PLoS ONE: Optimering af Invasion-specifikke effekter af betulinderivater på prostata cancer celler gennem Lead Development

Abstrakt

Anti-invasive og anti-proliferative virkninger af betulins og abietane derivater blev systematisk testet ved hjælp af et organotypiske modelsystem af avancerede, kastrationsresistent prostatakræft. En indledende screening af den oprindelige sæt af 93 forbindelser blev udført i to-dimensional (2D) vækstbetingelser ved hjælp af ikke-transformerede prostata-epitelceller (EP156T), en androgen-sensitive prostatacancer-cellelinie (LNCaP) og kastrationsresistent, stærkt invasiv cellelinie PC-3. De 25 mest lovende forbindelser var alle betulinderivater. Disse blev udvalgt til en fokuseret sekundær skærm i tredimensionale (3D) vækstbetingelser, med det mål at identificere de mest effektive og specifikke anti-invasive forbindelser. Yderligere følsomhed og cytotoksicitetstests blev derefter udført under anvendelse af en udvidet cellelinje panel. Virkningerne af disse forbindelser på cellecyklusprogression, mitose, spredning og uspecifik cytotoksicitet, versus deres evne til specifikt at forstyrre celle motilitet og tumor celle invasion blev behandlet. For at identificere potentielle virkningsmekanismer og sandsynlige sammensatte mål, blev multiplex profilering af sammensatte effekter på et panel af 43 humane proteinkinaser udført. Disse mål de-foldning studier, kombineret med den fænotypiske analyser af flercellede organoids i 3D-modeller, afslørede specifik hæmning af AKT signalering knyttet til effekter på organiseringen af ​​actincytoskelettet som den mest sandsynlige føreren af ​​ændret celle morfologi og motilitet.

Henvisning: Härmä V, Haavikko R, Virtanen J, Ahonen I, Schukov HP, Alakurtti S, et al. (2015) Optimering af Invasion-specifikke effekter af betulinderivater på prostata cancer celler gennem Lead Development. PLoS ONE 10 (5): e0126111. doi: 10,1371 /journal.pone.0126111

Academic Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, AUSTRALIEN

Modtaget: Februar 3, 2015; Accepteret: 23. marts 2015; Udgivet: 12. maj 2015

Copyright: © 2015 Härmä et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. forfatterne venligt anerkender den økonomiske støtte (Projektnummer 252.308, BARC – Betulins, abietans og harpikser som roman blyforbindelser for kræft) fra Finlands Akademi ( til KMOC), og Tumor mikromiljø Metastase i kastrationsresistent prostatakræft (projekt nummer 267.326) til MN. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Udover hudkræft, prostatakræft (PRCA) er den mest almindelige cancer hos mænd, især i Europa. PRCA er typisk hormonafhængig og den rolle, androgener i progressionen fra androgenafhængig til hormonresistent PRCA er veletableret [1]. Debuterende PRCA held kan styres af drift alene og tilbagevendende tumorer behandles ved ablation af cirkulerende androgener ved kemisk kastration. I modsætning hertil sene kastrationsresistent PRCA (CRPC) med karakteristisk metastatisk spredning af den primære tumor, som regel til benet, er fortsat den vigtigste årsag til kræft-associerede død. Selv om der er gjort betydelige fremskridt i behandlingen af ​​primære og androgen-følsomme prostata tumorer, helbredende behandlinger som specifikt rettet mod metastatisk spredning af avancerede og aggressiv CRPC øjeblikket ikke eksisterer. Dels er dette relateret til manglen på eksperimentelle modelsystemer, som trofast repræsenterer funktionerne i invasiv og celle motilitet

in vitro

eller

in vivo

.

