PLoS ONE: MicroRNA-486 som biomarkør for tidlig diagnose og Gentagelse af ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er en førende årsag til kræft død på verdensplan. Tidlig diagnose er essentiel for forbedringer af prognose og overlevelse af patienterne. I øjeblikket er der ingen effektiv biomarkør tilgængelige i kliniske omgivelser til tidlig opdagelse af lungekræft. Ændrede udtryk i mange cancertyper, herunder NSCLC og stabil tilværelse i plasma gør microRNA (miRNA) en gruppe af potentielt nyttige biomarkører for kliniske vurderinger af patienter med NSCLC.

Mål

For at vurdere de potentielle værdier af miRNA som blod-baserede biomarkører for tidlig diagnose og prognose i NSCLC patienter.

Metoder

Perifere blodprøver fra raske frivillige og tidlige-iscenesatte NSCLC patienter før og efter operationen blev indsamlet, og plasma blev skilt fra. Ekspression af ti miRNA i plasmaet og tumor sektioner af patienterne blev påvist ved kvantitativ real-time polymerasekædereaktion.

Resultater

miRNA (MIR) -486 og MIR-150 viste sig at væsentligt at skelne lungekræftpatienter fra raske frivillige. Areal under kurven for miR-486 og miR-150 var 0,926 (følsomhed, 0,909, specificitet, 0,818) og 0,752 (følsomhed, 0,818, specificitet, 0,818), hhv. Som reaktion på behandlingen, patienter med nedreguleret miR-486 udtryk udviste længerevarende tilbagefald overlevelse end dem med un-reducerede miR-486-ekspression (median, unået vs. 19 måneder hazard ratio, 0,1053; 95% konfidensinterval, 0,01045 til 1,060;

P

= 0,056)

konklusioner

resultaterne tyder på, at miR-486 og miR-150 kunne være potentielle blod-baserede biomarkører for tidlig diagnosticering af NSCLC. . Overvågning skift af miR-486-ekspression i plasma kan være en effektiv og ikke-invasiv metode til gentagelse forudsigelse af tidlige-iscenesatte NSCLC patienter

Henvisning:. Li W, Wang Y, Zhang Q, Tang L, Liu X , Dai Y, et al. (2015) MicroRNA-486 som biomarkør for tidlig diagnose og Gentagelse af ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (8): e0134220. doi: 10,1371 /journal.pone.0134220

Redaktør: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, USA

Modtaget: 8. maj 2015; Accepteret: 7 jul 2015; Udgivet: 3 August, 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Funding:.. Dette arbejde blev støttet af Changzhou Videnskab og Teknologi Support Program (nr CE20125002)

Konkurrerende interesser: Jim Lu er aktionær og ejer af Changzhou GoPath Diagnostic Laboratory Co Ltd og GoPath Laboratories LLC i Buffalo Grove, IL, USA. Zhongmin Guo er ansat i Changzhou GoPath Diagnostic Laboratory Co Ltd og GoPath Laboratories LLC i Buffalo Grove, IL, USA. Wanshuai Li, Qi Zhang, Lili Tang, Xiaoping Liu, Yunhua Dai, Liang Xiao, Shuguang Huang, og Lu Chen er ansat af Changzhou GoPath Diagnostic Laboratory Co Ltd. Ingen potentiel konkurrerende interesse er beskrevet af de andre forfattere. Undersøgelsen blev delvist finansieret af Changzhou GoPath Diagnostic Laboratory Co. Ltd i Kina og GoPath Laboratories LLC i Buffalo Grove, IL, USA. Den kommercielle tilhørsforhold af forfatterne og studiet ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 80% af lungekræft, som er en førende årsag til kræftdødsfald i verden [1]. I løbet af de seneste årtier, fremskridt i kirurgiske teknikker og strategier kemostråleterapi og target terapi har væsentligt forbedret overlevelsen af ​​patienter med lungecancer [2, 3]. Trods forbedringer af kliniske tilgange i håndtering af patienter med lungecancer, overlevelsen af ​​patienter med lokalt fremskreden ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er fortsat dårlig, med en 5-års samlet overlevelse (OS) på 15% for fase III NSCLC patienter behandlet med sideløbende kemostråleterapi [3, 4]. Det anslås, at mere end 200.000 nye lungekræft tilfælde og omkring 150.000 dødsfald i forbindelse med lungekræft opstår årligt i USA [1]. Tidlig diagnose er en af ​​de mest effektive strategier til at forbedre overlevelse og prognose af lungecancerpatienter [2]. Men der er ingen klinisk biomarkør i brug i dag for tidlig diagnose og forudsigelse af prognose for patienter med lungekræft.

