PLoS ONE: Metformin radiosensibiliserer p53-Mangelfuld Kolorektal Cancer celler gennem Induktion af G2 /M Arrest og hæmning af DNA Repair Proteins

Abstrakt

Den foreliggende undersøgelse rettet om kombinationen af ​​metformin og ioniserende stråling (IR) ville Vis forbedret antitumor effekter i radioresistente p53-mangelfulde kolorektal cancer celler, med fokus på reparation veje for IR-induceret DNA-skader. Metformin forårsagede en større reduktion i klonogene overlevelse samt større strålingssensibilisering og hæmning af tumorvækst af p53

– /- end af p53

+ /+ kolorektal cancer celler og xenotransplantater. Metformin kombineret med IR inducerede akkumulering af tumorceller i G2 /M-fasen og forsinket reparation af IR-induceret DNA-beskadigelse. Derudover denne kombination signifikant reducerede niveauer af p53-relaterede homolog rekombination (HR) reparation sammenlignet med IR alene, især i p53

– /- colorektale cancerceller og tumorer. Afslutningsvis metformin forbedrede radiosensitivitet ved at inducere G2 /M anholdelse og reducere ekspressionen af ​​DNA reparation proteiner selv i radioresistente HCT116 p53

– /- kolorektal kræftceller og tumorer. Vores undersøgelse giver et videnskabeligt rationale for den kliniske anvendelse af metformin som strålingssensibilisator patienter med p53-mangelfulde kolorektale tumorer, som ofte er resistente over for strålebehandling

Henvisning:. Jeong YK, Kim MS, Lee JY, Kim EH , Ha H (2015) Metformin radiosensibiliserer p53-mangelfuld Kolorektal Cancer Cells gennem Induktion af G2 /M Arrest og hæmning af DNA Repair Proteiner. PLoS ONE 10 (11): e0143596. doi: 10,1371 /journal.pone.0143596

Redaktør: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: April 3, 2015; Accepteret: November 6, 2015; Udgivet: 23 November, 2015

Copyright: © 2015 Jeong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. arbejdet blev støttet af følgende: 1. MSK: tilskud (50.541 til 2014) fra Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidige planlægning, Republikken Korea (http: //www.msip.go.kr); og 2. HH: National Research Foundation tilskud (2012R1A2A1A0300692) finansieret af koreansk Ministeriet for Undervisning, Videnskab og Teknologi. (https://www.nrf.re.kr)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Strålebehandling er meget udbredt for den endelige og adjuverende behandling af en lang række kræftformer [1]. Men modstanden mod strålebehandling fortsat et vigtigt problem [2]. Forskellige faktorer, herunder p53 mutation [3], overekspression af DNA-reparationsmekanismer proteiner [4-6], og tumor mikromiljø [7, 8] er blevet foreslået at spille roller i radioresistance. Blandt de radioresistente faktorer, er p53 mutation anses for god kandidat til radioresistance markører [9].

tumor suppressor faktor p53, som spiller en central rolle i de cellulære reaktioner på DNA-skade, fremmer celleoverlevelse (celle- cellecyklusstandsnings, DNA-reparation, og autofagi) ved lave niveauer af DNA-skader, mens det inducerer celledød i høje niveauer. Mutation af p53 forekommer i mere end 50% af humane cancere, hvilket øger cellulær resistens over for y-stråling [10]. Derudover p53 mutation korrelerer med høje niveauer af DNA-reparation proteiner, herunder RAD51, der spiller en central rolle i DNA homolog rekombination (HR) reparationsvej. Desuden er RAD51 opreguleret i talrige cancere, især høj kvalitet radioresistente tumorer [11]. HR reparation vej moduleres af p53-induceret transkriptionel repression af

RAD51

gen og ophævelse af RAD51 polymerisering på DNA [12]. Derfor radioresistance korrelerer med overekspression af RAD51 [13], mens dets nedregulering omvendt øger radiosensitivitet [14]. Derfor er en lovende tilgang til at øge effekten af ​​strålebehandling hos patienter med p53 mutant kræftformer er opdagelsen og anvendelsen af ​​DNA-reparation-hæmmere som radiosensibilisatorer.