Hverken standard to- dimensionelle (2D) cellekultur modeller (cellelinjer) eller dyremodeller (mus xenografter) repræsenterer den fulde kompleksitet af kliniske tumorer præcist. 2D modeller især mangler tumormikromiljøet (TME), den ekstracellulære matrix (ECM), og stromale celletyper. Sådanne modeller kun dårligt overens med narkotika følsomhed observeret

in vivo

[2]. Disse funktionelle mangler præklinisk opdagelse narkotika afspejles af de høje nedslidning satser for kræftlægemidler ( 95%) [3] i de efterfølgende kliniske studier. Således biologisk mere relevant

in vitro

tumormodeller skal udvikles til at forbedre produktiviteten i lægemiddelforskning og reducere antallet af dyr, der kræves i lægemiddeludvikling [4]. ECM præparater fra forskellige oprindelser har vist sig særligt kritiske for at undersøge celle-celle-interaktioner og differentiering i 3D-kultur [5]. Integreret, robust og standardiserede 3D-platforme er blevet kompatibel for både high-throughput (HTS) og høj-indhold screening (HCS) indstillinger [2], og en effektiv oversættelse af 3D cellekultur metoder fra grundforskning til industrielle applikationer er i gang [6 ]. Biologisk relevant ECM såsom kollagener eller laminin-rige kælder membranekstrakter som Matrigel er nu almindeligt anvendt til at studere cellulære mekanismer såsom cellemotilitet og invasion. Spektret af flercellede morfologier dannet af prostata epitelial og kræftceller i 3D kulturer spænder fra fuldt funktionel kirtel acini, dysfunktionelle tumor sfæroider; til invasive stjerneformige strukturer [7,8], der mangler mest differentierede egenskaber. Således er den anden morfologi manifesteret i 3D lrECM kultur er en solid indikator, der korrelerer med forskellige stadier af malign progression. Sådanne biomimetiske 3D celle modeller giver et stærkt middel til at kvantificere kræftrelaterede biologiske processer. Invasion og metastase er de mest kritiske kendetegnende for kræft, der kan forvandle lokaliseret kræft i en livstruende sygdom [9]. I 3D-kultur, er tumorcelleinvasion manifesteret enten ved enkelte celler eller celleaggregater, der aktivt invadere omgivende ECM, ved hjælp af forskellige former for motilitet (fx amoeboid eller kollektiv invasion) [10]. PC-3 er en af ​​de få PRCA cellelinjer, der viser kollektive invasion træk både

in vitro

in vivo

[7,11]. Sådanne komplekse flercellede processer kan ikke gengives i Anchorage-uafhængig, ikke-klæbende 3D-systemer, der mangler biologisk funktionel ECM, såsom poly-HEMA [12], blød agar [13] eller “hængende-dråbe” kulturer af isolerede spheroids [14] . En nylig undersøgelse viste, at genekspressionsprofiler af brystkræftceller dyrket i 3D lrECM var meget tættere på

in vivo

end monolag eller poly-HEMA kulturer [15]. Højt indhold skærme (HCS) ved hjælp lrECM-baserede platforme er blevet rapporteret for prostata [16], bryst [15], pancreas [17], og ovariecancer [18]. Sådanne grundigt standardiserede og miniaturiserede vævslignende modeller skal systematisk fange effekterne af forbindelser med små molekyler /narkotika, siRNA’er, biologiske (fx antistoffer og peptider), vækstfaktorer eller toksiner på tumorbiologi. Disse komplekse biomimetiske tilgange er nyttige som trofaste prækliniske værktøjer til undersøgelse af kort- og langsigtede narkotika reaktioner, svigt terapi, eller udvikling af resistens [19]. Kombineret med højt indhold mikroskopiske billedbehandling og image-analysemetoder, kan 3D-fænotypiske-modeller også være meget oplysende for bly opdagelse og bly optimering studier (LD eller LO, henholdsvis), navnlig hvis det molekylære lægemiddeltarget er ukendt, og komplekse mekanismer som som vævsspecifik differentiering, og celle-celle-interaktioner kan vurderes på grundlag af uvildig, multiparametric udlæsning. Multiplexing af imaging-baserede udlæsning muliggør også den samtidige vurdering af cytotoksicitet, apoptose, og effekter på den celle cyklus, f.eks ved hjælp af passende fluorescerende prober [2,20], og dermed reducere behovet for overdrevne valideringsundersøgelser. Desuden kan real-time og levende celle 3D-analyser baseret på højt indhold billedanalyse kombineres med endpoint undersøgelser vedrørende udtryk for biomarkører, som beskrevet i tidligere publikationer [7,11].