MikroRNA’er (miRNA) er enkeltstrengede RNA arter, der udgør en klasse af ikke-kodende RNA, og dukker som centrale regulatorer af genekspression [5]. Mange undersøgelser har vist, at miRNA udviser ændret ekspression i forskellige cancerformer og kan tjene som vigtige prognostiske biomarkør af cancere [6-8]. Nylige fund, at humant plasma indeholder stabilt udtrykt microRNA har afsløret et stort potentiale i blod-baserede miRNA signatur som overfladiske biomarkører for kliniske vurderinger af menneskelige kræftformer [8-10]. For eksempel cirkulerende MIR-21 var signifikant højere hos patienter med NSCLC end i normale kontroller [9, 11]. Serumniveauer af MIR-486, MIR-30d, MIR-1 og MIR-499 var signifikant associeret med overordnet overlevelse hos patienter med NSCLC [8]. Serum miR-210 var signifikant opreguleret i NSCLC patienter sammenlignet med raske kontrolpersoner [12].

I denne undersøgelse vi screenede litteratur og udvalgt ti miRNA relateret til NSCLC, herunder miR-126 [13 ], miR-150 [14], miR-155, miR-205 [11, 15], miR-21 [9, 11], miR-210 [12], miR-26b [10], miR-34a [7 ], miR-451 [16] og miR-486 [8, 9], at sammenligne de miRNA niveauer mellem raske frivillige og NSCLC patienter.

Materialer og Metoder

patienter

Denne undersøgelse retrospektivt inkluderede patienter tidligt stadie (før fase IIIa), der tidligere havde gennemgået lunge resektioner for primær NSCLC perioden november 2012 og februar 2014. patienterne blev identificeret fra biorepository database over kirurgisk patologi fra Institut for Thoracic Surgery, No. 2 Folkets Hospital i Changzhou, Changzhou, Jiangsu, Kina. Der var ingen andre kriterier for denne undersøgelse inklusion eller eksklusion. Tumorer blev iscenesat efter tumor-node-metastaser (TNM) iscenesættelse system amerikanske Blandede kræft [17]. Kontrolpersoner blev rekrutteret fra personer, der søgte en rutinemæssig helbredsundersøgelse-up på Fysisk sundhed undersøgelse Center for No. 2 Folkets Hospital i Changzhou og havde ikke tidligere været diagnosticeret med kræft. En 5-ml perifert veneblod prøve blev udtaget fra raske frivillige og NSCLC-patienter 2 dage før og 7-10 dage efter kirurgi, og opsamles i en antikoagulerende rør med ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). De hele blodprøver blev derefter centrifugeret ved 1000 g i 30 minutter ved 4 ° C i en Sigma 3K15 centrifuge (SIGMA Laborzentrifugen, Osterode am Harz, Tyskland). Plasma blev straks opsamlet, frosset og opbevaret ved -80 ° C i yderligere analyser. Gentagen afrimning blev undgået under opbevaring for at sikre kvaliteten af ​​prøverne. Desuden matchede formalin-fikseret, paraffinindlejrede (FFPE) væv af de 11 NSCLC-patienter indsamles for følgende analyser. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité af No. 2 Folkets Hospital i Changzhou og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere i undersøgelsen.