Metformin, en oral biguanid anti-hyperglykæmiske middel, efter sigende forbedrer reaktioner på stråling ved at aktivere ataxi telangiectasia muteret (ATM) adenosin monophosphat kinase (AMPK) p53 /p21

CIP1, hvilket fører til apoptose og hæmning af klonogene overlevelse [15, 16] i visse kræftformer. Desuden er kombinationen af ​​metformin og ioniserende stråling (IR) forbedret de cytotoksiske virkninger af IR i humane hepatoma cellelinier, som blokerede G2 /M-fasen og nedsat DNA-reparation ved at reducere adenosintriphosphat (ATP) produktion [17]. Interessant, Buzzai

et al

. [18] rapporterede, at metformin selektivt svækket cellevækst i p53-deficiente tumorceller ved at inhibere autofagi, men aktiveret autofagi i p53 vildtype-tumorceller. Endvidere har flere undersøgelser vist, at metformin øger radiosensitivitet i p53-mutant eller p53 vildtype-cancerceller. Undersøgelser har også rapporteret, at metformin forøgede radiosensitivitet af p53-mutant [19] og p53 vildtype cancerceller. Desuden viste en anden undersøgelse, at metformin inducerede en moderat strålingsbeskyttelse [20]. Der er imidlertid ikke nogen klar forståelse af de forskellige virkninger af metformin kombineret med strålebehandling i p53-deficiente og p53 vildtype-cancerceller.

Derfor er denne foreliggende undersøgelse undersøgte, om metformin kombineret med IR ville øge antitumorvirkninger i radioresistente p53-mangelfulde kolorektale cancerceller. Derudover har vi fokuseret på den mulige inddragelse af reparation veje for IR-induceret DNA-skader. Vi mener, at vores data kan bidrage til at give en videnskabelig begrundelse for den kliniske anvendelse af metformin som strålingssensibilisator i radioresistente kræftformer.

Materialer og metoder

Materialer

Metformin (1- (diaminomethylidene) -3, 3-dimethylguanidin), krystalviolet, og propidiumiodid blev erhvervet fra Sigma-Aldrich Chemical Corp., (St. Louis, MO, USA). Anti-RAD51, anti-RAD52, anti-excision reparation cross-komplementering gruppe 1 (ERCC1), anti-brystcancer 2, early onset (BRCA2), og anti-phosphoryleret-histon H3 (Ser10) antistoffer blev indkøbt fra Abcam (Cambridge , MA, USA). Anti-meiotisk rekombination 11 (MRE11), anti-RAD50, anti-P95 /Nijmegen brud syndrom protein 1 (NBS1), anti-BRCA1, anti-cyclinB1, anti-fos- celledelingscyklussen protein 2-homolog (cdc2, Tyr15), og anti-phospho- checkpoint kinase 2 (Chk2, Thr68) blev opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Anti-p53, anti-Chk2, anti-

β

actin, og peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret gede-anti-kanin og anti-mus IgG-antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti H2A histon familie, medlem X (H2AX, Ser139) blev leveret af Millipore (Billerica, MA, USA). Alexa Fluor 488 ged anti-mus IgG (H + L) og Alexa Fluor 594 ged anti-kanin IgG (H + L) sekundære antistoffer blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Fluorescensmonteringsmedium blev opnået fra Dako (Glostrup, Danmark). Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, føtalt bovint serum (FBS), og antibiotika (penicillin og streptomycin) blev opnået fra Lonza (Walkersville, MD, USA).

cellelinier og cellekultur

HCT116 p53

+ /+ humane kolorektal cancer celler blev opnået fra den koreanske cellelinje Bank (Seoul, Sydkorea) og HCT116 p53

– /- menneskelige kolorektal cancer celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. B. Vogelstein af Johns Hopkins University. HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og inkuberet i en atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

Bestråling

for

in vitro

eksperimenter blev cellerne bestrålet med en

137Cs γ-ray kilde (Atomic Energy of Canada, Ltd., Chalk River, Ontario, Canada) ved en dosishastighed på 2,67 Gy /min. For

in vivo

eksperimenter blev mus bestrålet ved hjælp af en

60Co γ-ray kilde (Theratron 780, Atomic Energy of Canada, Chalk River, Ontario, Canada) med en bolus af væv tilsvarende materiale 0,5 cm i diameter at give mulighed for dosis oprustning. En ledende barriere blev anvendt til at beskytte normale væv, hvor det er muligt.

