PLoS ONE: DNA Aptamere som Molecular Probes for tarmkræft Undersøgelse

Abstrakt

Baggrund

Forståelse af molekylære funktioner i specifikke tumorer kan øge vores viden om mekanismen (r) underliggende sygdom udvikling og progression. Dette er særlig vigtigt for colorektal cancer, som er en heterogen kompleks af sygdomme, der er udviklet på en sekventiel måde gennem en flertrins kræftfremkaldende proces. Som sådan er det sandsynligt, at tumorer med tilsvarende karakteristika kan stamme på samme måde og har en lignende molekylær adfærd. Derfor kan specifik kortlægning af de molekylære funktioner være potentielt nyttige for både tumor klassifikation og udvikling af egnede behandlingsregimer. Dette kan imidlertid kun opnås ved at udvikle molekylære prober med høj affinitet med evnen til at genkende specifikke markører forbundet med forskellige tumorer. Aptamere kan lettest tage denne udfordring baseret på deres mål mangfoldighed, fleksibel manipulation og nem udvikling.

Metode og Resultater

Ved hjælp af en metode, der kaldes celle-baserede Systematisk Evolution af ligander ved eksponentiel berigelse (celle-SELEX) og kolorektal cancer dyrkede cellelinier DLD-1 og HCT 116, valgte vi et panel af målspecifikke aptamerer. Bindingsundersøgelser ved flowcytometri og konfokal mikroskopi viste, at disse aptamerer har høj affinitet og selektivitet. Vore data viser endvidere, at disse hverken aptamerer genkende normale kolon celler (dyrket og frisk), heller ikke genkende de fleste andre cancer cellelinjer testet.

Konklusion /Betydning

De valgte aptamerer kan identificere specifikke biomarkører forbundet med kolorektale cancere. Vi mener, at kunne videreudvikles disse prober til tidlig påvisning af sygdommen, samt prognostiske markører, af tarmkræft

Henvisning:. Sefah K, Meng L, Lopez-Colon D, Jimenez E, Liu C, Tan W (2010) DNA Aptamere som Molecular Probes for tarmkræft Study. PLoS ONE 5 (12): e14269. doi: 10,1371 /journal.pone.0014269

Redaktør: Dimitris Fatouros, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki, Grækenland

Modtaget: May 3, 2010; Accepteret: 16 oktober 2010; Udgivet: December 10, 2010

Copyright: © 2010 Sefah et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet var finansieret af følgende: NIH: R01 GM079359: Udvikling af Molecular Probes for Biomedical Applications; NIH CA122648, Berigelse og påvisning af eksfolieret kræftceller. Den bevilgende myndighed ikke havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform (10-15% af alle kræfttilfælde) og en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, med en anslået en halv million dødsfald på verdensplan og over halvtreds tusinde dødsfald i USA alene.

CRC er en heterogen kompleks af sygdomme forårsaget af destruktive genetiske /epigenetisk forandringer, der ophobes i en sekventiel måde gennem en flertrins kræftfremkaldende proces [1]. Det er derfor sandsynligt, at tumorer med tilsvarende karakteristika kan stamme på samme måde og har en lignende molekylær adfærd. Da de molekylære funktioner i en given tumor afspejler mekanismen (er) underliggende sygdom udvikling og progression, konsekvenserne for tumor klassificering er betydelig. For eksempel er molekylær klassifikation af leukæmi og lymfomer uhyre forbedret vores forståelse af disse sygdomme [2], [3], [4]. Undersøgelsen af ​​de molekylære grundlag for to store syndromer, familiær adenomatøs polypose (FAP) og arvelig nonpolypsis CRC (HNPCC), har ført til identificeringen af ​​to vigtigste veje, ad hvilke disse molekylære begivenheder kan føre til CRC [5]. Ca. 85% af CRCs skyldes begivenheder, der resulterer i med aneuploidi og tidlig inaktivering af adenomatøs polyposis coli (APC) kromosomal ustabilitet (CIN),. En yderligere 15% resultat fra processer, der genererer i viceværten mismatch repair (MMR) funktion i forbindelse med HNPCC [6] mikrosatellit instabilitet (MSI), replikering fejl eller tab, [7], [8], [9]. Selv om vi har forbedret vores forståelse af de molekylære begivenheder ligger til grund for udviklingen af ​​CRC, har ingen væsentlig indvirkning på patientpleje resulterede. Selvom betydelige fremskridt, der er gjort i behandlingen af ​​patienter med CRC hjælp folinsyre (FA) -modulated 5-fluoruracil (5-FU), omkring 50% af CRC patienterne i sidste ende udvikle metastaserende CRC (mCRC). Men brugen af ​​nye kemoterapeutiske midler, såsom oxaliplatin og irinotecan, enten alene eller i kombination med godkendte biologiske midler, såsom bevacizumab og cetuximab, lover, at forlænge overlevelsen [10], [11].

