PLoS ONE: Hes1 Øger Invasion evne kolorektal kræftceller via STAT3-MMP14 Pathway

Abstrakt

Notch vej bidrager til selv-fornyelse af tumor-initierende celle og hæmning af normal colon epitelcelledifferentiering. Dereguleret udtryk for Notch1 og Jagged1 er observeret i kolorektal cancer. Behårede /forstærker af split (HES) familie, de mest karakteriserede mål for Notch, der er involveret i udviklingen af ​​mange kræftformer. I denne undersøgelse udforskede vi rolle Hes1 i tumorigenese af colorektal cancer. Knocking ned Hes1 induceret CRC celle ældning og nedsat invasionen evne, mens overekspression af Hes1 øget STAT3 fosforylering aktivitet og opreguleret MMP14 proteinniveau. Vi udforskes yderligere udtryk for Hes1 i human colorectal cancer og fundet høj Hes1 mRNA-ekspression er forbundet med dårlig prognose i CRC patienter. Disse resultater tyder på, at Hes1 regulerer invasionen evne gennem STAT3-MMP14 vej hos CRC celler og høj Hes1 udtryk en indikator for dårlig prognose af CRC

Henvisning:. Weng M, Tsao P, Lin H, Tung C , Change M, Chang Y, et al. (2015) Hes1 Forøger Invasion evne kolorektal kræftceller via STAT3-MMP14 Pathway. PLoS ONE 10 (12): e0144322. doi: 10,1371 /journal.pone.0144322

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, KINA

Modtaget: Juni 24, 2015; Accepteret: November 15, 2015; Udgivet: 9. december 2015

Copyright: © 2015 Weng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Liver Forebyggelse Behandling Research Foundation, Taiwan, til MTW. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform [1] og kirurgisk resektion er den standard behandling for tidligt CRC. Kemoterapier herunder oxaliplatin, irinotecan, og flouracil er vildt, der anvendes til behandling af den fremskreden sygdom [2]. Terapier mod vaskulære endotel vækstfaktorer eller deres receptorer, såsom bevacizumab [3], aflibercept [4], og regorafenib [5], forlænge overlevelsestiden for patienter med fremskredne kolorektale cancere. Trods fremskridt i kirurgiske resektioner og systemiske behandlinger, herunder adjuverende kemoterapi, mange patienter stadig dør af CRC, og kolorektal cancer er fjerde i kræftrelaterede dødsfald på verdensplan [1].

Genetiske og epigenetiske ændringer drive initiering og progression af adenom-carcinom-sekvensen i colorektal cancer [6] og afvigende aktivering af Notch1 signalering er en af ​​de identificerede pathway [7, 8]. Notch signalering bidrager til selv-fornyelse af tumor-initierende celler, udvidelse af den intestinale stamfader pool og hæmning af normal colon epitelcelledifferentiering [9-11]. Notch signalering aktiveres via bindingen af ​​to grupper af ligander, Jagged (Jagged1, 2) og Delta-lignende (Dll1, 3, 4). Højere ekspression af Notch1 og Jagged1 mRNA og deres proteiner blev observeret i CRC væv sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv [12]. Endvidere blev Notch1 proteinekspression positivt korreleret med tumor fase [12] og patologi bedømmelse (høj ekspression Notch1 i dårligt differentieret karcinom) [8, 13].

En af de mest karakteriserede mål for Notch er behårede /forstærker af split (HES) familie [14]. Dette mål viser lovende i inducere intestinal tumor celledifferentiering [15]. Overekspression af Hes1 er blevet forbundet med udviklingen af ​​pancreas [14, 16, 17], bryst [18] og ovarie [19] cancere og dets nedregulering resulterer i accelereret differentiering og nedsat cellulær proliferation i adskillige cancermodeller [20, 21 ]. Til dato har der været sparsomme data om Hes1 ekspression i kolorektal cancer [7, 22, 23]. Eftersom der observeres høj Notch udtryk i kolorektal cancer og er forbundet med tumoren scenen, vi var interesserede i at vide, om Hes1 er involveret i tumorigenese af colon adenocarcinom.

I den foreliggende undersøgelse, vi udforskede udtryk for Hes1 i human colorectal cancer og korreleret sit udtryk med de kliniske resultater. High Hes1 mRNA-ekspression er associeret med dårlig prognose i CRC patienter. I den funktionelle analyse, fandt vi, at undertrykkelse af Hes1 udtryk inducerer mere CRC celle ældning og nedsætter invasionen evne CRC celler gennem regulering af MMP14 udtryk.