Vandopløseligt tetrazolium (WST-1) assay

I cytotoksicitetsassayet, celler blev podet i 96-brønds kultur plastplader på en densitet på 1 x 10

3 celler pr. Metformin i varierende koncentrationer (0-10 mM) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i 48 timer efterfulgt af anvendelsen af ​​den vandopløselige tetrazolium (WST) -1 cytotoksicitet assayreagens (Roche Diagnostics, Laval, Quebec, Canada) ifølge producentens anbefalinger. Cellelevedygtighed blev vurderet ved at bestemme A450 nm af celledyrkningsmediet efter tilsætning af WST-1 i 2 timer. Resultaterne blev rapporteret som en procentdel af den optiske densitet af ubehandlede kontrolceller, som blev betegnet som 100% cellelevedygtighed. Procentdel af cytotoksicitet blev beregnet som følger: (1-AEXP /Acon) × 100; hvor AEXP og aBetjeningspanel er absorbansværdierne af de eksperimentelle lægemiddel-behandlede og styrer un-behandlede celler.

Klonogen assay

HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler blev behandlet med metformin ved 1-10 mM i 48 timer eller 2,5 mM i 24 timer efterfulgt af IR, og derefter yderligere inkuberet i 24 timer. Den klonogene assay blev derefter udført som tidligere beskrevet [17].

tumorxenotransplantater i athymiske mus Salg

athymiske Balb /c nøgne mus (4 uger gamle hanner) blev opnået fra Nara Biotech Co . (Seoul, Korea) og holdes i en laminar luftstrøm skab under specifikke patogenfrie betingelser. HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- xenograft musemodeller blev oprettet ved subkutan podning af 3 × 10

6 HCT116 p53

+ /+ eller p53

– /- celler i den højre bagben. Efter tumorimplantation, vi overvågede dyrenes tilstand en gang om dagen og færdiglavede analgetika for at minimere lidelser af dyrene. Når tumoren nået et volumen på ca. 100 mm

3, blev musene tilfældigt inddelt i fire grupper (n = 5), der indbefatter (a) kontrol, (b) metformin, (c) IR, og (d) kombination af metformin og IR. Metformin-behandlede grupper (B og D) blev injiceret (intraperitonealt) en gang dagligt med 250 mg /kg.

Når tumorvolumen i kontrolgruppen opnåede 200 mm

3, IR-behandlede grupper (c og d) blev behandlet med en enkelt 5 Gy brøkdel af lokal-regional bestråling ved hjælp af en

60Co bestråler. Tumoren volumen (V) blev beregnet ved hjælp af standardformlen: V (mm

3) = π /6 × (mindre diameter)

2 × (større diameter). Mus blev aflivet ved kuldioxid (CO

2) indånding, når det gennemsnitlige tumorvolumen i kontrolgruppen var 1.000 mm

3.

Cell cyklus analyse

Efter metformin (2,5 mM) eksponering i 24 timer blev cellerne bestrålet, inkuberet i 24 timer eller 48 timer, høstet, farvet med propidiumiodid (1 mg /ml) ifølge fabrikantens protokol, og derefter analyseret ved anvendelse af et FACScan flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Et minimum på 10.000 celler blev talt for hver prøve og dataanalyse blev udført under anvendelse af CellQuest software.