Derfor for at maksimere de tilgængelige behandlinger, er det kritisk vigtigt at få endnu mere indsigt i de molekylære mekanismer bag sygdommen udvikling og progression, samt markant forbedre vores bestræbelser på at belyse nye terapeutisk relevante mål og molekylære markører. En sådan indsats vil hjælpe med at udvide og diversificere styringsmuligheder sygdom. Undersøgelser har også vist, at flytte afsløring sygdom til et tidligere tidspunkt gennem masse-screening og intervention på dette tidspunkt, kan reducere risikoen for at dø af CRC [12], [13]. Disse resultater kraftigt demonstrere den kliniske behov for biomarkører for tidlig påvisning af CRC, så sygdommen kan forvaltes effektivt.

Genomisk teknikker, såsom DNA microarray analyse, og proteomiske metoder, såsom todimensional (2 -D) elektroforese og massespektrometri, er nu almindeligt anvendt til at belyse ekspressionsprofiler af gener og proteiner i celler, væv og legemsvæsker [14], [15]. Faktisk kan identifikationen af ​​gener og proteiner, som karakteristisk produceret under udviklingen af ​​kræft potentielt afdække nyttige biomarkører, der vil støtte i forvaltningen af ​​CRC. Selvom proteomics har spillet en dominerende rolle inden for biomarkør udvikling [16], og vil fortsat gøre det, har de nuværende proteom strategier ikke genereret nok markører for CRC.

Interessant, CRC er en af ​​de første kræftformer for hvilke tumormarkører blev anvendt til at støtte i sygdomsbehandling. For eksempel har carcinoembryonisk antigen (CEA) vid udstrækning blevet anvendt til at bestemme prognose og overvåge både sygdomsprogression og terapi efter kurativ resektion. Et højt CEA i serum er associeret med cancer progression. Men selv i fravær af cancer, har høje niveauer af CEA er rapporteret, i forhold såsom hepatitis, pancreatitis, inflammatorisk tarmsygdom og obstruktiv lungesygdom. Desuden kan andre kræftformer, såsom pancreas, mave, lunge og bryst, har forhøjede niveauer af CEA, der angiver manglende specificitet af denne markør. Andre markører, såsom carbohydratantigen 19-9 (CA19.9), CA242, metalloproteinaser-1 (TIMP-1), thymidylatsyntase, p53, og

APC

genet, alle mangler den nødvendige sensitivitet og specificitet. For at være klinisk anvendelig, skal en biomarkør være effektive og har en høj prædiktiv værdi [7], men ikke sådan én biomarkør eksisterer. Selv om der ikke er opnået enighed, ser det ud til, at udviklingen af ​​flere biomarkører for påvisning og vurdering af en enkelt kræftrisiko foretrækkes for enkelt omfattende biomarkører, der successivt kan forudsige risikoen for enhver form for kræft [7]. Dette er endnu mere vigtigt, da multiplexing metoder bliver mere af en norm end undtagelsen.

