerede med tilstedeværelsen af ​​tilbagevendende sygdom og fjernt metastase (tabel 3). Konstateringen underforstået, at CCR7-udtrykkende celler kan bidrage til sygdomsprogression.

repræsentative delprøver NPC tilfælde med stor (A), medium (B), lav (C) ekspression af CCR7. (D) Primære NPC med manglende CCR7 ekspression blev vist. CCR7 farvning blev påvist i få infiltrerende lymfocytter, men ikke i tumorcellerne. Primære tumorer med høj (E) og medium (F) CD44-ekspression blev vist. I (G) og (H), blev svag CD44-ekspression påvist i tumorcellerne, mens kraftig CD44 farvning i infiltrerende lymfocytter almindeligt blev fundet.

For at undersøge den rolle, CCR7 i NPC CSC , vi udnyttet en CCR7-blokerende antistof til at neutralisere dens funktion i forældrenes, CD44 + og CD44- C666-1 celler. Cellerne blev behandlet med 0-250 ng /mL CCR7 blokerende antistof i 24 timer og proliferationen af ​​celler blev målt ved WST1 assay. Observerbar fald i celleproliferation blev observeret i fraktion CD44 + celle sammenlignet med CD44- og parentale C666-1 celler. (Fig. 6A). Reduceret klon dannelse effektivitet blev også fundet i C666-1 celler behandlet med CCR7 blokerende antistof (

P

0,05, figur 6B.). Vigtigt er det, blev sfære-dannende evne betydeligt hæmmet efter CCR7 blokerende antistof behandling (

P

. 0,001, figur 6C). Resultaterne forudsat dokumentation for inddragelse af CCR7 i at bevare CSC funktion i NPC.

For at evaluere funktionen af ​​CCR7 i CSCS, C666-1 blev behandlet med CCR7 blokerende antistof og dens spredning, klon-dannende og sphere- danner effektivitet blev undersøgt. (A) Proliferation af CD44 + -celler blev inhiberet efter behandling med CCR7 blokerende antistof. (B) Den klon dannelse effektivitet C666-1 celler blev formindsket efter CCR7 blokering og (C) den sfæroid-dannende evne signifikant inihibited (

P

0,001) sammenlignet med ubehandlede kontroller. Histogrammer angiver middelværdi ± SE (n≥3) med statistisk signifikans beregnet ved t-test (*

P

0,05, ***

P

0,001).

diskussion

Denne undersøgelse giver de første beviser på eksistensen af ​​meget tumorgene CSCS i EBV-positive NPC. Vi har udviklet en protokol til at opnå EBV-positive NPC CSCS for yderligere karakterisering. Dannelse af sfæroider er en vigtig funktionel egenskab ved CSCS i humane cancere [17]. I denne undersøgelse har vi isoleret med succes en potentiel CSC befolkning i EBV-positive NPC cellelinie C666-1 gennem høst tumor sfærer. De stamcellelignende egenskaber i kugle-dannende C666-1 subpopulation opnået blev bekræftet ved at demonstrere opregulering af multipel stamcelle-associerede gener og høj tumorigenicitet i nøgne mus [9], [18], [19]. Gennem omfattende karakterisering af NPC sfæroider, tumor linjer og primær tumor, har vi vist, at CD44 og SOX2 er potentielle CSC markører for NPC. Celleoverflademarkører er afgørende at identificere CSCS blandt heterogene tumorceller. CD44 er et hyaluronanreceptor og har vist sig at være markør for CSCS i hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) [7]. I denne undersøgelse viste vi, at CD44 ekspression blev beriget i NPC CSCS. Som det fremgår af den væsentligt højere sfære-dannende evne CD44 + NPC-celler, blev CSC subpopulation bekræftet at være beriget med denne CD44 + fraktionen. Modstanden af ​​CD44 + celler til 5-FU behandling er samstemmende med forslagene CSC egenskaber. Udover CD44, vores undersøgelse påvist også berigelsen af ​​Sox2-udtrykkende celler i sfæroiderne, den funktionelle NPC CSCS. Interessant nok blev tilsvarende niveau for Sox2 transkripter fundet i både kugle-dannende og parentale C666-1 celler. Ifølge vores upublicerede fund, kan den forøgede SOX2 proteinekspression skyldes tabet af de Sox2-undertrykke miRNA (MIR-183 og MIR-203) i sfæroiderne. SOX2 er en transkriptionsfaktor som regulerer pluripotens i embryoniske og voksne vævsspecifikke stamceller [20]. Det regulerer stamceller selv-fornyelse og differentiering og ofte viser sig at være opreguleret i humane kræftformer [21]. Zhang