Naturprodukter ( nationale parlamenter) har været uvurderlig som redskaber til at dechifrere logik biosyntese og som udgangsmaterialer for udviklingslandene forreste linje narkotika [21]. Faktisk har de fleste af nye kemiske enheder, der er godkendt som lægemidler af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) konsekvent været enten nationale parlamenter eller NP-afledte forbindelser [22]. De pentacyclic triterpenoids, sekundære vegetabilske metabolitter rigeligt findes i frugt skræl, blade og stængel bark, har tiltrukket stor interesse som terapeutiske midler og kosttilskud [23,24]. Desuden har semi-syntetiske derivater af de naturligt forekommende triterpenoids været aktivt undersøgt i søgen efter nye anticancer midler, med særligt fokus på anti-invasiv egenskaber [24-29]. Betulin og betulinsyre er lupane-type pentacyclic triterpener rigelige i barken af ​​birk arter af slægten

Betula

L. [30]. Betulinsyre og andre betulinderivater har antivirale, anti-inflammatorisk, anti-malaria, og anti-cancer virkninger [31]. Derudover blev betulinsyre identificeret som en selektiv inducer af apoptose i melanomceller [32], som udløser en stærk interesse i triterpener som anticancermidler. Endvidere betulin fandtes at blokere invasive egenskaber af hjerne og lunge cancerceller, langt under sin cytotoksiske koncentration, hvilket antyder en lovende kemoforebyggende virkning mod metastaser [33]. I den foreliggende undersøgelse har vi anvendt en kombination af 2D og 3D PRCA celle modeller og HCS metoder baseret på billedbehandling og automatiseret billedanalyse, vurdere og validere de antineoplastiske og anti-invasive egenskaber af et bibliotek af 93 forbindelser. I dette bibliotek, har vi inkluderet den parentale forbindelser betulin, betulinsyre (2) og deres semi-syntetiske derivater, og forbindelser fra en anden klasse af terpenoider med mindre undersøgte biologiske virkninger, de abietanes. Samlet set biblioteket bestod 78 betulins og 15 abietanes.

Resultater og Diskussion

syntese af et bibliotek af betulin og abietane derivater

Et sæt af 76 betulinderivater var forberedt start fra betulin og betulinsyre (1), mens 13-derivater blev fremstillet ud fra dehydroabietinsyre og dehydroabietylamide (fig 1-3, se også S1 File), ved hjælp af vores ekspertise på naturlige produkter kemi og efter enten vores tidligere rapporterede procedurer eller andres [ ,,,0],34-37]. Betulonic acid (2) blev opnået fra betulin ved Jones-oxidation, og anvendes som en alsidig mellemprodukt til kemiske synteser. Forskellige substituenter blev indsat i positionerne 3 og 28 i den lupane kerne. Nogle derivater blev også fremstillet ved at fusionere heterocykliske ring A, i positionerne 2 og 3. Andre forbindelser indeholdt en ekstra ring kondenseret til ring C, D og E. Reduktion af isoproprenyl sidekæden af ​​triterpen kerne blev gjort for nogle af derivaterne . Sidekæde-omlejring resulterede også i germanicane-type forbindelser. I abietanes indstille forbindelser fremstillet bestod hovedsagelig af urinstof og amidderivater. Vejviser

højkapacitetsscreening (HTS) for bioaktivitet

Disse forbindelser blev opgjort som en bibliotek og biologisk aktivitet blev testet under anvendelse 2D cellekulturer i 384-brønds plader i højkapacitetsscreening (HTS) format (S1 fig). De anvendte cellelinjer var EP156T (ikke-transformerede prostata epitel), LNCaP (androgen følsomme PRCA), og PC3 (kastrationsresistent, invasive PRCA). Eksperimenterne blev udført i tre forskellige sammensatte koncentrationer (0,1, 1 og 10 uM) i tre eksemplarer ved anvendelse CellTiterGlo som et slutpunkt udlæsning for celleproliferation. Et panel af 25 betulinderivater blev syntetiseret i overensstemmelse med de mest effektive og cancer-specifikke forbindelser identificeret i det foreløbige 2D skærmen, og udvalgt til yderligere undersøgelser.