Biomarkører, direkte forbundet med tumorceller, som de er forvandlet fra normalitet til malignitet vil være af væsentlig interesse, da disse markører kan være nyttige værktøjer til at kortlægge de molekylære funktioner i de syge celler. Evne sonder til at identificere et vigtigt klinisk prøve, såsom afstødes maligne colonocyter, snarere end normale colonocyter, ville være særlig vigtigt for CRC [16]. Specifikt har endnu eksfolierede celler fra colon mucosa blevet afstødning i afføringen, er det allerede blevet påvist, at DNA fra afføringen kan isoleres og udsættes for en multi-mål-DNA-analyse. Denne analyse kan i øjeblikket vurdere 15 mutationsmønstre hot spots, herunder k-ras, p53, APC, BAT-26 og L-DNA. Selvom DNA fecal markører er ganske lovende, er de ikke meget udbredt i kliniske omgivelser og derfor sonder, der specifikt kan registrere cellerne vil være vigtigt.

I udviklingen af ​​følsomme, selektive molekylære markører for CRC, cellebaserede aptamer udvælgelse besidder betydelig løfte sit potentiale til at identificere flere brugbare markører på relativt kort tid. I løbet af de sidste to årtier, er blevet gjort betydelige bestræbelser på at udvikle markører for forskellige typer af kræft ved hjælp af en proces kendt som Sytematic Evolution af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) [17], [18]. Gennem denne proces har talrige oligonukleotidprober (aptamerer) blevet genereret, som kan binde specifikt til proteiner associeret med membraner af forskellige tumorceller [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26]. Aptamerer er korte, enkeltstrengede oligonucleotider (DNA eller RNA), typisk 100 mer, der har evnen til at binde til andre molekyler med høj affinitet og specificitet. De er blevet frembragt mod en række forskellige mål fra små molekyler [27], [28], [29], [30] og peptider /proteiner [31], [32], [33], [34], [35] , [36] til hele celler [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26] samt bakterier, vira og virus proteiner [37 ], [38], [39], [40], [41], [42], [43]. Det cellebaserede selektionsstrategi genererer aptamerer, som binder til ukendte mål i deres native tilstand. Ikke desto mindre kan målet stadig identificeres gennem affinitet ekstraktion og massespektrometri [44], [45]. At skabe mere følsomme og selektive prober til CRC, har vi udviklet et panel af DNA aptamerer der specifikt genkender kolorektal cancer celler. Disse prober blev genereret ved celle-SELEX ved anvendelse kolorektal cancer dyrkede cellelinier DLD-1 og HCT 116. Indledende bindingsundersøgelser ved flowcytometri og konfokal mikroskopi under anvendelse af disse dyrkede cellelinier viser, at de fleste af vores aptamerer har høj affinitet og selektivitet. Vore data viser endvidere, at disse hverken aptamerer genkende normale kolon celler (dyrkede), heller ikke genkende et flertal af de øvrige kræft testede cellelinjer. Vores resultater viser tydeligt, at proberne identificere specifikke membranproteiner forbundet med kolorektale cancere. Vi mener, at der kunne udvikles disse prober yderligere for tidlig påvisning af sygdommen, samt prognostiske markører, af tarmkræft.

Resultater

I løbet af de sidste ti år, er blevet udviklet flere aptamerer til forskellige mål , herunder oprensede molekyler, såvel som komplekse mål, såsom de levende celler af forskellige kræftformer. Vi har anvendt det cellebaserede SELEX strategi til at generere et panel af DNA aptamerer for kolorektale cancere. En tilfældig ssDNA pool (ca. 10

14) blev underkastet sekventiel binding og eluering til at vælge fra pool DNA-sekvenser, der har evnen til at binde til overfladen markører for målcellen. DLD-1 og HCT 116 blev brugt som mål med HCT1116 og HT-29 som de respektive kontroller i separate valg. Indførelsen af ​​tæller valg gav mulighed for at fjerne, i det omfang det er muligt, fælles overflademarkører, mens samtidig berigende differentierede markører på målcellerne. DNA pool opsamlet efter hver selektionsrunde blev amplificeret ved PCR, og produktet blev anvendt til fremstilling ssDNA for den næste runde af selektion. I denne selektionsstrategi blev inkubation af DNA pool med cellerne udføres i dyrkningsskåle (cellemonolag). Den berigelse af udvælgelsen pool gennem successiv udvælgelse blev overvåget ved flowcytometri. For at kunne bruge cellerne til flowcytometri blev cellerne dyrket natten over og dissocieret ved hjælp af kort tid (30 sek-1 min) trypsinbehandling og /eller ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning (MP Biomedicals). Kort tid behandling med trypsin ikke havde nogen observerbar effekt med hensyn til evnen af ​​udvælgelsen pool at genkende celler, idet ingen forskel mellem signalintensiteter af trypsin og ikke-enzymatiske behandlingsmuligheder blev observeret (Text S1, figur S1 ). Peak shift (stigning i fluorescensintensitet i sammenligning med biblioteket) er en indikation af fluorescensintensitet af cellen som et resultat af det mærkede DNA-sekvens binding til cellerne (figur 1). Med det stigende antal selektionssystemer cyklusser, var der en støt stigning i fluorescensintensiteten af ​​målcellerne, hvilket indikerer, at DNA-sekvenser med bedre binding til målcellerne blev beriget. Der var imidlertid ingen signifikant topforskydning med kontrolcellerne, især i begyndelsen og midten af ​​selektionsrunder. Ved 14