RNA ekstraktion og kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

RNA-ekstraktion blev udført som beskrevet [12] med små ændringer. Totalt RNA, herunder miRNA, blev ekstraheret og oprenset fra 200 pi plasma eller 4 lysbilleder af FFPE tumorvæv anvendelse af Qiagen miRNeasy Mini Kit eller QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Tyskland) ifølge protokollerne fra fabrikanten. Renheden og koncentrationen af ​​RNA blev bestemt ved anvendelse af en dual-beam ultraviolet spektrofotometer (Eppendorf, Hamburg, Tyskland). Til kvantitativ måling af miRNA ved RT-PCR [18], oprenset plasma miRNA blev omdannet til cDNA ved revers transkription reaktioner under anvendelse TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, USA) og miRNA-specifik stem- loop-primere blev leveret af TaqMan miRNA tests (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, USA). I alt 10 miRNA som er blevet rapporteret til at vise ændrede udtryk i lungekræft blev udvalgt til analyse og deres sekvenser er vist i S1 tabel. RT-reaktioner blev blandet ifølge producentens protokol og gennemført på en Applied Biosystems 9700 PCR instrument under anvendelse af følgende betingelser: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter, 85 ° C i 5 minutter, hold ved 4 ° C . Ekspressionsniveauer af de udvalgte miRNA blev testet ved brug af kvantitativ real-time PCR-analyse i en ABI 7900HT hurtig realtids-PCR-system (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, USA). Real-time PCR reaktioner blev udført i en reaktionsblanding 5 ul indeholdende 2,5 ul TaqMan Universal PCR Master Mix II (Applied Biosystems, Inc.), 0,25 ul miRNA-specifik primer /probe mix (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY , USA), og 2,25 ul fortyndet RT cDNA skabelon ved hjælp følgende cyklusparametre: 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Reaktioner blev udført tre gange. Real-time PCR-data blev indsamlet ved hjælp af SDS 2.2 software (Applied Biosystems, Inc., Grand Island, NY, USA) og relative niveauer af det testede miRNA i plasma og vævsprøver blev beregnet ved hjælp af C. elegans syntetisk miR-39 og RNU44 som normalisering kontrol, henholdsvis [18-20]. Sekvenser af både normalisering kontrol primere er vist i S1 tabel. Tærskelcyklen (CT), der blev defineret som antallet af PCR-cyklusser, der kræves for det fluorescerende signal at være højere end en tærskelværdi, der angiver baseline variabilitet, blev registreret. Relative genekspression af de kontrollerede prøver var repræsenteret ved 2

-ΔΔCT, hvor ΔΔCT = CT

miRNA-CT

normalisering kontrol.

statistiske analyser

Statistiske analyser blev foregå ved hjælp af GraphPad Prism-version 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) og SPSS statistisk pakke, udgave 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) til Windows. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Mann Whitney-test blev anvendt til at analysere forskellene i miRNA plasmakoncentrationer mellem NSCLC-patienter og raske forsøgspersoner. Receiver Operating egenskaber (ROC) analyse blev foretaget for at bestemme evnen af ​​plasmaet miRNA niveauer til at diskriminere mellem NSCLC-patienter og raske forsøgspersoner. Sammenhængen mellem væv og plasma miRNA niveauer blev analyseret ved hjælp af Spearmans korrelationskoefficient. Log-rank (Mantel-Cox) Test blev anvendt til at evaluere associationen mellem gentagelse overlevelse (RFS) og miRNA ekspressions ændringer før og efter operationen. En

P

-værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

MIR-486 og miR-150 blev forøget betydeligt i plasma af NSCLC patienter

for at identificere potentielle blod-baserede miRNA-biomarkører for NSCLC patienter, vi kvantitativt analyseret ekspressionsniveauer af 10 kandidat miRNA i plasma fra 11 NSCLC patienter og 11 normale individuelle kontroller. Kliniske og histopatologiske karakteristika NSCLC patienter og kontrolpersoner er anført i tabel 1. Ingen statistisk signifikant forskel blev observeret i alder og køn mellem patienter og kontrolpersoner.