Høj Content Screening (HCS) for invasionen-blokerende aktivitet

Dernæst disse 25 mest effektive forbindelser blev testet i 3D indstillinger til specifikke anti-invasive egenskaber. Tre standard for pleje forbindelser udbredte mod PRCA blev tilføjet som kontroller; nemlig androgenreceptorantagonist enzalutamide (MDV3100), den C17α-hydroxylase /C

17,20-lyase-inhibitor abiraterone (Zytiga), og den klassiske mitotisk inhibitor paclitaxel. Behandlinger startede på dag 4, hvor godt differentierede runde acini blev etableret. Forbindelse eksponering blev derefter fortsatte i seks dage, hvor de fleste af de ubehandlede flercellede strukturer havde forvandlet til en yderst invasiv fænotype.

Automatiseret morfometriske billedanalyse (AMIDA) og statistisk vurdering

Den levende 3D celle kulturerne blev derefter farvet med reaktive farvestoffer Calcein AM for at detektere levende, og ethidiumhomodimer til påvisning døde celler. Billeder (Fig 4A) er erhvervet med konfokale mikroskop og billeddata blev analyseret med AMIDA software [38]. Principperne for morfometrisk billedanalyse er kort skitseret i S2 Fig.

PC-3 celler blev dyrket i 3D Matrigel ECM i 4 dage og behandlet i 6 dage med 25 betulinderivater (fra 2D højt gennemløb skærme), DMSO /køretøj kontrol, og tre referencestoffer. A) Repræsentative maksimale intensitet fremskrivninger af konfokal mikroskop stak billeder til udvalgte sammensatte behandlinger på 300 nM koncentration (5 × mål, skala 100 um). B) Tre grafer, der viser den relative effekt på tre morfometriske parametre for 7 betulinderivater, DMSO kontrol, og en kontrol forbindelse (paclitaxel). Data, skalering: viser den relative forskel mellem median på område /Kompleksitet /Område Ratio, at DMSO kontrol. Paclitaxel behandlinger og DMSO kontroller er blevet tildelt værdier på -100 og 0, hhv. C) Hierarkisk klyngedannelse blev udført ved hjælp af tre morfologiske parametre afledt af PC3 organoids: klumpformet størrelse (areal), kompleksitet og antallet af døde celler. D) Sårheling kurver for de to betulinderivater 4 og 20, der fremhæver afskæringsniveauet 50% (orange stiplet linje).

Fig 4A viser repræsentative konfokal mikroskop billeder for nogle af betulinderivater . Den meget effektive, antimitotiske narkotikakontrol paclitaxel stod selv ved meget lave koncentrationer (30 og 100 nM), der viser en stærk virkning på alle morfometriske foranstaltninger (Fig 4B): dette resulterede i mindre (reduceret areal), mindre invasive organoids (reduceret kompleksitet ), med øgede mængder døde celler. Den kontrol forbindelser abirateron og enzalutamide havde nogen mærkbar effekt på PC-3 celler. Interessant havde betulinsyre (1) og betulonic acid (2) ikke signifikante anti-invasive virkninger, hvorimod forbindelse 3, der bærer en isopropylgruppe substituent i C19, var en af ​​de mest potente anti-invasiv, vækstinhiberende midler. Tilsvarende isoxazolderivaterne 4 og 5 viste stærk vækst hæmmende og anti-invasive virkninger ved lavere koncentrationer (så lav som 100 nM til 4 og 300 nM for 5). Alle disse effektive forbindelser afviger kun ved position C19: Forbindelse 4 har en isopropylgruppe sidekæde, mens forbindelse 5 har det originale isopropenyl sidekæden. Endvidere, når isoxazolringen af ​​5 blev erstattet med en pyrazolring, er den resulterende forbindelse 6 var endnu mere potent og viste sig at være specifikt anti-invasiv. I modsætning hertil isoxazolderivaterne med en formylgruppe (7) eller en acetoxygruppe (8), et primært amid (9) eller en hydroxy (10) i stilling C28 viste ubetydelige virkninger på den invasive fænotype. Relevansen af ​​den oprindelige carboxylgruppe ved position C28 (betulonic syre, 2) for anti-invasiv eller cytotoksisk aktivitet blev undersøgt ved at erstatte denne gruppe med forskellige amidgrupper. Ingen af ​​disse forbindelser viste signifikante anti-invasive virkninger (11, 12, 13, og 14) (ikke vist). Også sammensatte 15 viste stærke anti-invasive effekter på 1,0 uM uden væksthæmning. Men når dens carboxylgruppe ved C17 blev omdannet til en primær amidgruppe, den resulterende forbindelse 16 havde samme høje niveau af anti-invasive virkninger som forbindelse 15. Derimod derivater med tertiær amid (17) eller nitrilgrupper (18) på C17 var inaktive (ikke vist). To pyridinderivater blev også testet. Intet tab i anti-invasiv aktivitet blev observeret, hvorvidt pyridin nitrogen var støder op til C3 position af den oprindelige lupane skelet (19), eller ved siden af ​​C2 position af lupane skelet (20). Interessant, begge forbindelser 19 og 20 var potent anti-invasiv til betydeligt lavere koncentrationer sammenlignet med forbindelsen 15.