th selektionsrunde, var der en signifikant stigning i fluorescens signal af målet sammenlignet med kontrolceller. En yderligere to runder (16

th runde) førte til en stigning i signalet forbedring af kontrollen, men ingen signifikant stigning for målet. Dette er muligt ved den terminale ende, når udvælgelsen fortsættes yderligere, selv når der ikke er nogen signifikant signal forskel mellem de successive puljer til målet. De stærkt berigede puljer blev klonet, og de positive kloner sekventeret. Sekvensanalyse forudsat potentielle DNA aptamer kandidater grupperet i familier baseret på deres sekvenshomologi. Omkring 8 forskellige homologe familier og mange randomiserede sekvenser blev identificeret for udvælgelsen DLD-1. Antallet af sekvenser i de forskellige homologe familier varierede 6-110 (tabel 1) med få basemutationer inden for en familie. Repræsentative sekvenser fra de forskellige familier blev valgt til at teste deres samspil med målet.

Retning af pile viser stigende runder af valg fra 5

th -16

th pool. Som markering skred der var højere tilsvarende stigning i fluorescensintensitet af målet end kontrollen. Den pludselige stigning i fluorescenssignal af kontrollen fra 14

th til 16

th runde uden tilsvarende stigning i målet angiver højere berigelse.

Den rullende cyklus forstærkning (RCA ) produkter fra sekventering blev anvendt til den indledende screening. Produkterne fra de valgte brønde blev fortyndet med 100 pi H

20 og anvendes til PCR-amplifikation. PCR-produkterne blev anvendt til fremstilling ssDNA og derefter anvendt til bindingsassays. To sekvenser, der har mindst en base mutation blev valgt fra familier med sekvenser større end 20 (tabel 1). Brugen af ​​RCA produkt forsynet os med en hurtigere metode til screening for potentielle aptamer kandidater. Sekvenserne med bindende signal større end den for kontrollen (Text S1, figur S2) blev kemisk syntetiseret og mærket med fluorescein isothiocynate (FITC) eller biotin ved 3 ‘enden. Alle syntetiserede sekvenser blev oprenset ved HPLC og derefter kvantificeres. De bindingsassays blev udført under anvendelse af flowcytometri som beskrevet, og bindingen signal blev detekteres direkte i FL1 for FITC sonder, FL2 for streptavidin-konjugeret PE eller FL3 for streptavidin-konjugeret PE-Cy5.5. De indledende bindingsassays med de syntetiserede sekvenser navngivne KDED1 til KDED20 afslørede mange sekvenser binder til cellen målet (figur 2). Nogle af sekvenserne tilhører samme familie, og derfor påtænkt at bindende til det samme mål, viste forskellige bindende signalstyrker til målet. Disse omfatter KDED2 /KDED15; KDED1 /KDED5; KDED9 /KDED10, KDED3 /KDED19 og KDED7 /KDED18.