Immunofluorescens

Immunfluorescensfarvning blev udført for at bestemme den nukleare fordeling af γ-H2AX og RAD51 i HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler ved hjælp billedanalyse i de tre (grøn /rød /blå) fluorescens-kanaler. Celler blev dyrket på kamre objektglas 1 dag før bestråling eller metformin behandlinger. Efter metformin (2,5 mM) eksponering i 24 timer, blev cellerne bestrålet og inkuberet i 1 time eller 24 timer. Alle behandlinger blev udført, mens celler forblev fæstnet til objektglassene. Cellerne blev fikseret (4% paraformaldehyd i phosphatbufret saltvand, PBS, 10 min), permeabiliseret (0,5% Triton X-100 i PBS, 10 min) og inkuberet med blokeringsbuffer (4% FBS i PBS, 1 h) og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C eller i mere end 4 timer ved stuetemperatur med primære antistoffer (1: 100 hver, anti-γ-H2AX og anti-RAD51), derefter blev cellerne vasket med PBS, inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i mørke, med passende fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærkede sekundære antistoffer (1: 500 hver) herunder Alexa Fluor 488 ged anti-mus IgG (H + L) til γ-H2AX (grøn) og Alexa Fluor 594 gede-anti-kanin IgG (H + L) for RAD51 (rød). Cellerne blev derefter vasket med PBS, farvet med DAPI (blå), og monteret på objektglas under anvendelse Fluorescensmonteringsmedium. Objektglassene blev endelig undersøgt under anvendelse af et Carl Zeiss LSM510 laser scanning mikroskop og billeder blev taget med et ladningskoblet kamera. Til kvantitativ analyse blev γ-H2AX eller RAD51 foci-positive celler talt i mindst 100 celler fra tilfældigt optagne billeder.

immunblotting

Cellerne eller tumorvæv blev lyseret med en radioimmunpræcipitationsanalyse ( RIPA) buffer, og proteinerne blev separeret ved anvendelse af natriumdodecylsulfat (SDS) polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blots blev blokeret med 5% (v /v) skummetmælk i PBS med 0,1% Tween 20, inkuberet med de angivne antistoffer (1: 1.000) og sekundære antistoffer (1: 1.000), og derefter udviklede derefter under anvendelse forøget kemiluminescens western blotting substrat (Pierce, Rockford, IL, USA) under anvendelse af ImageQuant LAS-4000 mini (GE, Fairfield, CT, USA). Signalet Intensiteten af ​​båndene blev målt med ImageJ program (National Institutes of Health, NIH, Bethesda, MD, USA).

Immunhistokemi

For immunhistokemisk analyse, 4-um tumor vævssnit blev de-paraffinized med xylen og sekventielt rehydreret i en serie af graduerede koncentrationer af ethanol. For at reducere ikke-specifik baggrundsfarvning skyldes endogen peroxidase blev objektglassene blokeret i hydrogenperoxid i 10 minutter og vasket fire gange i buffer. Den ERCC1 (1:50) og RAD51 (1: 200) primære antistoffer blev anvendt til vævet objektglas, som blev inkuberet ifølge fabrikantens protokoller, og derefter vasket fire gange i buffer. Objektglassene blev inkuberet med primært antistof enhancer i 20 minutter ved stuetemperatur og vasket fire gange i buffer. Derefter blev HRP polymer anvendes til objektglassene, og farven blev udviklet ved hjælp af Zymed diaminobenzidin (DAB) System (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA, USA) efterfulgt af modfarvning med hematoxylin. De histologiske scorer for RAD51 og ERCC1 ekspression blev bestemt ved anvendelse af to uafhængige metoder:. Procentvise positiv farvning celler og ekspression intensitet

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middelværdien ± standardfejl på middelværdien (SEM). Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af en parametrisk gentaget foranstaltning envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukey ærlig signifikant forskel (HSD) test ved hjælp af den statistiske pakke for samfundsvidenskaberne (SPSS) software (version 18.0, Chicago, IL, USA ). Statistisk signifikans blev fastsat på et niveau på

s

0.05.

Etik erklæring

Alle dyr forsøgsprotokoller og undersøgelser blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af den koreanske institut for radiologiske og Medical Sciences (KIRAMS 2013-57) .

Resultater

metformin differentielt nedsat p53-mangel og vildtype klonogene celleoverlevelse

For at evaluere metformin-p53-afhængig clonogenicity og cytotoksicitet i humane kolorektale cancerceller, vi udsættes HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler i varierende koncentrationer i 48 timer. Metformin ved 1, 2,5, 5, og 10 mM viste 86,7 ± 5,9, 73,2 ± 3,8, 45,5 ± 1,1, og 26,8 ± 2,7% klonogene overlevelsesrater for HCT116 p53

+ /+ celler, og 77,2 ± 6,9, 35,5 ± 3,6, 13,1 ± 2,1, og 2,3 ± 0,9% for HCT116 p53

– /- celler, (fig 1A). Klonogen overlevelse HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler afveg markant ved metformin koncentrationer 2,5-10 mM (

s

0,001), og HCT116 p53

– /- celler var mere følsomme over for metformin-induceret klonogenisk celledød end HCT116 p53