Dernæst statistiske analyser blev udført for at fortolke de komplekse billeddata (Fig 4B og 4C). For enkelhed, vi fokuseret på kun tre, grundlæggende morfologiske parametre fra multiparametric AMIDA udlæsning (Fig 4B): 1) Område (indikerer vækst organoids), 2) strukturelle kompleksitet (som et mål for intensiteten af ​​invasion), og 3) relative areal af døde celler inden organoids (rød signal som et mål for cytotoksicitet eller apoptose). Område (størrelse organoids, fig 4B, øvre panel) blev målt som antallet af pixel i en segmenteret struktur. Den logaritmiske transformation af område /Size data blev brugt, som viste en tæt på Gauss (normal) fordeling i billederne. Shape Kompleksitet (Fig 4B, midterste panel) blev opnået ved hjælp af strukturen størrelse (areal) og omkreds (antal grænserne pixels). Jo mere regelmæssig form af en organoide, jo tættere er det til en perfekt cirkel, hvilket minimerer omkredsen i forhold til at gøre indsigelse størrelse. Vi observerede en tæt lineær afhængighed mellem log (Area) og log (Perimeter), hvilket indikerer en naturlig (funktionel) forholdet mellem disse to funktioner. Montering en regressionslinje til data ført til et nyttigt skøn over den gennemsnitlige omkreds enhver organoide struktur. Afvigelser fra dette gennemsnit (residualer) blev fortolket som et mål for formen kompleksitet organoids. Som en logisk nedre grænse for denne foranstaltning (repræsenteret ved en perfekt cirkel), vi justeret skæringspunktet (højde-niveau) af regressionslinjen at gøre alle returnerede restprodukter som positive tal. Denne forenklede, hurtige mål for den flercellede kompleksitet indikerede, at logaritmen af ​​restprodukter resulterer i en næsten symmetrisk fordeling af værdier. Hierarkisk klyngedannelse, ved hjælp af disse tre grundlæggende foranstaltninger fra PC3 kulturer gav en simpel dendrogram med to hovedgrene: den første klynge omfattede de mest potente anti-proliferative og anti-invasive forbindelser (Fig 4C: gul). Den anden klynge repræsenterer svag (Fig 4C: rød) og ikke-effektive (Fig 4C: grå). Forbindelser

Validering af anti-invasive egenskaber

Baseret på den primære skærm, valgte vi seks betulinderivater til yderligere validering af de anti-invasive virkninger ved yderligere metoder. I en standard sårhelende assay udføres i monolag 2D kultur, effektiviteten af ​​nogle forbindelser var markant anderledes til 3D-indstillinger. For eksempel kan forbindelser 4, og 20 reduceres fuldstændigt invasion i 3D allerede ved 300 nM (fig 4A), men viste kun 50% reduktion af sårlukning efter 64 timer (Fig 4D) ved den samme koncentration. Også forbindelse 5 hæmmede effektivt invasiv transformation af PC-3 sfæroider allerede ved 300 nM i 3D (S3A Fig), målt som “% rundhed” bibeholdt efter 10 dage), men højere koncentrationer end 1 pM var nødvendige i 2D kultur for sammenlignelige effekter (S3B fig). Også de mest potente anti-invasive midler 6, 16 og 19 (der er aktive på 100 nM i 3D betingelser) reducerede sårlukning i 2D kun med 50% ved 3 uM og 1 uM (S3B Fig). Forbindelse 21 er medtaget her som et eksempel for inaktive derivater. Det faktum, at mange forbindelser manglede den samme potens i den konventionelle 2D monolagskultur tyder på, at de biologiske mål eller veje involveret i cellemotilitet er ikke lige aktive i cellemigrering på plastoverflader. Det er også sandsynligt, at celle motilitet i 2D monolagskultur styres af andre mekanismer end kollektiv invasion i en 3D stillads.