Cellerne blev dissocieret med ikke-enzymatisk dissociation løsning. Cellerne blev vasket og inkuberet med forskellige aptamer kandidater (blå histogram). Fluorescenssignalet blev påvist ved streptavidin-PE-Cy5.5. Den fravalgt bibliotek blev anvendt som baggrund fluorescenssignal (sort histogram). Alle aptamerer A (KDED2), B (KDED5), C (KDED7), D (KDED15), E (KDED19), F (KDED20).

co-aktuelle valg, der bruger DLD -1 (uden negativ selektion) og HCT 116 som mål, genereret også følgende aptamerer: KC2D3, KC2D4, og KC2D8 for DLD-1:. KCHA10 og KCHB10 for HCT 116 (figur 3)

A (KC2D3 ), B (KC2D4), C (KC2D8). D (KCHA10), E (KCHB10).

Alle de udviklede aptamerer blev yderligere testet med alle de kolorektale cancercellelinjer anvendt i denne undersøgelse. Følgende aptamerer viste anerkendelse kun til den cellelinje anvendes til valg: KDED2 /KDED15, KDED7 /KDED18, KDED9 /KDED10 og KC2D3 (DLD-1) og KCHB10 (HCT 116). Figur 4 viser den billedlige repræsentation af samspillet mellem de enkelte aptamerer og de tre forskellige kolorektale cancer cellelinjer. Højden af ​​keglen repræsenterer procentdelen af ​​celler, som var fluorescensintensiteten over kontrol bibliotek med den tærskel på 5% fluorescenssignal intensitet.

Bindingsassays blev udført med DLD-1, HCT 116 og HT-29 . Baggrunden fluorescensintensitet af biblioteket blev sat under 5% og fluorescenssignalet af de enkelte aptamerer blev derefter bestemt og anvendt på billedmæssig repræsentation som vist.

Vi derefter bestemmes de tilsyneladende dissociationskonstanter (Kd) for de valgte aptamerer, der lå mellem 0,68 nM og 302 nM (tabel 2 og figur 5). For at øge syntese effektivitet og også øge fleksibiliteten i kemisk manipulation blev nogle af aptamererne afkortet, og bindingsstyrken og tilsyneladende Kds af de trunkerede sekvenser blev også vurderet. Før hver afkortning, blev de mulige strukturer i hver aptamer sekvens forudsagt ved hjælp af integrerede DNA Technologies oligoanalyzer under udvælgelsesbetingelserne. De gunstigste hårnålestrukturer blev udvalgt og hænge over baser ved 3 ‘og /eller 5’-enden fjernet, hver på et tidspunkt. Række trunkeringer blev foretaget, og hver af disse blev endelig testet med de positive celler til at vurdere binding. Den trunkering af KCHA10 (KCHA10a) ændrede ikke egenskaberne for aptamer. Imidlertid blev signifikant forbedring af bindingsaffinitet observeret med KDED7 trunkering (KDED7a) og de forskellige former for KDED2 (KDED2a, KDED2a-1 og KDED2a-3), som påvist i de forbedrede affiniteter de trunkerede versioner (tabel 2). For eksempel Kd på KDED7 forbedret fra 157,3 nM til 46,8 nM, ca. 3 gange forbedring, mens KDED2 forbedret fra 191,9 nM til 29,9 nM, en 6-gange forbedring. Resten udviste ikke observerbar binding til målet. I næsten alle assays rapporteret, har vi brugt alle de enkelte sekvenser (afkortet og fuld længde) af KDED2, da forskellen i bindingsaffinitet kan påvirke følsomheden af ​​et bestemt assay. Salg

Celler blev inkuberet med varierende koncentrationer af biotin-mærket aptamer in duplo. Den fluorescens-signalet blev påvist med streptavidin-PE-Cy5.5. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af uselekterede bibliotek (baggrundsbinding) ved hver koncentration blev trukket fra den gennemsnitlige fluorescensintensitet af den tilsvarende aptamer. Selve fluorescensintensitet blev monteret i Sigmaplot at bestemme den tilsyneladende Kd.