+ /+ celler. Imidlertid metformin havde ingen signifikant eller differential cytotoksicitet mod begge cellelinier (figur 1B)

HCT116 p53

+ /+ og p53

-. /- Celler blev behandlet med 1-10 mM metformin til 48 timer, dyrkede og anvendt i (A) klonogene og (B) WST-1 (celle levedygtighed) assays; *

s

0,001 for HCT116 p53

+ /+ celler,

†

s

0,001 for HCT116 p53

– /- celler.

§

s

0,001, mellem HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler sammenlignet med kontrol. WST, vandopløselig tetrazolium.

metformin fremkaldt højere strålingssensibilisering i p53-mangel end p53 vildtypeceller

For at vurdere de strålingssensibiliserende virkninger af metformin, HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- cancerceller blev behandlet i 24 timer med 2,5 mM efterfulgt af IR, og derefter fjernet 24 timer efter IR. De overlevende fraktioner efter udsættelse for en 2 Gy strålingsdosis (SF2) blev bestemt til at være 0,24 og 0,20 for HCT116 p53

+ /+ -celler (fig 2A) og 0,58 og 0,43 for HCT116 p53

– /- celler ( fig 2B), efter behandling med stråling alene og metformin plus stråling, henholdsvis. Kombinationen af ​​metformin og IR markant reduceret klonogen overlevelse sammenlignet med IR alene i HCT116 p53

– /- (

p

0,01), men ikke p53

+ /+ celler, hvilket antyder, at strålingssensibilisering var højere i HCT116 p53

– /-. end i p53

+ /+ celler

radiosensitivitet af (A) HCT116 p53

+ /+ og (B) p53

– /- celler med og uden eksponering for metformin (2,5 mM) efter varierende doser af

60Co γ-ray stråling blev målt under anvendelse af et klonogent assay. HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- xenotransplanterede mus blev tilfældigt opdelt i fire grupper, herunder kontrol (Con), metformin (Met), ioniserende stråling (IR), og kombinationen af ​​metformin og IR (Met + IR). Kurver viser tumorvolumen i (C) HCT116 p53

+ /+ og (D) p53

– /- xenograftmodel; *

s

0.05.

Metformin hæmmede tumorvækst i p53-mangelfuld xenografter

For at undersøge virkningerne af metformin på p53-afhængig og uafhængig tumorvækst, vi brugte parret isogene menneske kolorektal HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- kræftceller. Når gennemsnittet af tumorvolumen i kontrolgruppen opnåede omkring 1.000 mm

3, xenotransplantaterne af tumorvolumen hos mus behandlet med metformin, IR, og en kombination af begge var 4,5 ± 0,2, 48,3 ± 6,1, og 59,0 ± 5,0% mindre, henholdsvis end kontrollerne på omkring 1.000 mm

3 til HCT116 p53

+ /+ tumorer (fig 2C) og 26,5 ± 1,1, 22,8 ± 2,9, og 44,3 ± 5,5%, henholdsvis for HCT116 p53

– /- tumorer (fig 2D)

væksten i kontrol HCT116 p53

-. /- xenografter var betydeligt hurtigere end den HCT116 p53

+ /+ xenotransplantater var (

s

0,05). Den kombinerede metformin og IR behandling hæmmede signifikant tumorvækst af både xenograftmodeller mere end IR behandling alene gjorde (

s

0,05). Desuden metformin forbedrede antitumor effekter i p53

– /- (

s

0,05), men ikke p53

+ /+ xenografter mens IR alene markant undertrykt tumorvækst i p53

+ /+ xenografter (

s

0,05).

metformin forlænget IR-induceret G2 /M anholdelse i p53-mangelfulde kolorektale celler sammenlignet med p53 vildtype celler

til bestemme, om metformin påvirket IR-induceret cellecyklus akkumulering i G2 /M-fasen og andelen af ​​G2 /M-fase celler associeret i nærvær eller fravær af p53, analyserede vi cellecyklus fase fordeling af HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler. Metformin kombineret med IR steg markant andelen af ​​G2 /M-fase celler sammenlignet med IR alene i HCT116 p53