Sekundære 3D-skærme.

Dernæst de 25 udvalgte betulinderivater afbildet i fig 1-3, herunder kontrol forbindelser blev igen gennemtestet på tværs af samme panel af prostata-afledte cellelinjer, der allerede anvendes i den indledende, 2D high-throughput skærm. De resulterende dendrogrammer blev enten genereres separat for hver cellelinje (S4 Fig), kombineret i et enkelt dendrogram (Fig 5A), eller vises som reducerede organoide størrelser (område, Fig 5B). I de ikke-invasive, men hormon-følsomme LNCaP organoids, de fleste sammensatte effekter var relativt milde. Ikke-effektive behandlinger omfatter størstedelen af ​​grafen (S4 Fig: grå), medens de få effektive forbindelser falder i to forbundne grene (gul og rød). Som forventet, androgen antagonist enzalutamide men ikke abirateron var blandt de effektive behandlinger. Paclitaxel klynger sammen med betulinderivater ved højere koncentrationer-disse forbindelser var også effektive på hormon resistent, invasive PC-3 celler. Den dendrogram for hormon afhængige, ikke-invasiv LAPC-4 (s4b Fig) viser igen effektiviteten af ​​alle positive kontroller (abiraterone, enzalutamide og paclitaxel, inden gule og røde klynger). De mest aktive betulinderivater igen falder inde i disse samme klynger (3, 4, 6, 16, 19 og 20) tilstødende positive kontroller. I modsætning til PRCA cellelinjer, den ikke-transformerede, normal-lignende Ep156T cellelinje (S4C Fig) reagerede også på betulonic acid (2), i det mindste ved den højeste koncentration. I almindelighed, som med LNCaP og LAPC4 celler, virkningerne på Ep156T vækst var milde (Fig 5B).

Eksperimentelle betulinderivater og kontrol forbindelser blev testet på tværs af et panel af prostatakræft linjer (LNCaP, LAPC-4) og ikke-transformerede, prostata epitelceller (EP156T) i 3D kultur. A) dendrogram er baseret på tre morfologiske parametre og kombinerer alle data fra primære og sekundære 3D skærme. Effektive forbindelse behandlinger er angivet i rød og gul, gul er den mest invasion-specifik. B) Boxplots viser virkningen af ​​udvalgte forbindelser på klumpformet størrelse (Area). Data, skalering:. Som beskrevet i fig 4 C) Virkninger af alle betulinderivater og kontrol forbindelser på celledød (antal døde celler)

For at hjælpe funktionel kategorisering af vores betulinderivater, vi kombineret alle data i en enkelt dendrogram, vist i fig 5A. Desuden multiparametric repræsentation af alle eksperimentelle data som en enkelt Heatmap er meget informative (S5 Fig) og en potent måde at illustrere virkningerne af forbindelser på væksten, strukturel kompleksitet og celledød tværs af flere cellelinier. Vi delte forbindelserne og kontroller i tre klynger: 1) væksthæmmende forbindelser, 2) stærke og svage anti-invasive forbindelser, og 3) inaktive forbindelser. De morfologiske virkninger i 3D kultur er opsummeret i S6 Fig de mest potente anti-invasive virkninger (på PC-3-celler) blev vist ved hjælp af forbindelser 3, 4, 6, 15, 19 og 20, ved koncentrationer på 300 nM eller lavere (med undtagelse af forbindelse 15), uden nogen mærkbar effekt på de andre cellelinjer. De fleste af disse forbindelser er imidlertid viste vækstinhiberende virkninger i alle cellelinier i koncentrationer på 1 uM eller højere. Afslutningsvis mange betulinderivater er cytotoksiske og inhiberer cellevækst ved høje koncentrationer ( 1 uM). Men ved lavere koncentrationer, kan disse forbindelser virke som potente og specifikke inhibitorer af celle invasion og motilitet.