Vi undersøgte yderligere selektiviteten ved test af interaktionen mellem aptamerer og dyrkede normale cellelinier, såvel som cellelinier fra andre cancere, herunder leukæmi, lunge-, ovarie-, hjerne og livmoderhalskræft. Som vist i tabel 3, blandt de testede aptamerer, KDED19 og KC2D8 viste signifikant signalintensitet over kontrol bibliotek til nogle af de cellelinier. For eksempel var der en betydelig anerkendelse (≥ +++) i KDED19 til CaOV3, TOV21G, CEM og H661, mens Hela og U87MG viste reduceret signal (tabel 3). KC2D8 viste en anerkendelse tendens ligner KDED19 med de testede cellelinier (tabel 3). Der var ingen observerbar signal fra de andre aptamerer med nogen af ​​de testede cellelinjer, herunder de normale colon-cellelinjer (CCD18co og FHC) og friske human colon celler (Text S1, figur S3). Dette indebærer, at de fleste af de udviklede aptamererne er specifikke for colorektale cancere (tabel 3). Denne observation er vigtig, da det giver mange muligheder for yderligere udvikling af disse aptamerer for kolorektal undersøgelser kræft. På grund af den lignende bindingsmønster observeret med KDED19 og KC2D8, især signalet med CEM, besluttede vi at bruge Sgc8 mod disse aptamerer i de efterfølgende kompetitive assays til foreløbig verificere målmolekylet.

Generelt celle-SELEX strategi fremstiller forskellige typer af aptamerer til forskellige mål og /eller det samme mål er til stede på den ekstracellulære overflade af cellerne. Vi udførte derfor kompetitive assays for at vurdere, om nogen af ​​disse aptamerer, især dem fra forskellige familier, kan påvirke bindingen af ​​den anden. Det er klart, det var rimeligt at antage, at sekvenser syntetiseret fra samme familie vil konkurrere; også, vil sekvenser, som binder forskellige celler ikke konkurrere indbyrdes. For eksempel er det muligt for KDED2 at konkurrere med KDED15, men det er usandsynligt, at det vil konkurrere med KDED5 eller KCHA10. På dette grundlag vi udførte konkurrence KDED2 (FITC) mod KDED7, KDED10, KDED18, og KC2D3 (umærket), og KCHA10 (FITC) mod KDED5, KDED20, KC2D4, KDED19 og KC2D8 (umærket), slutter med KC2D4, KC2D8 og KDED19 mod CEM aptamer Sgc8 (umærket). Tidobbelt overskud af den umærkede konkurrent blev først inkuberet med DLD-1 før indførelsen af ​​FITC-mærket aptamer. Dette sikrede konkurrencemæssige fordele og potentialet til at mætte og blokere bindingen af ​​det andet aptamer hvis de begge er bundet det samme mål, eller hvis binding af en påvirket bindingen af ​​det sekundære aptamer. Umærket KDED2 og KCHA10 blev anvendt i disse analyser som positiv kontrol. KDED2 binding var ikke påvirket af nogen af ​​de testede imod det aptamerer. Ligeledes har vi ikke observere nogen konkurrence mellem KCHA10 og eventuelle konkurrerende aptamerer. Der var imidlertid betydelig indflydelse på bindingen af ​​KDED19, KC2D4, og KC2D8 i nærvær af 10 ganges overskud af umærket Sgc8 (Text S1, figur S4). Dette resultat antyder, at disse aptamerer kan være binding til de samme mål som Sgc8. Dette tyder endvidere, at KDED19, KC2D4 og KC2D8 vil konkurrere indbyrdes, selv om vi ikke udføre en sådan konkurrence assay. Disse aptamerer blev udviklet ved anvendelse DLD-1, som ikke havde den oprindelige blokering hjælp Sgc8. Dette understøtter ideen om, at det er praktisk muligt at blokere en kendt markør for at muliggøre udviklingen af ​​prober til mål af interesse.