– /- (

s Salg 0,001), men ikke p53

+ /+ -celler (fig 3A og 3B)

HCT116 p53

+ /+ og p53

-. /- celler blev forbehandlet med 2,5 mM metformin i 24 timer, og derefter bestrålet med 6 Gy. Celle cyklus målt ved flowcytometri (A) 24 og (B) 48 timer efter IR. (C) Ekspression af G2 /M checkpoint regulatorer herunder cyclin B1, phosphoryleret cdc2 (Tyr15), phosphorylerede histon H3 (Ser10), og phosphoryleret Chk2 (Thr68) blev målt ved anvendelse immunoblotting i HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler 48 timer efter bestråling. Densitometrisk kvantificering blev normaliseret til

β

actin. Værdier er middelværdi ± SEM. af tre eksperimenter, *

s

0,001. IR, ioniserende stråling

For at bekræfte ophobning af G2 /M-fasen, ekspressionsniveauerne af G2 /M checkpoint regulatorer såsom cyclin B1, phosphoryleret cdc2 (Tyr15), phosphoryleret histon H3 (Ser10), og phosphoryleret Chk2 (Thr68) blev undersøgt under anvendelse af immunblotting. Kombinationen af ​​metformin og IR steget markant udtryk for fosforyleret cdc2 (Tyr15) sammenlignet med IR alene i HCT116 p53

– /- men ikke p53

+ /+ celler (

s

0,05 ). Desuden metformin plus IR markant forøget ekspression af fosforyleret histon H3 (Ser10) og phosphoryleret Chk2 (Thr68) sammenlignet med IR alene i HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler. Derudover blev udtryk for fosforyleret histon H3 (Ser10) og phosphoryleret Chk2 (Thr68) i metformin plus IR gruppe steget betydeligt i HCT116 p53

– /- sammenlignet med p53

+ /+ celler (

p

0,001, figur 3C). Sammenfattende viste vi, at metformin forhindrede cellecyklusprogression ved signifikant at forlænge IR-induceret G2 /M anholdelse i HCT116 p53

– /-. Celler

Metformin forsinket reparation af IR-induceret DNA skader i p53 deficiente celler sammenlignet med den i p53 vildtypeceller

Vi analyserer virkningen af ​​metformin på kinetikken for DNA-skader og reparation ved at vurdere immunfluorescensfarvning for γ-H2AX, en markør for DNA-skader; RAD51, en markør for DNA-reparation; og DAPI-farvet kerne-DNA ved hjælp af billedanalyse i de tre (grøn /rød /blå) fluorescens-kanaler. Metformin kombineret med IR og IR alene udviste γ-H2AX foci ved 6 timer efter IR mens metformin kombineret med IR beholdt γ-H2AX foci i op til 24 timer efter IR. Desuden denne effekt var større i HCT116 p53

– /- end den var i p53

+ /+

celler (

s

0,001). Imidlertid 6 og 24 timer efter IR, metformin kombineret med IR viste et signifikant fald i RAD51 foci sammenlignet med IR alene, hvilket viste en stigning i RAD51 foci. (Fig 4A og 4B). HCT116 p53

– /- celler var mere følsomme over for metformin end HCT116 p53

+ /+ celler (

s

0,001). Disse resultater viste, at kombinationen af ​​metformin og IR forsinket reparation af IR-induceret DNA-beskadigelse mere i HCT116 p53

– /-. End i p53

+ /+

celler

HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler blev forbehandlet med 2,5 mM metformin i 24 timer, og derefter bestrålet med 6 Gy. (A) Immunfluorescensfarvning ved 6 og 24 timer efter IR viste γ-H2AX, en markør for DNA-skader; RAD51, en markør for DNA-reparation; og nuklear DNA farvet med DAPI hjælp billedanalyse i tre (grøn /rød /blå) fluorescens-kanaler. (B) Til kvantitativ analyse γ-H2AX eller RAD51 foci-positive celler blev talt i mindst 100 celler fra tilfældigt optagne billeder. Værdier er gennemsnit ± S.E.M, *

s

0,001. IR, ioniserende stråling; γ-H2AX, γ-H2A histon familie, medlem X.