Materiale og metoder

Cellekulturer

Humane 293 T-celler og tyktarmskræft cellelinjer: HCT116 blev Caco2 og SW48 opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). De blev holdt i DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin 100 ug /ml streptomycin. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære i en fugtig inkubator.

Reagenser

Plasmid EF.hHES1.Ubc.GFP og plasmid EF.deltaBHES1.Ubc.GFP blev erhvervet fra Linzhao Cheng laboratorium [24] via addgene Inc. (Cambridge, MA). Flag-Hes1 blev genereret ved at fordøje EF.hHES1.Ubc.GFP med BamHI og Xhol, og indsættelse af fordøjede plasmidet i de multiple kloningssteder i pcDNA4-TAG-vektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stattic blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kontrol siRNA og Hes1 siRNA opnåedes fra Qiagen (Venlo, Holland). Lipofetamine RNAiMAX (Invitrogen) blev anvendt som en siRNA transfektionsreagens. Protokollen blev udført ifølge producentens anvisninger ved en slutkoncentration på 10nM.

Western Blot

Western blots blev udført som tidligere beskrevet [24]. De primære anvendte antistoffer var Hes1 (Millipore, Billerica, MA), MMP14 (Abcam, Cambridge, UK), STAT3, fosfor-STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Flag og actin (Sigma-Aldrich). Membraner blev derefter inkuberet med et specifikt primært antistof natten over, vasket og derefter inkuberet med et passende sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase, og fremkaldt under anvendelse af ECL (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).

RNA-ekstraktion og rea- tid polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Totalt RNA fra patientprøver blev ekstraheret med RNA-ekstraktion kit (Qiagen) fra væv homogeniseret med Trizol (Invitrogen). Total RNA fra cellelinier blev ekstraheret med et RNeasy Mini kit (Qiagen). RNA’et blev revers transkriberet til DNA under anvendelse af høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ekspression af Hes1 og MMP2, MMP3, MMP7, MMP9 og MMP14 mRNA blev vurderet ved hjælp af Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). GAPDH mRNA blev anvendt som en endogen kontrol. Ekspression af RNA blev analyseret ved anvendelse af 2-ΔΔCt metode. Primere til mRNA-ekspression blev påvist i S1 tabel.

Proliferationsassay

Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyltetrazoliumbromide, Sigma-Aldrich Co.] assay.

In vitro invasion assay

invasiv aktivitet blev målt ved anvendelse af en membran invasion kultur, i hvilket en polycarbonatmembran med 8 um porer (Millipore , Billerica, MA) coatet med Matrigel (R 0,05, ** p 0,01, *** p 0,005).

nedbryder Hes1 genet inducerede flere CRC celler i aldring

Det har blevet rapporteret, at Hes1 er nødvendig for reversibilitet af cellulær hviletilstand og det forhindrer for tidlig ældning i hvilende fibroblaster [25]. Vi slået ned Hes1 i SW48 og Caco2 celler og observeret signifikant mere beta-galactosidase-ekspression i Hes1 slået ned celler, hvilket tyder mere ældning i Hes1depleted celler (Fig 1F og 1G).

Knockdown af Hes1 genet formindsker invasion gennem regulering af MMP14

Da flere matrixmetalloproteinaser (MMP) mægle invasion af kræftceller [26], studerede vi udtryk for et panel af MMP i colon cancerceller på Hes1 knockdown. Vi observerede, at kun MMP14 ekspressionsniveau faldt på Hes1 knockdown på mRNA-niveauet i Caco2-celler (fig 2A). Vi fandt derefter knock-down Hes1 fører til MMP14 proteinniveauet fald i SW48-celler (Fig 2B). Omvendt overekspression af Hes1 førte til en stigning af MMP14 mRNA-ekspression (fig 2C). Vi udtrykte ektopisk en mutant HES1 gen, som bærer en trunkering ved dens funktion domæne, og vi ikke observere stigningen i MMP14 i HCT116 og HT29-celler (Fig 2C).