Estimering af anti-invasiv vs cytotoksisk aktivitet.

For at udelukke, at cytotoksiske og antimitotiske effekter blev misforstået som anti-invasiv, vi testede forbindelser 4, 5, 6, 19 og 20 for inhibering af proliferation og induktion af celledød i en 2D monolagskultur (opsummeret i figur 6). En bred vifte af forbindelseskoncentrationer (1 nM til 30 uM) blev anvendt til PC-3, LNCaP og Ep156T cellelinjer, og analyseres med det PerkinElmer Operetta højinformativ imager. I PC3 celler, har de fleste forbindelser ikke vise mærkbare virkninger på proliferation ved koncentrationer lavere end 10 uM (Fig 6A). LNCaP-celler var mere følsomme, med væksthæmning /cytotoksicitet begyndende ved 3 uM. Virkningerne på ikke-transformerede, apoptose-følsomme Ep156T celler stærkest. Her blev cytotoksiske virkninger typisk observeres allerede ved 0,3-1 uM. Ingen af ​​forbindelserne specifikt induceret celledød i PC-3 eller LNCaP-celler ved koncentrationer under 30 uM (Fig 6B og 6C, undtagen Forbindelse 19). Vi yderligere beregnede EF

50 værdier for spredning, apoptose og celledød for hver forbindelse, ved hjælp af PerkinElmer Harmony-softwaren (metodevalidering vist i S7 Fig). Den eneste assay, der produceres resultater konsistente med dem af de testede i 2D cellekulturmodel betulinderivater var proliferationsassayet (tabel 1).

A) Celleproliferation /celleantal, B) programmeret celledød (apoptose ), og C) antallet af døde celler blev vurderet ved traditionelle analyser, kombineret med høj-indhold mikroskopi (Operetta). Celler blev behandlet med de fem mest effektive betulinderivater, herunder paclitaxel kontrol i 72 timer. Proliferation blev målt som det samlede antal kerner (= celler), apoptose som forholdet mellem caspase-3 positive versus alle celler, og celledød som ethidiumhomodimer-2 positive kerner versus alle celler.

virkninger på cellecyklusprogression og mitose

Vi næste testet, hvis betulinderivater havde særlige virkninger for cellecyklusprogression og mitose ved koncentrationer på 300 nM (ikke vist) og 1 uM i 2D kultur (fig 6D og S8 fig). Der var ingen tydelige forskelle i cellecyklusprogression som respons på nogen af ​​de testede forbindelser. Vi vurderede også celledeling og mitose ved at måle PCNA og cyklin B1 protein niveauer (S8B Fig). Som forventet viste betulinderivater ingen virkning på ekspressionen af ​​enten protein ved den testede koncentration. Disse resultater igen støtter, at betulinderivater kun cytotoksiske eller forårsager DNA-skader ved høje koncentrationer (PRCA EF

50 værdier spænder fra 1 til 90 uM), mens de fremmer betydelige anti-invasiv effekter ved lave koncentrationer nanomolære.

mulig mekanisme (r) virkning af de betulinderivater.

for at belyse mulig virkningsmekanisme for vores betulinderivater, brugte vi en phospho-kinase array, der kvantitativt registrerer phosphoryleringsniveauerne af 43 kinaser i cellelysater (Fig 7). Lysater blev udvundet fra 3D cellekulturer af PC-3 celler, og udsat for betulin–afledte forbindelser for korte (4 timer) eller langvarig (6 dage) perioder. Til disse undersøgelser, valgte vi de to repræsentative derivater 5 og 20, da de mest specifikke, mindst cytotoksiske inhibitorer af celle invasion. Den kortsigtede (4 h) eksponering er udført ved en relativt høj koncentration af 1 uM, mens der for den langsigtede (6 d) eksponering, en koncentration på kun 300 nM blev anvendt; både et godt stykke under den cytotoksiske EF