Immunohistologisk billedbehandling og fluorescens mikroskopi er ofte blevet brugt i studiet af solide tumorer og i især tarmkræft. Derfor har vi også vurderet, om kunne bruges disse aptamerer til tumor billeddannelse med den positive cellelinie. I denne indledende undersøgelse anvendte vi dyrkede cellelinier. Her har vi udført bindingsassays i dyrkningsskåle svarende til selektionsprotokol, men med cellekonfluens på over 60%. Efter vask blev signalet detekteret med PE-streptavidin konjugat eller streptavidin-Alexa Fluor 633. Figur 6 viser de konfokale billeder af KDED2, KDED3, KDED5 og KDED7 påvises med PE-streptavidin. Der var signifikant signalstyrke af de testede aptamerer sammenlignet med den umarkerede bibliotek. Signalet mønster viser, at aptamererne bundet til overfladen af ​​cellerne fastgjort til dyrkningsskålen. Salg

Celler blev inkuberet med aptamer konjugeret med biotin og bindingsbegivenheden blev observeret med PE-konjugeret streptavidin. A (umarkerede bibliotek viser baggrunden bindende); B (KDED2); C (KDED3); D (KDED5) og E (KDED7).

Tilsvarende blev signifikant fluorescens signal observeret fra streptavidin-Alexa Fluor 633 konjugater når DLD-1 blev brugt mod de andre aptamerer, herunder KCHA10, KC2D8, KDED18 , KDED19, og KDED20 (figur 7), samt HCT 116 celler med KCHA10 og KC2D8. Som forventet havde KDED2 ikke binde HCT 116. Intensiteten af ​​fluoroforen signal fulgte det samme mønster som den flowcytometri. Interessant nok viste KC2D8 et stærkere signal med HCT 116 end med DLD-1. Salg

Celler blev inkuberet med aptamer konjugeret med biotin og bindingsbegivenheden blev observeret med AlexaFluor 633 konjugeret streptavidin. Fravalgt bibliotek viser baggrunden binding. Aptamerer signifikant binding over baggrundssignalet. For DLD-1 celler, A = fravalgt bibliotek; B = KCHA10; C = KDED19; D = KC2D8; E = KDED18; F = KDED20 og for HCT 116 celler, G = fravalgt bibliotek; H = KCHA10; I = KC2D8 og J = KDED2a-3.

Det er normalt at antage, at aptamerer udvalgte mod tumorcellelinier binder til overfladen proteiner. Dette er blevet påvist i de fleste af SELEX protokoller involverer tumorcellelinjer [44], [45]. For ikke at være fuldt ud oversætte helst SELEX data til den anden, udførte vi assays til foreløbigt bestemme molekyler på celleoverfladen, som de valgte aptamerer ville binde. I dette assay blev DLDL-1-celler behandlet med trypsin og /eller proteinase K i 15 minutter ved 37 ° C. Efter inkubationsperioden blev proteaseaktiviteten standses ved tilsætning af iskold dyrkningsmedium indeholdende FBS. Cellerne blev hurtigt vasket to gange ved centrifugering og derefter inkuberet med aptamererne. De ubehandlede celler blev anvendt som positiv kontrol. Figur 8 viser responset af aptamer binding efter proteaseaktiviteten. Bortset KDED5 og KCHA10, alle de andre aptamerer mistet anerkendelse i både trypsin- og proteinase K-behandlede celler. Fluorescenssignalerne reduceret til baggrunden, hvilket indikerer, at behandling af celler med proteaserne forårsagede spaltning af målproteinet. For KDED5, var der en signifikant reduktion i signalintensitet, men KCHA10 signal reduceres kun marginalt, hvilket indikerer, at målene ikke helt er påvirket af behandlingen. Salg

Celler blev behandlet med trypsin og proteinase K i 15 minutter og derefter inkuberet med aptamer. Det ubehandlede celle inkuberet med aptamer blev anvendt som positiv kontrol. Sort histogram, (umarkerede bibliotek med ubehandlede celler); rød (aptamer med ubehandlede celler); blå (umarkerede bibliotek med trypsin-behandlede celler); lilla (aptamer med trypsin-behandlede celler) og kalk (aptamer med proteinase K-behandlet). Følgende aptamerer blev vurderet; A (KDED2); B (KDED5); C (KDED10); D (KDED18); E (KDED20); F (KCHA10); G (KC2D3); H (KC2D4), I (KC2D8). Med undtagelse af KDED5 og KCHA10 som reducerede kun minimalt, det signal af alle andre reduceres betydeligt