et al

. (2010) har foreslået, at Sox2 + celler besidder stemness egenskaber [12]. De har vist, at SOX2 blev udtrykt og co-lokaliseret med OCT4 i primær NPC. I konkordans med Zhang resultater, afslørede vores resultater, at CD44 + Sox2 + celler er beriget med NPC CSCS.

Isolering af kugle-dannende celler i EBV-positive NPC cellelinie givet os mulighed for at vurdere ekspression af EBV latent og lytiske gener i CSC. Især blev der påvist forhøjede udtryk for EBV latent genprodukter, EBER1, BARF1 og LMP1 i CSC delpopulation. Vi har tidligere vist, at ekspressionen af ​​EBER giver resistens mod apoptotisk stress [22]. Den høje EBER ekspression i NPC CSCS foreslår, at dette cellesubpopulation måske mere resistente over for apoptose. På den anden side, kan LMP1 fremkalde EMT via Twist eller Snail, som falder sammen med købet af CSC egenskaber [23], [24], [25]. Desuden Kondo

et al

. har også for nylig vist, at LMP1 inducerer CD44 + CSC i nasopharyngeale epitelceller [26]. Resultaterne indebærer, at LMP1 ekspression kan spille en kritisk rolle i CSC vedligeholdelse i denne EBV-associeret ondartethed.

Udover de EBV latente gener, vores microarray analyse afslørede en overekspression af CCR7 i NPC-afledte sfæroider. Den berigelse af CCR7 + cellepopulationen i kugle-dannende celler blev bekræftet ved flowcytometri. CCR7 er en kemokinreceptor, der medierer cellemigration som svar på sin ligand CCL21 [27]. Det er sandsynligt, at høj CCR7 receptor ekspression i kugle-dannende celler vil øge sin følsomhed over for liganderne og aktivere dens nedstrøms signalering. Aberrant CCR7 ekspression i humane maligniteter er blevet forbundet for celleoverlevelse og metastatiske veje. Den CCL21 /CCR7 pathway kan spille en afgørende rolle i metastase af CCR7 + CSCS til lymfeknuder [28]. Overekspression af CCR7 i CSCS kan bidrage til de hyppige cervikale lymfeknudemetastaser i NPC patienter [29]. Den ophævede sfære-dannende evne NPC celler efter CCR7 neutralisering foreslået CCR7 kan også regulere CSC egenskaber i NPC.

Lægemiddelresistens er en vigtig egenskab ved CSCS, som danner grundlag for tumor tilbagefald efter kemoterapeutiske behandlinger [30 ]. Forøget ekspression af ATP-bindende kassette (ABC) transporter familie er ansvarlig for udstrømningen af ​​terapeutiske lægemidler og er en almindelig mekanisme til opretholdelse af lægemiddelresistens i CSCS [31], [32]. Som det fremgår af vores microarray studie blev signifikant overekspression af ABCC3 og ABCC11 fundet i kugle-dannende celler. ABCC3 er medlem af multiresistens protein (MRP) subfamilien og viste sig at være overudtrykt i ovariekarcinom og doxorubicin-resistente lungecancer-cellelinje [33], [34]. ABCC3 overekspression kan bidrage til narkotika resistente egenskaber i cisplatin /doxorubicin-resistente C666-1 cellelinier (fig. S5). ABCC11 er en anden MRP familiemedlem opreguleret i NPC-afledte sphæroider. Det er den vigtigste transporter for 5-fluoruracil (5-FU) [35], som er en af ​​de vigtigste kemoterapeutiske lægemidler for NPC [3]. Over-ekspression af ABCC11 i sfære-dannende celler antyder, at CSC befolkning i NPC er resistent over for kemoterapeutiske lægemidler og dermed bidrage til tumortilbagefald.