Metformin forbedret radiosensitivitet ved at reducere DNA reparation proteiner

in vitro

in vivo

for at undersøge om metformin påvirket DNA reparation veje

in vitro

, undersøgte vi ekspressionen af ​​p53-relaterede HR reparation proteiner, herunder MRE11-RAD50-P95 /NBS1 komplekse, BRCA1, BRCA2, RAD51, RAD52, og ERCC1 i HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler ved hjælp af immunoblotting. Som vist i figur 5, metformin kombineret med IR markant reduceret MRE11, BRCA2, RAD51, og ERCC1 proteinniveauer sammenlignet med IR alene i HCT116 p53

+ /+ og især p53

– /- celler (

s

0,01). Desuden metformin kombineret med IR faldt betydeligt udtryk for RAD50 og BRCA1 sammenlignet med IR alene i HCT116 p53

– /- men ikke p53

+ /+ celler (

s

0,01). Interessant nok i HCT116 p53

– /- celler, IR alene signifikant øget BRCA1 og RAD51 proteinniveauer sammenlignet med kontrolgruppen (

s Restaurant 0,01), mens metformin kombineret med IR markant nedsat ekspression af BRCA1 og RAD51 sammenlignet med IR alene (

s

0,01)

HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler blev forbehandlet med 2,5 mM metformin i 24 timer. og derefter bestrålet med 6 Gy. Celler fra begge grupper blev immunblottet med p53-relaterede HR reparation proteiner, såsom MRE11-RAD50-P95 /NBS1 kompleks, BRCA1, BRCA2, RAD51, RAD52, og ERCC1 24 timer efter ioniserende stråling (IR). Densitometrisk kvantificering blev normaliseret til

β

actin. HR, homolog rekombination; MRE11, meiotisk rekombination 11; NBSI, Nijmegen brud syndrom protein 1; BRCA, brystkræft tidlig debut; ERCC 1, excision reparation tværs komplementering gruppe 1.

Dernæst vi vurderet, om metformin påvirket DNA reparation veje

in vivo

ved immunhistokemisk undersøge ekspressionen af ​​RAD51 og ERCC1 i tumorprøver . RAD51 og ERCC1 protein niveauer i HCT116 p53

– /- kontrol gruppe tumorer var høj, men var under detektionsgrænserne for p53

+ /+ kontrol gruppe tumorer. Ekspressionen af ​​IR-induceret RAD51 og ERCC1 blev markant forøget i HCT116 p53

– /- tumorer sammenlignet med p53

+ /+ tumorer mens metformin kombineret med IR nedsatte signifikant proteinniveauer af RAD51 og ERCC1 i HCT116 p53

– /- sammenlignet med p53

+ /+ tumorer (

s

0,05, figur 6A og 6B). Derudover bekræftede vi udtryk for RAD51 og ERCC1 ved immunoblotting tumorprøver fra

in vivo

undersøgelse. IR-induceret RAD51 og ERCC1 udtryk blev mere markant forøget i HCT116 p53

– /- end den var i p53

+ /+ tumorer (

s

0,05, figur 6C). Desuden metformin kombineret med IR faldt betydeligt udtryk for RAD51 i HCT116 p53

– /- tumorer (

p

0,05) til niveauer svarende til dem i p53

+ /+ tumorer ( fig 6C). Sammenfattende viste vi, at metformin forbedrede tumor radiosensitivitet ved at reducere DNA reparation protein niveauer, især i HCT116 p53

– /-. Celler og tumorer

In vivo

, bekræftelse af (A ) RAD51 og (B) ERCC1 udtryk i HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- tumorvæv analyseret ved immunhistokemi og grafer angiver histologisk score for hver gruppe. (C) tumorvæv blev lyseret og immunblottet med RAD51 og ERCC1. Densitometrisk kvantificering blev normaliseret til

β

actin. Dataene er gennemsnit ± S.E.M, *

s

0.05.