50 værdier (10 um for forbindelse 5 og 67 uM for forbindelse 20). De kinase arrays blev også kvantificeret ved billedanalyse densitometri (figur 7A). Phosphorylering niveauer af fire kinaser, i både korte og lange eksponeringer, var klart reduceret: STAT3 (Y727), c-Jun (S63), eNOS (S1177) og PLC-γ1 (Y783) (fig 7A øverste og nederste paneler) . Begge forbindelser også reduceret p53 (S15) fosforylering på kortvarig eksponering og p70 S6 kinase (T389), p53 (S 392) og pyk2 (Y402) fosforylering i eksponeringen 6-d, og øget AMPKa1 (T174) phosphorylering. Compound-specifikke effekter for stoffet 20 omfattede forskellen fosforylering af Hck (Y411), pan-JNK, GSK-3α /β (S21 /S9), STAT3 (Y705) og WNK1 (T60) sites. Akt (S473) phosphorylering blev kun hæmmet af eksponering 6-d. Forbindelse 20 også øget phosphorylering af mTOR (S2448), Fyn (Y420) og Src (Y419). I modsætning hertil havde forbindelse 5 ikke forårsage nogen specifikke ændringer i kinase aktivitet i eksponeringen kortvarig, og viste kun få tydelige ændringer i langtidsbehandling. Mest bemærkelsesværdigt var Akt (T308) fosforylering også afskaffet næsten udelukkende som reaktion på eksponering med forbindelse 5, hvorimod phosphorylering af p53 sites S46 og S 392 konsekvent blev reduceret (figur 7A). Reduktionen af ​​AKT-aktivitet med begge forbindelser blev valideret ved western blotting under anvendelse af en uafhængig, p-AKT specifikt antistof (Fig 7B). De korte behandlinger forårsaget kun beskedne ændringer med en maksimal reduktion af protein phosphorylering med 2 gange (20: GSK-3α /β S21 /S9 og STAT3 Y705). Phosphorylering niveauer af kun tre kinaser blev ændret mere end to gange i de langsigtede engagementer, nemlig AKT (T308), p53 (S46) og eNOS (S1177), forårsaget af nanomolære koncentrationer af forbindelse 5. Forbindelse 20 havde meget mindre dramatisk virkninger på kinase-phosphorylering sammenlignet med forbindelse 5, på trods af dens generelt mere udtalte anti-invasive virkninger. Sammenfattende observerede den reducerede AKT og p53 aktivitet samt de ændrede phosphoryleringsniveauerne af flere proteiner, herunder eNOS, pan-JNK, og GSK-3α /β, foreslår decelereret cellemetabolisme eller nedsat levedygtighed celle.

PC -3 sfæroider blev udsat for to repræsentative betulinderivater, 5 og 20, i 4 timer (ved 1 uM) og 6 dage (0.3 uM). A) Computational kvantificering af signalintensiteter fra kinase arrays, opstillet ved fold observerede ændringer (venstre til højre). B) Western blot af total og phospho-Akt (S473) vist for både kort og lang tids udsættelse for 20 og 5.

Vi udforskede også de 3D flercellede morfologier af PC-3, LNCaP og Ep156T sphæroider udsat for de 5 udvalgte betulinderivater både korte og lange perioder af 4 timer og 6 dage. Fra en detaljeret analyse af F-actincytoskelettet (phalloidin farvning), blev det klart, at forbindelser 5, 6, 15 og 20 effektivt forstyrret tilrettelæggelsen af ​​actincytoskelettet efter 48 timers eksponering (Fig 8A). Interessant nok blev en næsten identisk actin “proptrækker” fænotype ses i normale Ep156T acini og PC-3 sfæroider (Fig 8A: forstørrelse panel til højre) mens den typiske kortikale actin organisation i LNCaP sfæroider forblev intakt. Dette antyder, at disse betulinderivater kan målrette relevante veje i acinar morfogenese og dynamiske processer, der er involveret i celle motilitet (også EP156T celler danner dynamisk “forgrening” strukturer, der trænger ECM). For fænotypiske sammenligninger, vi testede et panel af referencestoffer målrettet Akt, Rac, ROCK, Src, og andre veje, i store træk er knyttet til actincytoskelettet. Ingen af ​​de testede kontrolforbindelser påvirkede cytoskelettet i en tilsvarende måde, med undtagelse af den ikke-specifikke, pan-kinaseinhibitor staurosporin. Men disse effekter var ikke ensartet på tværs af panel af cellelinjer (Fig 8B, forstørrelse til højre).

aktincytoskelettet (trådformede eller F-actin) farves grøn (phalloidin), kerner med et rødt farvestof (