(A) En række MMP mRNA-ekspression ved siRNA Hes1 transfektion i Caco2-celler. (B) MMP14 protein fald på siRNA Hes1 transfektion i SW48-celler (C) MMP14 mRNA-ekspression på Hes1 og mutant Hes1 overekspression i HCT116 og HT29-celler. (* P 0,05, ** p 0,01)

Hes1 reguleret MMP14 udtryk afhænger af STAT3 vej

Det blev rapporteret, at Hes1 aktiverer signal transducere og aktivatorer af den transkription 3 (STAT3) pathway [27, 28], og at STAT3 kontrollerer MMP1 ekspression i colon cancerceller [29, 30]. Vi evaluerede derfor, om STAT3 aktivitet spiller en rolle i HES1 regulering af MMP14 i tyktarmskræft celler. Hes1 udtømning af siRNA knockdown reduceret MMP14 protein-ekspression i Caco2 og SW48 celler. Hes1 udtømning resulterede i et fald af STAT3 phosphorylering og ingen ændring af den samlede STAT3 i Caco2 og SW48-celler (Fig 3A og 3B). Ektopisk overekspression en FLAG tagged konstitutivt aktiv STAT3 plasmid, resulterede i øgede MMP14 protein niveauer i HCT116-celler (Fig 3C og 3D). Ektopisk overekspression af Hes1 øget MMP14 udtryk samt STAT3 phosphyorylation i HCT116 celler. Endvidere blev STAT3 phosphorylering og MMP14 proteinekspression reduceret, når celler blev behandlet med stattic, en STAT3-aktivering inhibitor (fig 3E og 3F). Vores resultater tyder på, at HES1 regulere MMP14 udtryk gennem opregulering STAT3 aktivitet i tyktarmen kræftceller.

Hes1 og MMP14 udtryk er relateret til tumor stadie

Som Notch1 udtryk er forbundet med tumor fase, evaluerede vi udtryk for Hes1 i humane CRC væv. Vi analyserede 74 parret menneskelige kolon adenocarcinom og deres tilstødende ikke-tumor kolon væv fra National Taiwan University Hospital patient kohorte (tabel 1). Vi fandt, at ekspressionsniveauet af Hes1 (Fig 4A) eller MMP14 mRNA (Fig 4B) var relateret til tumor stadium.

(A) Hes1 mRNA (

s

= 0,06 ved En måde ANOVA) og (B) MMP14 mRNA-ekspression (

s

= 0,60 ved En måde ANOVA) blev ikke korreleret med tumor stadie.

høj udtryk for Hes1 i CRC er forbundet med kortere overlevelse

Vi yderligere undersøgt, om Hes1 og MMP14 udtryk korrelerer med patientens overlevelse. Hes1 mRNA ekspression og MMP14 mRNA-ekspression var positivt korreleret i tumorvæv (korrelation coefficiency = 0,238, p = 0,035). High Hes1 udtryk i tumorerne blev korreleret med kortere overlevelsestid (Fig 5A). Høj MMP14 blev også korreleret med en kortere overlevelse (Fig 5B).

Patienterne blev inddelt i Hes1 /MMP14 lave og høje grupper baseret på median ERH /MMP14 udtryk og deres overlevelse blev plotte under anvendelse af Kaplan-Meier-analyse ( uptick indikerer censurering hændelser). (A og B) CRC patient med høj Hes1 og MMP14 ekspression er forbundet med dårlig overlevelse. (C og D) I undergruppen af ​​patienter med stadium I-III CRC, høj Hes1 og MMP14 udtryk er signifikant associeret med dårlig overlevelse. (E og F) I undergruppen af ​​patienter med stadie IV CRC, Hes1 og MMP14 udtryk er ikke forbundet med overlevelse.

Vi stratificeret yderligere disse patienter efter deres metastatiske sygdomme. For patienter med tidlig eller lokalt fremskreden sygdom, blev høj Hes1 eller høj MMP14 udtryk forbundet med væsentlig kortere overlevelse. Men Hes1 og MMP14 ekspressionsniveauerne var relateret til overlevelse for patienter med metastaserende sygdomme (Fig 5C-5F). Som MMP spiller en rolle i cancer invasion og metastase, kan det være mindre prognostiske for patienter med tumorer, der allerede var metastaseret på diagnose

Ifølge den multivariate Cox regressionsanalyser, Hes1 (HR, 2,41;. 95% CI , 1,07-5,43) og MMP14 (HR, 2,36; 95% CI, 1,02-5,46) forblev positivt associeret med dødsfald som følge af kolorektal cancer. Metastase blev også signifikant associeret (HR, 10,05; 95% CI, 4,11-24,60) med dødsfald som følge kolorektal cancer (tabel 2). Med hensyn til samspillet mellem Hes1 og metastase, patienterne præsenterede høj Hes1 stadig havde en øget risiko for at dø af tarmkræft.