Diskussion

Mutation af tumor suppressor p53 faktor spiller en stor rolle i radioresistance af kræftceller [9]. Mere end 50% af alle cancere har en manglende eller beskadigede p53-gen, og derfor har tilbøjelighed til at blive meget radioresistente. Desuden p53 mutation korreleret med høje niveauer af DNA-reparation proteiner [10]. Blandt DNA reparation proteiner, p53 forbundet med HR ved transkriptionel repression af

RAD51

gen og ophævelse RAD51 polymerisering på DNA [12]. For nylig, den cytotoksiske [21-23] og strålingssensibiliserende [16, 17, 24, 25] blev rapporteret virkninger af metformin i forskellige cancerceller uden hensyntagen p53 status. Men Buzzai

et al

. [18] viste, at metformin selektivt svækket p53

– /- celler i fravær af glucose eller i en solid tumor mikromiljø. I denne undersøgelse undersøgte vi evnen af ​​metformin at øge IR-inducerede antitumor effekter i radioresistente p53-mangelfulde kolorektal cancer celler, der fokuserer på reparation veje for IR-induceret DNA-skader.

Først, vi bekræftet, at HCT116 p53

– /- xenografter ikke kun voksede hurtigere, men også var radioresistente og mere følsomme over for metformin end p53

+ /+ xenografter var. Metformin hæmmede tumorvækst og overvundet radioresistance i HCT116 p53

– /- implanteret. Mens metformin induceret koncentrationsafhængig cytotoksicitet i både HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler, denne effekt var større i p53

– /- end den var i p53

+ /+ celler. Vores tidligere undersøgelse [24] viste, at metformin induceret apoptose i hepatocellulært carcinom, men ikke i normale hepatocytter

Dernæst undersøgte vi de strålingssensibilisering mekanismer metformin i HCT116 p53

+ /+ og p53

. – /- celler og xenotransplantater. Metformin kombineret med IR blev for nylig rapporteret at inducere cytotoksicitet hepatomceller mere end IR alene gjorde, ved at inhibere DNA-reparation, der var medieret ved akkumulering af celler i cellecyklussen G2 /M-fasen og forsvinden af ​​γ-H2AX ekspression [17] . De foreliggende resultater viser, at metformin kombineret med IR forhindrede cellecyklusprogression ved signifikant at forlænge IR-induceret G2 /M anholdelse, og induceret større DNA-skader end IR alene gjorde. Især HCT116 p53

– /- celler var mere følsomme over for metformin end HCT116 p53

+ /+ -celler var, hvilket antyder, at metformin forsinket reparationen af ​​IR-induceret DNA-skader i HCT116 p53

– /- celler. Følgelig antyder disse data, at metformin-inducerede strålingssensibilisering kan være forbundet med DNA skader og reparation veje.

tumorsuppressorprotein p53 protein regulerer ekspressionen af ​​DNA-reparationsmekanismer proteiner og talrige undersøgelser har rapporteret, at DNA reparation proteiner, såsom RAD51 [26, 27] og ERCC1 [28] var meget aktive i cancerceller, der mangler funktionelt p53, men mindre aktiv i normale celler og cancercellelinjer med intakt p53-funktion. I vores

in vivo

studier udtryk for RAD51 og ERCC1 på basale niveauer og efter IR var markant højere i p53

– /- end de var i p53

+ /+ tumorer (Fig 6 ), hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter [26-28]. Metformin kombineret med IR faldt betydeligt protein niveauer af RAD51 og ERCC1 i p53

– /- tumorer til niveauer, der var sammenlignelige med dem af p53

+ /+ tumorer. Desuden vores

in vitro

undersøgelser vist, at kombinationen af ​​metformin og IR væsentligt reduceret ekspression af p53-relaterede HR reparation proteiner såsom MRE11, RAD50, BRCA1, BRCA2, RAD51, og ERCC1 sammenlignet med IR alene i HCT116 p53

+ /+ og især p53

– /- celler. Desuden IR alene signifikant øget BRCA1 og RAD51 protein niveauer sammenlignet med kontrol i HCT116 p53

– /- celler, mens metformin kombineret med IR markant nedsat ekspression af BRCA1 og RAD51 sammenlignet med IR alene i HCT116 p53

– /- celler. Derfor er disse resultater tyder, at metformin øger radiosensitivitet i p53

– /- celler og tumorer, som stærkt udtrykte BRCA1, RAD51 eller ERCC1 protein i kontrol og efter IR behandling ved at reducere ekspressionen af ​​DNA-reparation proteiner.