Vi planlagt to mulige årsager:. 1) utilstrækkelig tid af protease behandling og /eller 2) target molekyler, der har andre end protein væsentlige dele, såsom carbonhydrat eller stærkt glycosyleret protein ikke er helt udsat for proteasefordøjelse. Som svar, udførte vi lang tid (30 min og 1 time) protease behandling med højere koncentrationer af proteinase K, såvel som glycosidase behandling. Stigningen i protease-koncentration, såvel som lang inkubationstid, påvirkede ikke bindingen af ​​disse to aptamerer. Desuden har inkubationen af ​​cellerne med O-bundne og N-forbundne glycosidaser efterfulgt af protease behandling ikke signifikant indflydelse på bindingen af ​​disse to aptamerer. Vi mener, at glycosidase analyser ikke kan være afgørende, da vi ikke finde litteratur til støtte for effektiviteten af ​​dette assay anvendelse af dyrkede cellelinjer i stedet for ren glycoprotein.

Udviklingen af ​​aptamerer der vil binde til målet under varierende forhold , især ved fysiologisk temperatur og i dyrkningsmedium, er vigtig. Dette vil øge fleksibiliteten, som kan vedtages og gennemføres i mange assay platforme disse aptamerer. Vi vurderede derfor bindingen af ​​aptamererne ved 37 ° C, i dyrkningsmedium, og under begge betingelser samtidig. Som vist i figur S5 (Text S1), KDED2, KDED2a, KDED2a-1 (samme aptamer, men anden sekvens længder) og KCHA10 opretholdt signifikant binding til DLD-1-celler. Signalstyrkerne var ikke signifikant forskellig fra de assays ved 4 ° C. På den anden side havde de andre aptamerer reduceret signalintensitet til DLD-1. Signalet forskel kan være et resultat af den differentielle affinitet af individuelle aptamerer. For eksempel KDED2 (bedre affinitet) og KDED15 tilhører samme familie, men KDED15 viste ikke signifikant binding ved 37 ° C. I RPMI-1640 eksperimenter, KEDE2, KDED2a og KDED2a-1 vist samme bindingsstyrke, selv når inkubationen blev udført ved 37 ° C. KDED5 og KCHA10 viste reduceret, men signifikant binding, i modsætning til de resterende aptamerer (Tekst S1, figur S6), nogle som viste næsten ingen binding. Denne observation er vigtig i den videre udvikling af aptamer-baserede assays, såsom målrettet terapi, apoptotiske og levedygtighed analyser på fysiologiske betingelser.

Diskussion

Systematisk udvikling af nukleinsyreprober for molekylær genkendelse har genereret et stort antal nyttige aptamerer til forskellige formål på forskellige områder, herunder bioteknologi, biomedicin, farmakologi, mikrobiologi og kemi. Vi har brugt celle-SELEX til at generere et panel af DNA aptamerer, der har særlig anerkendelse til tarmkræft. I denne rapport, vi brugte DLD-1 og HCT 116 som target cellelinjer, og markeringen blev udført i kulturen fad. Vi mener, at dette system er en nøjagtig gengivelse af den native tilstand af overflademarkører. I en af ​​de markeringer med DLD-1, vi introducerede negativ selektion med HCT 116 cellelinje med henblik på at udvælge et panel af aptamerer med diverse anerkendelse mønstre til tarmkræft. Traditionelt for at sikre en effektiv negativ udvælgelse, kontrol cellelinie er ofte i 5- til 10-fold overskud af målcellelinjen. Men i disse ordninger, fordi valget blev gjort i dyrkningsskålen, inkubationsbetingelserne volumener begrænset størrelse dyrkningsskålen vi kunne bruge. Derfor blev kun ca. 2 gange overskud af kontrol anvendte cellelinie. Vi forventes derfor, at forholdet mellem de positive og de negative cellelinjer var utilstrækkelig til potentielt eliminere et betydeligt antal af sekvenserne binder til de fælles markører. Men vi mener, at det gav mulighed for os at berige for aptamerer, der kan have differentierede bindende mønstre til kolorektale cancer cellelinjer.

Sekventiel binding og eluering af DNA-bibliotek pool med positive og negative celler til sidst producerede DNA beriget puljer, der potentielt binder til målet med høj fluorescenssignal intensitet, men med minimal anerkendelse til kontrollen.