Diskussion

homøostase af selv-fornyelse, proliferation og differentiering af stamceller og stamceller er reguleret af Notch, WNT, FGF og Hedgehog signalveje [31-33]. I tarmen, er disse veje også involveret i villi dannelse og kolorektal tumorudvikling [9, 34, 35]. Den WNT vej udviser tværs regulatoriske interaktioner med Notch vej [36, 37]. APC

Min (multipel intestinal neoplasi) mus, hvori genet APC er anført et trunkering mutation ved codon 850 og WNT-vejen er fejlreguleret, kan udvikle hundredvis af tyndtarmen og colon-polypper [38]. Notch aktivering er essentiel for adenom dannelse i APC

Min-mus [10]. Inhibering af Hes1 i APC

Min-mus er faldet tumorcelleproliferation og har ført til tumorcelledifferentiering i intestinale epitelceller [15].

Hes1 spiller en vigtig rolle i CRC carcinogenese. Det binder direkte til promotoren af ​​HATH1 genet og undertrykker Hath1 ekspression [39]. Hath1 er en tumorsuppressor, som inhiberer proliferation og forankringsuafhængig evne coloncancerceller [40, 41] og fremmer intestinal sekretorisk celledifferentiering [42]. Det er velkendt, at Hes1 forhindrer for tidlig ældning i hvilende fibroblaster [25]. Her viste vi, at nedbrydende Hes1 i kolon kræftceller ikke påvirkede celledeling, men øget beta-galactosidase udtryk, hvilket indikerer, at Hes1 udtømning inducerer tyktarmskræft celle ældning. Nedregulering af Hes1 induceret ældning er også blevet rapporteret i hepatocellulære celler gennem regulering CDKN1C /p57 [43].

Dernæst vi karakteriseret at Hes1 fremmet celle invasion ved at øge MMP14 udtryk. MMP14 er et centralt protease i cellemigration /invasion og angiogenese [44, 45]. Høj ekspression af MMP14 blev rapporteret i lungecancer og gliom [46, 47]. Hes1 interagerer med STAT3 og fremmer dens phosphorylering [28]. Endvidere blev STAT3 rapporteret at opregulere MMP-2 og MMP-9-ekspression og aktiviteter via direkte binding til deres promotor [48-50]. I denne undersøgelse har vi også observeret, at STAT3 overekspression forøget ekspression af MMP14 (figur 3). Vores resultater tyder på, at opregulering af MMP14 ved Hes1 i CRC-celler er afhængig af STAT3-vejen.

Endelig har vi observeret, at både høj Hes1 og MMP14-ekspression var korreleret med dårlig overlevelse. Lignende resultat blev fundet i undergruppen af ​​patienter med tidlig eller lokalt fremskreden CRC, men ikke hos patienter, at svulsten har spredt. I Veenendaal undersøgelse, de observerede højere Hes1 udtryk i primære tyktarmskræft men tabte udtryk i regionale og fjernmetastaser [23]. Dette fund foreslået reduceret Notch aktivitet i sekundære kolorektale tumorer og kan forklare, hvorfor det Hes1 ekspressionsniveauet ikke er forbundet med overlevelse, når tumor er metastasied i vores undersøgelse. I modsætning hertil Reedijk et al. tidligere rapporteret, at høj Hes1 er relateret til overlevelse CRC patienter ved at analysere 130 microarray data fra US National Cancer Institute Colon Cancer Family Registry. Høj ekspression blev defineret som den øverste kvartil af Allred scorer [7]. Selvom Reedijk resultatsider konflikter med vores fund, tumor scenen, høj ekspression definition og metodiske tilgang er forskellige i disse to undersøgelser. Den virkelige prognostiske rolle Hes1 i CRC garanterer yderligere bekræftelse.

Som konklusion, afvigende aktivering af Notch vej hæmmer cellulær differentiering og bidrager til carcinogenese. Hes1 er et centralt transskriptionsrepressor og væsentlige regulatorer for Notch-vejen. Her viste vi, at overekspression af Hes1 øger celle invasion evne gennem STAT3-MMP14 vej. Hes1 udtryk er korreleret med MMP14 udtryk i CRC og er en indikator for patient overlevelse. Målretning af Notch-Hes1 vej kunne udnyttes til terapeutiske formål i Notch aktiverede kræftformer.

Støtte Information

S1 Fig. (A) Cell levedygtighed ændring på siRNA Hes1 transfektion i SW48 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0144322.s001

(TIF)

S1 Table. Primere for RT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0144322.s002

(DOCX)

Tak

Vi vil gerne takke professor Linzhao Cheng for nådigt giver Hes1 og delta-Hes1 plasmider via Addgene.