pindsvinesignaleringsvejen er en vigtig regulator af CSC vedligeholdelse og funktion. I C666-1 sfæroider har microarray undersøgelsen også påvist den forøgede ekspression af GLI1, en større transkription aktivator af hedgehog signalering pathway. I ovariecarcinom blev GLI1 rapporteret at regulere væksten af ​​CSCS [36]. For at belyse den rolle GLI1 og pindsvineoverføringsvejen i NPC CSCS, vil virkningerne af lyddæmpende GLI1 udtryk på dannelse og tumorigene egenskaber af kugle-dannende celler undersøges. Den udredning om signalering mekanismer, der regulerer udbredelsen og apoptose af NPC CSCS vil gavne behandlinger målrettet på denne delpopulation af narkotika resistente celler.

Som konklusion, vi har identificeret meget tumorigene CSCS i EBV-positive NPC og denne delpopulation kunne være beriget af celleoverfladen CD44 og identificeret sammen med SOX2. Vores undersøgelse har opdaget flere afgørende molekyler, herunder CCR7 og ABCC11 involveret i vedligeholdelse af NPC CSC funktioner. De nuværende resultater forudsat et fundament for udviklingen af ​​nye behandlingsformer rettet mod NPC CSC, der kan forstærke effekten af ​​nuværende behandlinger.

Materialer og metoder

cellelinjer, implanteret og primære tumorer

En EBV-positive NPC cellelinie (C666-1) og 3 xenotransplantater (xeno-666, xenotransplantation-2117 og C17) blev inkluderet i denne undersøgelse [13], [14], [15]. Parental C666-1 blev dyrket i RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen). For tumor sfære kultur blev celler dyrket i serum-frit DMEM-F12 (Invitrogen) på ultralave montagepladerne. Sfæroider blev dissocieret og passeret hver 6-8 dage. I alt 1 × 10

6 C666-1 celler blev podet per brønd og antallet af sfæroider dannede blev talt.

Fem endoskopiske tumorbiopsier for FACS-analyse blev opnået fra NPC patienter med skriftlige samtykke i Institut for Otorhinolaryngologi, Prince of Wales Hospital, CUHK. Alle tilfælde var positive for

EBER

–

in situ

hybridisering og histologisk diagnosticeret som udifferentieret eller dårligt differentierede NPC. Vi rekrutterede også 49 arkivering formalin-fikseret paraffinindlejrede primære tumorer fra vævsbank af Institut for Anatomisk Cellular Pathology, CUHK til immunhistokemisk (IHC) farvning. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Clinical Research etiske komité af den kinesiske University of Hong Kong.

Kvantitativ Reverse Transcription og polymerasekædereaktion (QRT-PCR) Analyse

Totale RNA’er blev udvundet ved hjælp af Qiagen RNeasy kit (Qiagen) og revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af SuperScript cDNA Synthesis kit (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Kvantitativ RT-PCR blev herefter udført med specifikke primere (Invitrogen, primersekvenser som anført i tabel S1) og Power SYBR® Green PCR mix (Applied Biosystems). β-actin-ekspression blev anvendt til data normalisering. Alle QRT-PCR’er blev udført i tre eksemplarer på et ABI 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems) som anvist af producenten.

Fluorescens-cellesortering (FACS) Analyse

Enkelt celle suspensioner opnået fra cellelinjer og tumorvæv blev skyllet to gange og resuspenderet i PBS (10

5 til 10

6 celler /100 pi). Til intracellulær farvning blev cellerne fikseret i 70% ethanol i 24 timer ved -20 ° C før rehydrering med PBS.