Kvantitativ analyse af 10 kandidatlande miRNA bestående af miR -126, miR-150, miR-155, miR-205, miR-21, miR-210, miR-26b, miR-34a, miR-451 og miR-486 i plasma ved real-time PCR afslørede signifikant højere niveauer af miR-486 (

P

= 0,008) og miR-150 (

P

= 0,0488) i plasmaprøver fra NSCLC patienter end dem fra normale kontrolpersoner (tabel 2 og figur 1). Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i plasmaniveauer af de resterende miRNA mellem NSCLC patienter og normale individer. Niveauer af de testede miRNA i individuel plasma prøve er vist i figur 1 og gennemsnitlige ekspressionsniveauer af testede miRNA i plasma af NSCLC og normale kontrolpersoner er sammenfattet i tabel 1.

Plasmaniveauer af miR-126 , mIR-150, mIR-155, mIR-205, mIR-21, mIR-210, mIR-26b, mIR-34a, mIR-451 og mIR-486 i 11 raske frivillige (sunde) og 11 NSCLC-patienter blev analyseret ved anvendelse QRT-PCR og normaliseret med cel-mIR-39. Solid prikker viste relative udtryk for miRNA i hvert fag; tværgående linjer angivet hjælp af miRNA i hver gruppe.

For at afgøre, om højere niveauer af miR-486 og miR-150 i plasma er forbundet med deres forøgede udtryk i lungekræft væv, vi analyserede sammenhænge i deres ekspressionsniveauer mellem plasma og cancervæv. Spearmans korrelationskoefficient indikerede, at miR-486 niveauer i plasma blev stærkt korreleret med sit udtryk niveau i væv (Spearman r, 0,8273; 95% konfidensinterval (CI), ,4348-,9556;

P

= 0. 0,0027) , mens ingen signifikant korrelation (Spearman r, 0,5455; 95% CI, -0,1014 til 0,8681;

P

= 0,0876) mellem plasma og væv niveauer for miR-150 blev observeret (figur 2). Dette fund tyder på, at ændret ekspression af miR-486 i plasma er kræft specifik.

Korrelation analyser for plasma og væv niveauer af miR-486 og miR-150 blev udført med GraphPad Prism 5.0-software. (A) Spearman korrelationskoefficient analyse af plasma eller væv MIR-486 niveauer. (B) Spearmans korrelationskoefficient analyse af plasma og væv miR-150 niveauer.

MIR-486 og miR-150 er potentielle blod-baserede biomarkører til detektering af NSCLC

For yderligere udforske den kliniske anvendelighed af miR-486 og miR-150, vi udførte Modtager Driftsegenskaber (ROC) analyse af plasma miRNA data fra patienter med lungecancer og normale kontrolpersoner. Analysen observeret, at arealet under kurven (AUC), følsomhed og specificitet for MIR-486 var 0,926, 0,909 og 0,818, henholdsvis, og de, for MIR-150 var 0,752, 0,818 og 0,818, (fig 3). Resultaterne implicerer differentierede udtryk for miR-486 og miR-150 som potentielle blod-baserede biomarkører for påvisning og diagnosticering af lungekræft.

ROC-analyse blev udført med SPSS 16,0 software. Den faste og stiplede linie indikeret ROC-kurven for MIR-486 og MIR-150 hhv. AUC, areal under kurven.

nedreguleret plasma miR-486-niveau efter operationen er forbundet med langvarig gentagelse overlevelse af NSCLC patienter

For at bestemme potentielle roller miR-486 og mIR-150 forudsige kliniske resultater af lungekræftpatienter, fold ændringer i plasmaniveauer af mIR-486 og mIR-150 før og efter operationen blev registreret og blev korreleret med overlevelse af patienterne. Relative ekspressionsniveauer og fold ændringer af MIR-486 og MIR-150 før og efter kirurgi for individuelle patienter er vist i tabel 2. Alle 11 patienter blev fulgt efter indledende kirurgi og den maksimale opfølgningsperiode nåede 24 måneder. Under opfølgningen blev tre patienter (patient nr, 101, 103 og 152) diagnosticeret som lokalt recidiv eller distal metastaser, mens de øvrige otte patienter blev diagnosticeret som ingen gentagelse tabel 2).

Blandt 11 patienter, størstedelen af ​​patienterne havde en betydeligt reduceret plasmaniveauer efter kirurgi for både mIR-486 og mIR-150 (tabel 2). Vi delte patienterne i to grupper i henhold til ændringerne i miRNA niveauer efter operationen. Patienter med væsentligt reducerede miRNA niveauer i plasma (fold forandring 0,8) blev kategoriseret i nedreguleret (DR) gruppe, og resten patienter til ikke-reduceret (UR) gruppe. Overlevelse analyse af to grupper af patienter viste, at nedreguleret miR-486-niveau i plasma var forbundet med forlænget overlevelse af patienterne med unået median overlevelse for DR og 19 måneder for UR gruppe (figur 3, hazard ratio, 0,1053; 95% CI , 0,01045 til at 1,060;

s

= 0,0561). Selvom forskellen ikke når statistisk signifikant niveau på grund af begrænset antal patienter til studiet, udviklingen i foreningen er indlysende og konstateringen understøtter en yderligere undersøgelse i en stor patient kohorte. blev ikke observeret nogen forskel i patientens overlevelse for plasma miR-150-niveau mellem DR og UR grupper (figur 3, hazard ratio, 0,7936; 95% CI, 0,07682 til at 8,198;

P

= 0,7936)

diskussion

NSCLC er en førende årsag til kræft død på verdensplan og tidlig diagnose er afgørende for prognose af patienterne [1, 2]. Manglende diagnostiske biomarkører for tidlig opdagelse har gjort lungekræft en af ​​de humane cancere med den værste prognose. Cirkulerende miRNA er blevet rapporteret til at være bemærkelsesværdige biomarkører for kræft diagnose på grund af deres overflod og stabilitet i cirkulerende blod [6-8]. I denne undersøgelse, sammenlignede vi plasmaniveauer af ti miRNA, der er blevet rapporteret at have ændret ekspression i NSCLC [7-16], mellem raske frivillige og tidlige stadie NSCLC-patienter. Vores undersøgelse identificeret to kandidat miRNAsmiR-486 og miR-150 som potentielle blod-baserede biomarkører for tidlig diagnose og prognose af NSCLC patienter (Fig 1).

Serum miR-150 er blevet rapporteret at være afvigende øget i begyndelsen fase NSCLC-patienter og signifikant korreleret med fjernmetastaser [14]. MIR-150 fremmer spredning af lungekræft celler ved at målrette P53 [21, 22] og BAK1 [23], og spiller derfor en vigtig mekanistisk rolle i patogenesen af ​​lungekræft. Undersøgelser af diagnostiske værdi af MIR-150, især for tidlige stadier af lungekræft, er begrænsede. I overensstemmelse med tidligere rapporter [21-23], vores undersøgelse observeret signifikant øget udtryk for miR-150 i både kræft væv og plasma af tidlige stadie NSCLC-patienter. Mere vigtigt viste vi, at kunne detekteres højere MIR-150 i plasma fra tidlige stadier af lungecancerpatienter og var i stand til at skelne lungekræftpatienter fra raske individer med AUC værdi på 0,752 (figur 2). Dette fund implicerer miR-150 som en blod-baseret kandidat biomarkør for tidlig påvisning af lungekræft.

Et andet interessant fund fra aktuelle undersøgelse er, at miR-486 vises som en mere væsentlig biomarkør for klinisk vurdering af patienter med lungecancer . Data akkumuleret fra forskellige tidligere undersøgelser af MIR-486 i lungekræft var kontroversiel. Peng et al har rapporteret, at miR-486 er betydeligt nedreguleret i kræft [24]. Wang et al yderligere rapporteret, at nedregulering af MIR-486 i lungekræft signifikant korreleret til stadier og lymfeknuder metastase af patienter [25]. Undersøgelse af Solomides et al viste, at miR-486 reduceres i lungekræft væv [10]. Men en undersøgelse af MIR-486 viste, at opreguleres MIR-486 niveauet i plasma blev korreleret med kort samlet overlevelse [8]. I denne undersøgelse har vi påvist, at MIR-486 blev opreguleret i plasma hos patienter med NSCLC og fremstår som en mere følsom og specifik markør i plasma til differentiering tidlige stadier af lungekræft fra normale individer (AUC, 0,926, figur 2), som sammenlignet med mIR-150. Dette fund tyder på, at MIR-486 er en mere lovende markør i perifert blod til tidlig opdagelse af lungekræft. Vi indser, at vores resultat er i modstrid med resultaterne fra nogle af de tidligere undersøgelser, der rapporterede konstant nedregulering af miR-486 i lungekræft [10, 24, 25]. Denne inkonsistens kan skyldes racemæssig forskel i kohorter til studiet.

Det er blevet påvist, at afvigende miRNA niveauer i perifert blod af kræftpatienter er forårsaget af dereguleret miRNA udtryk i tumorvæv som hemmelige tumorafledte miRNA i kropsvæsker herunder perifert blod [15]. At afgøre, om unormale niveauer af miR486 og miR150 i plasma er tumor specifikke, vi sammenlignet tilsvarende væv miRNA niveauer og plasma miRNA niveauer. Vi fandt, at at NSCLC væv miR-486 niveauer blev signifikant korreleret med plasmaniveauer, mens ikke blev observeret nogen statistisk sammenhæng i miR-150 niveauer (Fig 3). Disse resultater antyder, at MIR-486 kan være mere tumorspecifik end MIR-150. Baseret på dette fund, vi den hypotese, at niveauet af miRNA i plasma kan anvendes til overvågning lokal status af tumorer, for eksempel gentagelse efter kirurgi. For at teste denne hypotese, vi sammenlignet MIR-486 niveau i plasma før og efter operationen. Vi fandt, at niveauerne af MIR-486 i plasma faldt betydeligt i størstedelen af ​​de patienter efter kirurgisk fjernelse af tumorer, mens kun 3 tilfælde forblev høje niveauer af MIR-486 i plasma. Interessant analyse af sammenslutning af plasmaniveauer af miR-486 med RFS opfølgende data for patienter viste en stram korrelation af ændringer i plasma miR-486 med tilbagevendende status for patienterne. Patienter med nedreguleret plasma MIR-486 niveauer efter kirurgi var langvarig RFS end dem med høje niveauer af MIR-486 i plasma (Fig 4). Dette fund implicerer, at ændringer af MIR-468-niveauer i plasma som respons på kirurgi kan være en lovende blod-baserede markør til forudsigelse lokalt recidiv af tumorer efter kirurgi hos patienter med NSCLC. På grund af det begrænsede antal patienter i denne undersøgelse, en stor kohorte af patienter er under rekruttering i vores fortsatte undersøgelse for yderligere at verificere dette vigtige fund.

Foreningen af ​​RFS og plasma miRNA niveauspring før og efter operationen blev plottet med Log-rank (Mantel-Cox) Test. (A) Samlet RFS alle NSCLC patienter. (B) Association of RFS og skift af plasma MIR-486 niveau før og efter operationen. (C) Foreningen af ​​RFS og skift af plasma MIR-150 niveau før og efter operationen. DR, nedreguleret; UD, un-nedreguleret; HR, hazard ratio; CI, konfidensinterval.

Konklusioner

Plasma niveauer af miR-486 og miR-150 kan være potentielle biomarkører til tidlig diagnosticering af NSCLC patienter. Overvågning af plasma miR-486 niveauer før og efter operationen kan forudsige risikoen for tilbagefald for tidligt i NSCLC.

Støtte Information

S1 Table. Target sekvenser af miRNA sonder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134220.s001

(DOCX)

Tak

Tak Dr. Leiming Cai (Institut for Patologi , No. 2 Folkets Hospital i Changzhou) til klinisk information og prøvetagning. Dette arbejde blev støttet af Changzhou Videnskab og Teknologi Support Program (nr CE20125002).